專利名稱：：對宮頸-陰道液體進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析從而在懷孕雌體中檢測宮內(nèi)感染或確定早產(chǎn)危險(xiǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鑒定生物液體的蛋白質(zhì)組，及其在確定母體/胎兒病癥狀態(tài)，包括胎兒來源的母體病癥、染色體非整倍性、以及與胎兒生長和成熟有關(guān)的胎兒疾病中的用途。特別地，本發(fā)明涉及對人羊水(amnioticfluid，AF)和宮頸陰道液體(cervicalvaginalfluid,CVF)的全面的蛋白質(zhì)組分析，以及將正常蛋白質(zhì)組的特征性變化與各種病理性母體/胎兒狀況相關(guān)聯(lián)，例如IAI、過早陣痛、和/或染色體缺陷。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定能被用于非侵入性診斷標(biāo)志物進(jìn)行的診斷測定。相關(guān)領(lǐng)域的描述對蛋白質(zhì)表達(dá)形式的大規(guī)模分析作為對目前DNA克隆和基因譜分析方法的重要和必需的補(bǔ)充而出現(xiàn)(PandeyandMann,Nature405:837-46(2000))。DNA序列信息在基于同源性方法推斷一些結(jié)構(gòu)上和潛在的蛋白質(zhì)修飾上是有用的，但是它不能提供通過翻譯后修飾、蛋白酶解或區(qū)室化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的信息。傳統(tǒng)的基于凝膠的方法，例如一維和二維凝膠電泳對于小規(guī)模蛋白質(zhì)檢測(<1,000個(gè)蛋白質(zhì))有用，但是這些需要大的樣本量(LilleyKS,RazzaqA,DupreeP:Two-dimensionalgelelectrophoresis:recentadvancesinsamplepreparation,detectionandquantitation.CurrOpinChemBiol.6(1):46-50.2002)?？朔@一局限性的方法包括基質(zhì)輔助的或表面增強(qiáng)的激光解吸附/電離(matrix-assistedorsurface-enhancedlaserdesorption/ionization，MALDI或SELDI)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，其能夠準(zhǔn)確地生成顯示樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量的譜(profile)。這些圖形或譜可用于鑒定和監(jiān)視各種疾病。第二個(gè)層次的鑒定來自將肽作圖與串聯(lián)質(zhì)譜分析法(tandemmassspectrometry)結(jié)合在一起，以從肽片段生成氨基酸序列信息。這可例如通過將MALDI/SELDI或ESI與四極飛行時(shí)間質(zhì)譜(Qq-TOFMS)結(jié)合而達(dá)到。后者方法還可以用于定量特定的肽(ICAT技術(shù))。病理'^母#/^乂乙炎況的^*有多種病理性母體和胎兒狀況能在妊娠期間發(fā)生并損害健康或在有些情況下威脅母親和/或胎兒或新生兒的生命，例如羊膜內(nèi)感染(intra-amnioticinfection,IAI)、先兆子癇、早產(chǎn)和過早陣痛、和染色體非整倍性。早期診斷這樣的狀況是很關(guān)鍵的，允許進(jìn)行及時(shí)的治療和介入。令人遺憾的是，早期診斷對于大多數(shù)的這些狀況而言是困難的，因?yàn)榕R床征象和癥狀發(fā)生得晚，并且常常是非特異的和反復(fù)無常的。例如，IAI的臨床癥狀典型地包括母親發(fā)燒和白細(xì)胞增多，但是這些癥狀常常出現(xiàn)較晚，并且既不敏感也不特異。因此，Gravettetal.,Am.J,Obstet.Gynecol.171:1660-7(1994)利用非人靈長類模型顯示，在用B組鏈球菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性IAI后，在感染誘導(dǎo)的過早陣痛發(fā)作的時(shí)間中只有50%出現(xiàn)發(fā)燒和白細(xì)胞增多，并且在實(shí)驗(yàn)性感染后28至40小時(shí)后才出現(xiàn)。因此，為了避免延誤診斷，批準(zhǔn)使用了高懷疑指標(biāo)和適當(dāng)運(yùn)用輔助的實(shí)驗(yàn)室4全測。通常用來診斷IAI的臨床標(biāo)準(zhǔn)包括母親發(fā)燒(>37.8。C)、以及以下中的兩種或更多種指標(biāo)母親白細(xì)胞增多(^15,000/mm3)、母親或胎兒心搏過速、子宮觸痛、羊水臭味。由于臨床特征的不一致性，也已經(jīng)使用其它輔助性實(shí)驗(yàn)室診斷來幫助診斷IAI。這些包括測量母體C-反應(yīng)蛋白、直接檢查羊水白細(xì)胞或用革蘭氏染色檢查細(xì)菌、羊水培養(yǎng)、測量羊水葡萄糖濃度、4企測羊水白細(xì)胞酯酶、通過氣液色譜法4企測細(xì)菌的有一幾酸、測量各種羊水或陰道細(xì)胞因子(例如白細(xì)胞介素2、4、6、粒細(xì)胞集落刺激因子、肺瘤壞死因子-a)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、乳鐵蛋白(lactoferrin)、和通過超聲波探測術(shù)評定胎兒活力(生物物理學(xué)語)。細(xì)胞因子或其它生物化學(xué)因子的測量是昂貴的，通常在臨床上不能得到，主要是研究工具。此外，這些試驗(yàn)的檢測效率并不總是比更容易利用的傳統(tǒng)檢測(例如羊水革蘭氏染色和培養(yǎng)，羊水葡萄糖濃度、和檢測羊水白細(xì)胞酯酶)更高。