CH0細(xì)胞克隆孔，重復(fù)Dot-Blot檢測，用已知濃度的純 化PTX3蛋白樣本經(jīng)序列稀釋后制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過陽性強(qiáng)度對比，評估各陽性細(xì)胞株的重 組蛋白產(chǎn)量，建立穩(wěn)定高產(chǎn)的CH0細(xì)胞克隆株。
[0037] 優(yōu)選地，所述步驟S5中純化人類PTX3重組蛋白的方法為依次采用陰離子交換法、 羥磷灰石法以及排阻色譜法純化法。
[0038] -種如權(quán)利要求1所述的人類PTX3重組蛋白在制備抗SARS的藥物組合物中的用 途。
[0039] 本發(fā)明的有益效果
[0040] 1、從人類的原代上皮細(xì)胞中提取攜帶人類PTX3蛋白信息mRNA。由于本方法mRNA 是從類型單一極其接近自然狀態(tài)人類原代上皮細(xì)胞中所提取，因而具有RNA酶活性低，RNA 提取產(chǎn)量高，純度高，無降解等優(yōu)點。保證了核苷酸序列的完整性，使反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的成 功率大大提高。
[0041] 2、將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，用氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出陽性菌 落，擴(kuò)增陽性轉(zhuǎn)化菌落，提取所述重組載體進(jìn)行特異性內(nèi)切酶消化和核苷酸測序雙重鑒定， 確保所構(gòu)建的pSG5/neo/PTX3載體正確無誤；通過先將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中培育轉(zhuǎn) 化體，以達(dá)到蓄積大量測序正確的重組表達(dá)載體pSG5/neo/PTX3的目的。
[0042] 3、通過將CH0-K1細(xì)胞中的促凋亡因子bax和bak基因敲除，建立了具有抗凋亡功 能的CH0細(xì)胞，提高了重組蛋白表達(dá)細(xì)胞持續(xù)存活時間與細(xì)胞培養(yǎng)密度，進(jìn)一步提高了重 組蛋白的產(chǎn)出率。
[0043] 4、本發(fā)明構(gòu)建了能在哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定高表達(dá)蛋白的載體，通過抗生素篩選以 及培養(yǎng)液條件的改進(jìn)，建立產(chǎn)量較高，表達(dá)穩(wěn)定，適合懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株，初選出來的細(xì)胞 株的人類PTX3重組蛋白產(chǎn)量> 50mg/L，同時，我們采用陰離子交換法、羥磷灰石法以及排 阻色譜法純化法等三種方法純化PTX3重組蛋白，使得重組蛋白回收率達(dá)到69 %，純度達(dá)到 95%〇
[0044] 5、本發(fā)明所制備的人類PTX3重組蛋白經(jīng)體外細(xì)胞測試與體內(nèi)動物模型應(yīng)用，證 明其能與SARS樣病毒結(jié)合，并抑制病毒復(fù)制，對病毒的呼吸道感染具有治療藥理價值。
【附圖說明】
[0045] 圖1:本發(fā)明的PSG5/PTX3的構(gòu)建示意圖；
[0046] 圖2 :本發(fā)明的pSG5/PTX3/neo的構(gòu)建示意圖；
[0047] 圖3 :本發(fā)明的鋅指蛋白制備及其基因敲除結(jié)構(gòu)示意圖；
[0048] 圖4 :本發(fā)明的重組蛋白PTX3純化后的Western Blot檢測結(jié)果示意圖；
[0049] 圖5 :本發(fā)明的PTX3對小鼠MHV1的親和力測定示意圖；
[0050] 圖6 :本發(fā)明的PTX3對小鼠MHV1繁殖的抑制作用的示意圖；
[0051] 圖7 :本發(fā)明的PTX3重組蛋白對病毒感染引起的肺損傷程度示意圖；
[0052] 圖8 :本發(fā)明的PTX3重組蛋白對病毒的清除作用示意圖。
【具體實施方式】
[0053] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實施。
[0054]應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0055] 本發(fā)明一種人類PTX3重組蛋白的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0056] S1、從人類的原代上皮細(xì)胞中提取攜帶PTX3蛋白翻譯信息的mRNA，設(shè)計特異性引 物，以所述mRNA為模板，合成cDNA，并在所述cDNA的兩端分別引入限制性酶切位點BamH I 和Bgl II ;