這些檢測的效率先前已經(jīng)被廣泛評論。(Ohlsson,A.andWang,E.:Ananalysisofantenatalteststodetectinfectionatpretermruptureofthemembranes.AmericanJournalofObstetricsandGynecology162:809，1990》雖然所有這些都具有一定程度的敏感性、特異性和預(yù)測價(jià)值，沒有一種能敏感或特異到能在IAI診斷中不依賴臨床特征而被使用的程度。因此，非常需要新的方法，來早期和精確診斷IAI及其他病理性母體/胎兒狀況，特別是過早陣痛和早產(chǎn)。特別需要開發(fā)新的、有效和可靠的非侵入性方法，來診斷染色體非整倍性。目前，確診染色體非整倍性需要在進(jìn)行母體血清篩選和超聲后進(jìn)行懷孕中期遺傳學(xué)羊膜穿刺術(shù)。這是侵入性過程，與0.5%的妊娠喪失風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。此外，羊水細(xì)胞的染色體分析是勞動強(qiáng)度大和耗時(shí)的過程，耗時(shí)2周。因此需要可靠的檢測法來改善從母體血清或其它生物液體檢測染色體非整倍性、降低母體篩選令人無法接受的高假陽性率、和提高羊膜穿刺術(shù)后羊水診斷的速度和效率。用超聲波探測術(shù)或傳統(tǒng)的母體血清篩選可能全然遺漏其它病理性非整倍體狀況，例如Klinefelter綜合癥和Tumer綜合癥。本發(fā)明提供非侵入的和敏感的方法，用于通過生物液體的蛋白質(zhì)組分析早期診斷、預(yù)后、和監(jiān)視病理性胎兒/母體狀況。本發(fā)明進(jìn)一步提供生物液體(例如羊水和母體血清)的蛋白質(zhì)組譜，使得能診斷、預(yù)后、和監(jiān)視各種病理性胎兒/母體狀況、包括但不限于IAI(IAI)、染色體非整倍性、和與胎兒生長和成熟有關(guān)的胎兒疾病。特別地，本發(fā)明提供IAI和染色體非整倍性的正常和病理性蛋白質(zhì)組語。正常蛋白質(zhì)組i普的確定是非常重要的，因?yàn)樗軌蚺懦蓱岩傻奶?母體狀況(負(fù)診斷)，從而無需患者接受不必要和可能危險(xiǎn)的治療或介入。本發(fā)明進(jìn)一步提供IAI和染色體非整倍性存在和狀態(tài)的特異生物標(biāo)志物，當(dāng)這樣的病理情況存在時(shí)，該生物標(biāo)記物在生物液體例如羊水或母體血清中被有區(qū)別地表達(dá)。在一方面，本發(fā)明涉及確定母體或胎兒狀況狀態(tài)的方法，包括比較從哺乳動物受試者獲得的生物液體檢測樣品的蛋白質(zhì)組語與正常樣品的發(fā)明概述蛋白質(zhì)組譜，或與包含至少一種表征這種狀況的獨(dú)特表達(dá)信號的參比蛋白質(zhì)組譜進(jìn)行比較。在本方法的具體實(shí)施方式中，所述哺乳動物受試者是懷孕的雌性生物，優(yōu)選靈長類或人。在另一具體實(shí)施方式中，所述母體狀況選自由子宮內(nèi)感染、先兆子癇和過早陣痛組成的組。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，所述胎兒狀況選自由染色體非整倍性、先天畸形、胎齡和胎兒成熟度組成的組，其中染色體非整倍性可例如是唐氏綜合癥、13三體型、18三體型、Tumer綜合癥、或Klinefelter綜合癥。任何生物液體可被用于進(jìn)行本發(fā)明的方法，包括但不限于羊水、血清、血漿、尿、腦脊髓液、母乳、粘液、和唾液，優(yōu)選羊水或母體血清。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，所述^r測樣品的蛋白質(zhì)組譜包含至少2種蛋白質(zhì)、或至少5種蛋白質(zhì)、或至少10種蛋白質(zhì)、或至少20種蛋白質(zhì)、或至少50種蛋白質(zhì)的信息。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)組語是質(zhì)譜。在另一具體實(shí)施方式中，所述質(zhì)語包含質(zhì)譜范圍在3-5kDa的至少一個(gè)獨(dú)特表達(dá)信號。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述質(zhì)語包含質(zhì)語范圍在10-12kDa的至少一個(gè)獨(dú)特表達(dá)信號。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，所述母體的狀況為IAI，所述獨(dú)特的表達(dá)信號是在檢測樣品中分子量范圍10-11kDa內(nèi)的額外的峰，其指示IAI。在一個(gè)不同的具體實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)組譜通過Western印跡分析產(chǎn)生。在另一具體實(shí)施方式中，所述生物液體是人的生物液體，所述蛋白質(zhì)組譜包括一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的表達(dá)信息巨噬細(xì)胞加帽蛋白(macrophagecappingprotein)、中性粒細(xì)月包明月交酶相關(guān)月旨質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)、fi過氧化物酵(myeloperoxidase);L-絲束蛋白(L-plastin);天青殺素(azurocidin);抗菌蛋白FALL-39(antibacterialproteinFALL-39);Gp340變體蛋白(Gp340variantprotein);Ebner唾液A泉蛋白質(zhì)類似物(Ebnersalivaryglandproteinhomologue)(GenBank登i己號355392);白細(xì)月包彈寸生蛋白酶4中制劑(leukocyteelastaseinhibitor);4丐斗立蛋白(calgranulin)A;4丐粒蛋白B;絲切蛋白(cofilin);膜突蛋白(moesin);肌動蛋白抑制蛋白(profilin)I、cronin才羊蛋白p57;膜耳關(guān)蛋白(annexin)II、纖連蛋白(fibronectin);神經(jīng)月交質(zhì)來源的連接蛋白(glia-derivednexin);抗凝血酶(antithrombin)-III;鱗狀細(xì)月包癌抗原1(squamouscellcarcinomaantigen2)、鄉(xiāng)奔狀細(xì)月包癌4元原2;絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)12;胱抑蛋白(cystatin)A;胱抑蛋白B;胱抑蛋白C;IGFBP-1;維生素D結(jié)合蛋白；載脂蛋白(apolipoprotein)A-I;14-3-3蛋白sigma;14畫3畫3蛋白zeta/delta;凝溶月交蛋白(gelsolin);乳運(yùn)4失蛋白(lactotransferrin);磷酸甘油酸激酶l;磷酸甘油酸變位酶l;和轉(zhuǎn)酮醇酶；或其片段、前體或天然存在的變體。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)組譜包括一種或多種選自下組的蛋白的表達(dá)信息巨噬細(xì)胞加帽蛋白；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、髓過氧化物酶；L-絲束蛋白；天青殺素；抗菌蛋白FALL-39;白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A;鈣粒蛋白B;肌動蛋白抑制蛋白I;神經(jīng)膠質(zhì)來源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白12;胱抑蛋白A;胱抑蛋白B;胱抑蛋白C;IGFBP-1;或其片段、前體或天然存在的變體。上述方法適合于診斷各種的胎兒和母體狀況，包括但不限于IAI、生長發(fā)育畸形，包括器官系統(tǒng)缺損、肌骨胳的畸形，和由染色體的非整倍性引起的狀況，例如唐氏綜合癥、13三體型、18三體型、Turner綜合癥或Klinefelter綜合癥。如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜與正常樣品的蛋白質(zhì)組譜基本上相同，則認(rèn)為該受試者沒有母體或胎兒狀況。如果蛋白質(zhì)組語含有與患病樣品基本上相同的獨(dú)特表達(dá)信號,該患者被診斷為具有相應(yīng)的母體或胎兒狀況。在另一方面，本發(fā)明涉及診斷IAI的方法，包含正常樣品的蛋白質(zhì)組語，或參比蛋白質(zhì)組譜，其中所述蛋白質(zhì)組語提供存在于樣品中的蛋白或其蛋白水解片段的質(zhì)量信息；以及(b)如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜顯示在3-5和/或10-12KDa分子量范圍的獨(dú)特表達(dá)信號，則診斷該哺乳動物患有IAI。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及診斷IAI的方法，包含(a)比較從懷孕雌性哺乳動物獲得的生物液體檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組譜；以及(b)如果選自下組中至少一種蛋白在檢測樣品中的表達(dá)與正常樣品有區(qū)別，則診斷該哺乳動物為IAI:IGFB-1、肌動蛋白抑制蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin)、L-絲束蛋白、和4丐粒蛋白，或其片段、前體或天然存在的變體。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式中，在檢測樣品中，IGFBP-1、肌動蛋白抑制蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、和4丐粒蛋白、或其片段、前體、或天然存在的變體中至少一個(gè)相對于正常樣品被過表達(dá)。在另一具體實(shí)施方式中，L-絲束蛋白在檢測樣品中相對于正常樣品^皮j氐表達(dá)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，IGFBP-1的存在通過鑒定圖12所示的蛋白水解片段或其片段來鑒定。在另一方面，本發(fā)明涉及診斷染色體非整倍性的方法，包含(a)比較從懷孕雌性哺乳動物獲得的生物液體檢測樣品的蛋白質(zhì)組語與正常樣品的蛋白質(zhì)組語，或參比蛋白質(zhì)組譜，其中所述蛋白質(zhì)組語提供存在于樣品中的蛋白或其蛋白水解片段的質(zhì)量信息；以及(b)如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜顯示在4-15KDa分子量范圍的獨(dú)特表達(dá)信號，則診斷該哺乳動物患有染色體非整倍性。在不同的方面，本發(fā)明涉及診斷胎兒發(fā)育缺陷的方法，包含正常樣本的蛋白質(zhì)組譜，或參比蛋白質(zhì)組譜；以及(b)如果至少一種月幾動蛋白調(diào)制蛋白(actin-modulatingprotein)或其片l殳、前體、或天然存在的變體在檢測樣品中的表達(dá)不同于在正常樣品中的表達(dá)，則證實(shí)該發(fā)育缺陷的存在。在本方法的特定的具體實(shí)施方式中，肌動蛋白調(diào)制蛋白(actin-modulatingprotein)選自由膜突蛋白、p57、凝j容月交蛋白、和14-3-3蛋白組成的組。