[0057]S2、用內(nèi)切酶暴露出真核細(xì)胞表達(dá)載體pSG5上的BamHI和BglII粘性末端，將 上述帶有BamHI和BglII末端的所述cDNA克隆到所述表達(dá)載體上構(gòu)建pSG5/PTX3載體， 在所述PSG5/PTX3載體中插入新霉素抗性基因，構(gòu)建重組載體pSG5/ne〇-/PTX3 ;
[0058] 在表達(dá)載體pSG5/PTX3中插入新霉素抗性基因，形成pSG5/PTX3/neo重組表達(dá)載 體，以新霉素抗性篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞。只有表達(dá)載體轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞，才能夠合 成并分泌新霉素抗性蛋白，從而幫助細(xì)胞抵抗G418的攻擊。在pSG5載體的BamHI和Bgl II這兩個酶切位點間沒有其他有用序列，酶切以后不會影響本身的功能，能夠最大限度的 保持pSG5載體的功能完整性；
[0059]S3、將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌株DH5a中，通過在補(bǔ)充有50mg/L氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培育篩選出陽性轉(zhuǎn)化菌落；小批量培養(yǎng)陽性菌落并提取載體，并用 BamHI和Bgl II對載體進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定插入片段大小，并 切膠回收，測序鑒定；鑒定無誤后，將所述重組載體轉(zhuǎn)化陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0060] S4、敲除CH0-K1細(xì)胞中Bax和Bak基因，為切除CH0-K1細(xì)胞中的促調(diào)亡基因Bak 和Bax，設(shè)計8個鋅指蛋白模炔基因，將其分成兩組，4個連接在一起構(gòu)成一個大鋅指蛋白結(jié) 構(gòu)基因，每個大鋅指蛋白結(jié)構(gòu)基因跟一個FokI核酸內(nèi)切酶基因連接。兩個FokI連接后 將基因切斷，非同源基因片段末端連接，造成CH0-K1細(xì)胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲 除。得到具有抗凋亡特性的目標(biāo)細(xì)胞并冷藏；
[0061 ] 如圖3所示，為切除CH0-K1細(xì)胞中的促調(diào)亡基因Bak和Bax，設(shè)計8個鋅指蛋白模 炔基因，將其分成兩組，4個連接在一起構(gòu)成一個大鋅指蛋白結(jié)構(gòu)基因，每個大鋅指蛋白結(jié) 構(gòu)基因跟一個FokI核酸內(nèi)切酶基因連接。兩個FokI連接后將基因切斷，非同源基因片 段末端連接，造成CH0-K1細(xì)胞中的促凋亡基因Bak和Bax的敲除。
[0062] S5、以純化并測序鑒定后的所述重組載體轉(zhuǎn)染所述目標(biāo)細(xì)胞中以得到表達(dá)細(xì)胞， 培育并篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的PTX3重組蛋白表達(dá)細(xì)胞株，從所述表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)液中富集并純 化人類PTX3重組蛋白。
[0063] 所述步驟S4中，對所述CH0-K1細(xì)胞進(jìn)行基因敲除的步驟，當(dāng)兩個鋅指蛋白核酸酶 (ZFN)切割靶位點，制造出雙鏈斷裂以后，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制被激活，DNA的非同源的末端連 接，會有70%的概率通過隨機(jī)刪減或添加可以引起移碼突變的堿基，或無義突變引起蛋白 質(zhì)長度變化，從而導(dǎo)致基因敲除，再通過細(xì)胞篩選和基因測序鑒定從而得到基因敲除細(xì)胞， 其具體敲除步驟包括：
[0064] S41、合成編碼Bak鋅指蛋白的第一基因和編碼Bax鋅指蛋白的第二基因，并分別 與非特異性核酸內(nèi)切酶FokI融合；
[0065]S42、將所述第一基因、第二基因以及所融合的非特異性核酸內(nèi)切酶FokI基因片 段一并插入帶有抗卡那霉素基因的PVAX1載體中，構(gòu)建特異性內(nèi)源性基因敲除載體；