在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及診斷母體或胎兒感染或免疫應(yīng)答相關(guān)病癥的方法，包括(a)比較從懷孕雌性哺乳動物獲得的生物液體檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜與正常樣本的蛋白質(zhì)組譜，或參比蛋白質(zhì)組譜；以及(b)如果選自下組的至少一種蛋白在檢測樣品中的表達(dá)與正常樣品不同，則證實(shí)母體或胎兒感染或免疫應(yīng)答相關(guān)病癥的存在巨噬細(xì)胞加帽蛋白(MCP)、白細(xì)胞彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、髓過氧化物酶、L-絲束蛋白、鈣粒蛋白、FALL-39、天青殺素(CAP37)、蛋白酶和蛋白酶抑制劑。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及診斷新生兒敗血癥的方法，包括在來自懷孕雌性哺乳動物的生物液體蛋白質(zhì)組語中檢測Gp-340的存在。在另一方面，本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組譜，包含一種或多種選自下組的蛋白質(zhì)的信息巨噬細(xì)胞加帽蛋白、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、髓過氧化物酶；L-絲束蛋白；天青殺素；抗菌蛋白FALL-39;Gp340變體蛋白；Ebner唾液腺蛋白類似物(GenBank登記號355392);白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A;鈣粒蛋白B;絲切蛋白；膜突蛋白；肌動蛋白抑制蛋白I、cronin樣蛋白p57;膜聯(lián)蛋白II、纖連蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)來源的連接蛋白；抗凝血酶-III;鱗狀細(xì)胞癌抗原l、鱗狀細(xì)胞癌抗原2;絲氨酸蛋白酶抑制蛋白12;胱抑蛋白A;胱抑蛋白B;胱抑蛋白C;IGFBP-1;維生素D結(jié)合蛋白；載脂蛋白A-I;14-3-3蛋白sigma;14-3-3蛋白zeta/delta;凝溶膠蛋白；乳運(yùn)鐵蛋白；磷酸甘油酸激酶l;磷酸甘油酸變位酶l;和轉(zhuǎn)酮醇酶；或其片段、前體、或天然存在的變體。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及生物液體的蛋白質(zhì)組語，所述蛋白質(zhì)組譜包括一種或多種選自下組的蛋白的信息巨噬細(xì)胞加帽蛋白；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、髓過氧化物酶；L-絲束蛋白；天青殺素；抗菌蛋白FALL-39;白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑；鈣粒蛋白A;鈣粒蛋白B;肌動蛋白抑制蛋白I，神經(jīng)膠質(zhì)來源的連接蛋白；絲氨酸蛋白酶抑制蛋白12;胱抑蛋白A和IGFBP-1;或其片段、前體或天然存在的變體。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及表征IAI的生物液體蛋白質(zhì)組譜，包含證實(shí)選自由IGFB-1、肌動蛋白抑制蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、L-絲束蛋白和《丐粒蛋白組成的組的蛋白質(zhì)存在的信息。在另一方面，本發(fā)明涉及表征IAI的生物液體蛋白質(zhì)組譜，該譜以提供存在于生物液體中的蛋白質(zhì)或其蛋白水解片段的分子量信息的形式表示，包含分子量范圍在3-5KDa和/或10-12KDa的獨(dú)特表達(dá)信號。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及基本上如圖1A-1C中任何一個(gè)所示的、或基本上如圖2A-C中任何一個(gè)所示的、或基本上如圖3A-C中任何一個(gè)所示的、或基本上如圖4A或4B所示的、或基本上如圖6-10中任何一個(gè)所示的蛋白質(zhì)組譜。在特定的具體實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)組譜以微陣列格式分析。在另一方面，本發(fā)明涉及確定懷孕雌性哺乳動物受試者中子宮內(nèi)感染存在的方法，包含(a)檢測來自該受試者的CVF樣品中兩種或更多種選自下組的蛋白質(zhì)的豐度相對于正常宮頸液體或已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738);a-l-酸性糖蛋白(Swiss-Prot登錄號P02763),表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)、和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833);和(b)如果該豐度相對于正常宮頸液體的豐度顯示統(tǒng)計(jì)上顯著差異，或者相對于已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度沒有顯示統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，則做出結(jié)論說，存在子宮內(nèi)感染。該哺乳動物受試者優(yōu)選是人。在各種具體實(shí)施方式中，檢測至少三個(gè)所列蛋白質(zhì)、或所有四個(gè)所列蛋白質(zhì)的豐度。在另一具體實(shí)施方式中，所述方法可以包括4企測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述蛋白質(zhì)選自由肌動蛋白抑制蛋白(Swiss-Prot登錄號P07737);血清白蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P2768);鉤粒蛋白B(Swiss-Prot編號P06702);和鱗狀細(xì)月包癌抗原1(Swiss-Prot登錄號P29508)組成的組。在另一具體實(shí)施方式中，檢測至少一個(gè)選自下組的額外蛋白質(zhì)的豐度a-l-抗胰蛋白酶前體(Swiss-Prot登錄號P01009);纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751);膜聯(lián)蛋白A2(Swiss-Prot登錄號P07355);維生素-D結(jié)合蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02774)。在更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，檢測至少一個(gè)選自下組的額外蛋白質(zhì)的豐度胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040);粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot登錄號Q9HC84);小的富含脯氨酸的蛋白3(smallproline-richprotein3)(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9);溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626);和血清轉(zhuǎn)4失蛋白前體(P02787)。在更進(jìn)一步具體實(shí)施方式中，才企測至少一個(gè)選自下組的額外蛋白質(zhì)的豐度胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040);粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot編號Q9HC84);小的富含脯氨酸的蛋白3(smallproline-richprotein3)(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9);溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626);和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。這種蛋白的豐度可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法確定，例如通過免疫分析、質(zhì)譜分析法、或利用蛋白陣列。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及;f全測具有過早陣痛癥狀的懷孕雌性哺乳動物受試者中早產(chǎn)可能性的方法，包含(a)檢測來自受試者的CVF樣品中兩種或更多種選自下組的蛋白質(zhì)的豐度相對于正常宮頸液體或已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738);a-l-酸性糖蛋白(SwissProt編號P02763);表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)、和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833);和(b)如果該豐度相對于正常宮頸液體的豐度顯示統(tǒng)計(jì)上顯著差異，或者相對于已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度沒有顯示統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，則預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。正如早先的方面一才羊，該方法可以包括"險(xiǎn)測一種或多種例如上面所列的那些額外的蛋白。在更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，如果不能基于如上所述進(jìn)行的檢驗(yàn)法預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生，則更進(jìn)一步^^測受試者中纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)的豐度，其中如果這種豐度相對于正常宮頸液體中的豐度統(tǒng)計(jì)上顯著的差異，則預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式中，在步驟(a)之前確定纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)的豐度。