[0066] S43、將所述特異性內(nèi)源性基因敲除載體轉(zhuǎn)入所述CH0-K1細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)染的 CH0-K1細(xì)胞表達(dá)的所述帶有非特異性核酸內(nèi)切酶FokI的Bak鋅指蛋白和Bax鋅指蛋白， 分別特異性的錨定到所述CH0-K1細(xì)胞自身的Bak和Bax基因，進(jìn)而敲除所述促凋亡因子， 得到所述目標(biāo)細(xì)胞。本發(fā)明中的Bak鋅指蛋白和Bax鋅指蛋白結(jié)合得更加緊密，不會出現(xiàn) 拋錨現(xiàn)象，酶切位點比較準(zhǔn)確，并且鋅指蛋白是偶數(shù)對。
[0067] 所述步驟S4中所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染所述重組載體之前還包括以下步驟：
[0068]S44、在轉(zhuǎn)染前7天，將所述目標(biāo)細(xì)胞用添加有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)于24孔板中；
[0069]S45、在轉(zhuǎn)染前6天至轉(zhuǎn)染前1天的期間，每天更換培養(yǎng)液的同時丟棄一半數(shù)目的 所述目標(biāo)細(xì)胞，使用由CD-CH0無血清培養(yǎng)液和含有體積分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清的F12培養(yǎng) 液組成的混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中所述混合培養(yǎng)液中的胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)每天遞減2 %，直 至為〇，在轉(zhuǎn)染前1天將所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，每孔裝有2mL的所述目標(biāo)細(xì)胞 懸浮液。
[0070]所述F12 培養(yǎng)液中添加 4. 76g/L的HEPES和 125mg/LL-glutamine。添加的 HEPES有很強(qiáng)pH值調(diào)節(jié)緩沖作用，使培養(yǎng)液的pH值能穩(wěn)定在有利于細(xì)胞生長范圍內(nèi)。 L-glutamine是左旋谷氨酰胺，在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。它是核酸堿基從頭合成的途徑的重 要原料，如果缺失就會造成細(xì)胞合成DNA的效率下降，造成細(xì)胞分裂的減少。同時，脫掉氨 基后，L-glutamine可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源，參與蛋白質(zhì)的合成。
[0071] 所述6孔板中每孔細(xì)胞數(shù)為2. 7X105個。細(xì)胞融合度約為30-40%，此時細(xì)胞量 不是太多，營養(yǎng)充分，狀態(tài)較好，為轉(zhuǎn)染的最佳時機(jī)。于轉(zhuǎn)染前3小時更換培養(yǎng)液，取純化后 重組載體5yg以磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0072] 所述步驟S5中所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染所述重組載體之后，表達(dá)細(xì)胞的篩選培育具體 步驟如下：
[0073]S51、將所述重組載體轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)液中添加 700yg/mL的G418 ;
[0074]S52、待表達(dá)細(xì)胞在含有700yg/mLG418的培養(yǎng)液中擴(kuò)增至培養(yǎng)瓶底面積的80% 時，將一瓶中的所述表達(dá)細(xì)胞均分至3瓶培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液中G418的濃度減少至200yg/ mL；
[0075]S53、待表達(dá)細(xì)胞繁殖融合至培養(yǎng)瓶底面積的50%時，將這3瓶中的細(xì)胞匯總并記 錄細(xì)胞的總數(shù)。
[0076] 所述步驟S5中篩選表達(dá)細(xì)胞具體包括以下步驟：
[0077]S54、取步驟S5-3中的經(jīng)G418選擇培養(yǎng)的陽