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含抗體和試劑的免疫分析試劑盒，用于檢測兩種或更多種選自下組的蛋白質(zhì)觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738);a-l-酸性糖蛋白(SwissProt編號P02763);表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)、和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833);和在一個(gè)具體實(shí)施方式中，上述免疫分析試劑盒另外包含抗體和試劑，用于檢測至少一個(gè)選自下組的蛋白肌動蛋白抑制蛋白-1(Swiss-Prot登錄號P07737);血清白蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P2768);4丐粒蛋白B(Swiss-Prot登錄號P06702);鱗狀細(xì)胞癌抗原l(Swiss-Prot登錄號P29508);a-l-抗胰蛋白酶前體(Swiss-Prot登錄號P01009);纖連蛋白前體(SwissProt編號P02751);膜聯(lián)蛋白A2(Swiss-Prot登錄號P07355);維生素-D結(jié)合蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02774);胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040);粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot登錄號Q9HC84);小的富含脯氨酸豐富的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9);溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626);和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787);胱抑蛋白A(Swiss-Prot編號P01040);粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot編號Q9HC84);小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9);溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626);和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。附圖簡述^岸的蛋^^這。在化學(xué)確定的正常相芯片陣列上固定的羊水提取物的SELDI-TOF分析。A)在激光強(qiáng)度為235時(shí)收集的完整語顯示峰強(qiáng)度的差異。B)語細(xì)節(jié)顯示對照和感染樣品在10至12KDa區(qū)域的差異。C)譜細(xì)節(jié)顯示對照和感染在3-5KDa區(qū)域的差異。實(shí)線顯示顯著表達(dá)差異(獨(dú)特表達(dá)信號)，其可用于開發(fā)診斷性試驗(yàn)。廚Z4-C。義長類羊水響^J染fGB》的好程為V^f。在接種細(xì)菌以前收集羊水，并在感染后連續(xù)地收集羊水，如下所述對羊水進(jìn)行SELDI-TOF分析。圖2A:感染前；2B:感染后12小時(shí)；2C:感染后36小時(shí)。潭3iC。乂羊水哞感染^,的U^的蛋冷襲id;。在化學(xué)確定的正常相芯片陣列上固定的羊水提取物的SELDI-TOF分析。A)在激光強(qiáng)度為235時(shí)收集的完整譜顯示峰強(qiáng)度的差異。B)譜細(xì)節(jié)顯示對照和感染樣品在IO至12KDa區(qū)域的差異。C)鐠細(xì)節(jié)顯示對照和感染在3-5KDa區(qū)域的差異。D)在對照和感染之間有區(qū)別的、基于峰強(qiáng)度的簇。圖4A和4B。人羊水在普通的MALDI-TOF質(zhì)譜儀上獲得的質(zhì)譜，所述人為A)對照，無子宮內(nèi)感染，和B)樣品，有子宮內(nèi)感染。塔5.SDS-ZMG五孝馬身，藍(lán)染逸W凝履。A)4份對照人羊水樣品合并；B)單個(gè)對照羊水樣品；C)4份感染的人羊水樣品合并；D)單個(gè)感染的羊水樣品。感6.在人羊水中檢測有差異的蛋白表達(dá)。A)對照羊水樣品(合并的)；B)感染的羊水樣品(合并的)。慰7.在人羊水中檢測有差異的蛋白表達(dá)。A)對照羊水樣品(合并的)；B)感染的羊水樣品(合并的)。^《顯示在人羊水和母體血清中檢測有差異的蛋白表達(dá)。A)對照樣品(合并的)；B)感染的樣品(合并的)。塔^M^^/^7蛋^萍/{/^##^清^^^化蛋^4這。l)蛋白陣列的偽彩色成像，顯示相應(yīng)蛋白與它們的抗體的結(jié)合；2)放大的陣列區(qū)域；3)4丐粒蛋白IP的Western印跡。^川顯示母體血清中的差異化蛋白表達(dá)模式有獨(dú)特的變化譜可以區(qū)另'J三體(trisomies)。^7人示意羊水蛋白的從頭序列鑒定。PR01—HUMAN(P07737)肌動蛋白抑制蛋白I(SEQIDNos:5-11)。/GF5尸-7資冷的^興#定和齊^術(shù)游,度的淨(jìng)/{/(5^2化>7V(9.'7入在樣品0426se—HI—12和0425se—HI—13中用Ms/MS發(fā)現(xiàn)的肽序列用小寫字母顯示。(SEQIDNo:2和3)。它們是通過將感染的羊水在一維凝膠上電泳，將泳帶用胰蛋白酶消化，進(jìn)行MS/MS分析而得到的。來自感染的羊水、并經(jīng)胰蛋白酶消化的10.5-12KDa條帶，經(jīng)過一維凝膠(低分子量范圍，圖5)、Western印跡(圖6)和MS/MS分析(圖13),4全測到的IGF-BP-1蛋白水解片段表示為帶有下劃線的序列的區(qū)域(SEQIDNO:4)。^/3。來自感染的羊水、并經(jīng)胰蛋白酶消化的10.5-11kD—維凝膠條帶的LCQ-MS語。LCQ-MS顯示能代表該樣品中潛在蛋白(potentialproteins)的母離子(parention)。恩74。圖13中17.55-18.21分鐘滯留時(shí)間所在峰的質(zhì)譜。慰i5。圖14中434.9峰的母離子的MS/MS譜。^M。所有樣品(16a-I)的LC/MS/MS鐠用圖16b所示生物信息學(xué)工作流程進(jìn)行處理。將各個(gè)不同樣品的蛋白命中結(jié)果(16a-II)組合成蛋白綜合列表(16a-ni)。將綜合列表中被命中至少三個(gè)獨(dú)特肽的所有蛋白不經(jīng)手工證實(shí)而收入表4(16a-IV)。將綜合列表中被命中最多兩個(gè)獨(dú)特肽的那些蛋白用方法章節(jié)所述規(guī)則進(jìn)行手工證實(shí)(16a-IV)。將所有被命中兩個(gè)獨(dú)特肽、并得到手工證實(shí)的蛋白加到表4中(16a-IV)。將被命中單個(gè)肽、并通過手工證實(shí)的蛋白加入表5(16a-IV)。圖16b顯示鑒定蛋白和肽所用的生物信息學(xué)工作流程。在樣品的LC/MS/MSi普中扣除同位素譜(deisotoped),并標(biāo)出質(zhì)量中心所在(centrioded)(16b-I)。預(yù)處理過的MS/MS譜在聯(lián)合蛋白數(shù)據(jù)庫(參見方法章節(jié))中用TurboSequest(ThermoFinnigan,Waltham，MA)，X！Tandem(Fenyo,D.;etal.,AnalChem2003，75，(4)，768-74)、和OpenSeaSearle,B.C.，etal.，AnalChem2004,76,附2220-30;Searle，B.C.eta.，JProteomeRes2005，4,(2),546-54.)進(jìn)行搜索，從而鑒定出該樣品中的肽和蛋白。經(jīng)所有三個(gè)程序都被命中的肽和蛋白用Scaffold軟件(ProteomeSoftware,Portland,OR)匯總。^〃.在SCX級分中鑒定出的獨(dú)特肽的數(shù)目分配。人CVF2D-LC樣品每一級分中鑒定出的獨(dú)特肽的總數(shù)顯示了該技術(shù)相對于基于凝膠的傳統(tǒng)電泳技術(shù)的優(yōu)勢。^7S.不同搜索引擎的語和蛋白命中結(jié)果的重疊。(A)從人CVF2D-LC實(shí)驗(yàn)得到的總共9,507個(gè)MS/MS譜用Sequest,X!Tandem和OpenSea搜索引擎進(jìn)行搜索。當(dāng)使用三個(gè)獨(dú)立的搜索引擎時(shí)，該樣品中共有5601個(gè)(59。/。)MS/MS語與按照命中兩個(gè)獨(dú)特肽的標(biāo)準(zhǔn)撿出的蛋白相吻合。(按照上述標(biāo)準(zhǔn))鑒定出的譜在不同搜索引擎之間的百分比分配表明，利用多個(gè)相互獨(dú)立的搜索引擎在樣品中鑒定出更多MS/MS譜。(B)當(dāng)單份人CVF2D-LC樣品的MS/MS語用所有三個(gè)搜索引擎來分析時(shí)，共鑒定出118種候選蛋白。候選蛋白在三個(gè)搜索引擎之間的命中率分配情況表明，利用多個(gè)獨(dú)立的搜索引擎鑒定出更多蛋白。廚79.生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(biologicalreplicates)中的蛋白ID分布。該文氏圖(Venndiagram)顯示，經(jīng)過2D-LC分析的CVF生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間蛋白鑒定結(jié)果的分布。在總共147種被鑒定出的蛋白當(dāng)中，102種蛋白在兩種樣品中都存在，45種蛋白僅在其中一種樣品中存在。^20。在不同分析法中的蛋白鑒定結(jié)果分布。在所述分析中加入生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)性重復(fù)實(shí)驗(yàn)，蛋白命中率增加。在總共150種蛋白當(dāng)中，62種蛋白被1DGE和2D-LC兩種技術(shù)測出，85種僅被2D-LC測出，3種(都至少命中2個(gè)獨(dú)特肽)僅被1DGE測出。^Z。人CVF中蛋白被胰蛋白酶消化的肽譜。CVF中蛋白的胰蛋白酶消化的肽譜顯示，超過89%的命中結(jié)果至少命中兩個(gè)獨(dú)特肽；但也在CVF中鑒定到具有寬范圍的胰酶化肽產(chǎn)出的蛋白。^^。人CVF蛋白質(zhì)組的功能分類。利用在DAVID生物信息學(xué)資源DennisG.，Jr.etal.，GenomeBiol20034,P3.上可以得到的功能性分類工具，進(jìn)行人CVF蛋白的功能注釋。在總共150種被命中的蛋白中，32%涉及新陳代謝，22%涉及免疫應(yīng)答，11%涉及細(xì)胞分化，9%涉及轉(zhuǎn)運(yùn)，8%涉及細(xì)胞組織(cellorganization),6%涉及酶調(diào)節(jié)，3%涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，3%涉及細(xì)胞增殖。6%的被命中蛋白在DAVID數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的功能注釋。^2X4-S。在CVF中表達(dá)的蛋白的功能注釋和細(xì)胞定位。205種利用MudPIT和基于凝膠的分級分離鑒定出的蛋白用基因腫瘤學(xué)術(shù)語(GOterms)在注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID,版本2.0,NIAID)中分析?？偟鞍字杏?%不顯示任何已知的功能注釋。圖24A-B。在非人靈長類CVF和羊水樣品中，受細(xì)小脲支原體(t/rea//asma/arvmw)誘導(dǎo)的差異化蛋白水平的基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF-MS)蛋白譜。10.8-kDa峰的語可見于(A)實(shí)驗(yàn)性IAI之前和(B)實(shí)驗(yàn)性IAI之后獲得的對照樣品中。3-5kDaMW的肽的譜可見于(C)在實(shí)驗(yàn)性IAI之前獲得的對照樣品和(D)在實(shí)驗(yàn)性IAI之后獲得的樣品中。對語進(jìn)行基線扣除(baselinesubtraction)和Savitsky-Golay平滑處理，以10Da/通道(channel)進(jìn)行5次循環(huán)。3000-2000m/z的語用箭頭表示，說明是在對照和感染之間有差異化表達(dá)的峰。^725。IAICVF生物標(biāo)志物的免疫檢測。觸珠蛋白，未調(diào)節(jié)的對照標(biāo)記物。IGFBP-l條帶代表完整的蛋白(-SOkDa)和蛋白水解片段(l9kDa)。圖26。過早陣痛(PTL)、早產(chǎn)(PTB)、和對照CVF樣品的二維差示性凝膠內(nèi)電泳分析。A.早產(chǎn)(綠)和對照(紅色)的重疊，(B)過早陣痛(綠)和對照(紅色)，以及(C)PTB(綠)和過早陣痛(紅色)。D.早產(chǎn)和過早陣痛之間豐度有差異的蛋白的作圖。(D)圖C的差示性點(diǎn)圖。用綠色畫輪廓的點(diǎn)代表早產(chǎn)中比過早陣痛中高>2倍，用紅色畫輪廓的點(diǎn)代表早產(chǎn)比過早陣痛低>2倍。用PhoretixEvolution生成該點(diǎn)圖。所鑒定的蛋白在表9中編號和顯示。圖27。人CVF中自發(fā)早產(chǎn)的生物標(biāo)志物的免疫4全測。每一樣品組取50嗎CVF蛋白用特異性抗體進(jìn)行印跡和探測。IGFBP-1條帶代表完整的蛋白(30kDa)和蛋白水解片段(-16和~11kDa)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述I.定義除非有其它限定，否則在此使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的意義。Singletonetal.，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中所使用的術(shù)語的一般性指導(dǎo)。術(shù)語"蛋白質(zhì)組"在此用來描述某一給定時(shí)間在生物樣品中的蛋白質(zhì)的主要部分。蛋白質(zhì)組的概念從根本上不同于基因組。基因組實(shí)際上是靜態(tài)的，而蛋白質(zhì)組則響應(yīng)內(nèi)部和外部事件而不斷變化。術(shù)語"蛋白質(zhì)組語"用來指對一個(gè)生物樣品中(例如某一時(shí)間的生物液體中)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的代表。蛋白質(zhì)組譜可以例如表示為質(zhì)譜，式。因此蛋白質(zhì)組語可以例如以蛋白質(zhì)在電泳性質(zhì)上的差異為基礎(chǔ)，如通過二維;疑力交電泳所測定的，例如通過二維PAGE,并且可以例如作為二維電泳凝膠中的多個(gè)斑點(diǎn)而表征。有差異的表達(dá)譜也許具有重要的診斷價(jià)值，即使缺乏特異性鑒定的蛋白質(zhì)時(shí)也是如此。然后可例如通過免疫印跡^^測單個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)微陣列檢測多個(gè)斑點(diǎn)或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組語典型地代表或含有從幾個(gè)峰到代表50個(gè)或更多個(gè)峰的復(fù)雜譜的信息。因此，例如，蛋白質(zhì)組譜可以含有或代表至少2個(gè)、或至少5個(gè)或至少10個(gè)或至少15個(gè)、或至少20個(gè)、或至少25個(gè)、或至少30個(gè)、或至少35個(gè)、或至少40個(gè)、或至少45個(gè)、或至少50個(gè)、或至少60個(gè)、或至少65個(gè)、或至少70個(gè)、或至少75個(gè)、或至少80個(gè)、或至少85個(gè)、或至少85個(gè)、或至少90個(gè)、或至少95個(gè)、或至少100個(gè)、或至少125個(gè)、或至少150個(gè)、或至少175個(gè)、或至少200個(gè)蛋白質(zhì)。術(shù)語"病理狀況"以最廣義^皮z使用，包括損害受試者^:康的所有變化和現(xiàn)象。病理性母體的狀況包括但不限于IAI、胎兒或母體來源的狀況，例如先兆子癇、和過早陣痛和早產(chǎn)。病理性胎兒狀況包括但不限于染色體缺陷(非整倍性)，例如唐氏綜合癥，以及所有在胎齡和胎兒成熟度上的異常。術(shù)語"(母體或胎兒)病理性狀況的狀態(tài)"在此以最廣義^^吏用，指病理情況不存在、存在、程度、階段、性質(zhì)、進(jìn)展或消退。術(shù)語"獨(dú)特表達(dá)信號"用來描述生物樣品(例如參考樣品)蛋白質(zhì)組譜中的獨(dú)特特性或圖式，其以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式不同于相應(yīng)的正常生物樣品(來自相同類型的來源，例如生物液體)的蛋白質(zhì)組譜。術(shù)語"羊膜內(nèi)感染(IAI)"、"羊水感染"、"羊膜炎"和"臨床絨毛膜羊膜炎，，可交互使用，指的是妊娠期間羊水和子宮內(nèi)容物急性感染，包括而不局限于細(xì)菌感染。"患者響應(yīng)，，可以利用任何指示對患者有利的終點(diǎn)來評價(jià)，包括但不限于，(l)至少在某種程度上抑制病理情況的進(jìn)展，(2)病理狀況的預(yù)防，(3)至少在某種程度上緩減與病理狀況有關(guān)的一種或多種癥狀；(4)延長治療后的存活期；和/或(5)降低治療后在一個(gè)給定時(shí)間點(diǎn)的死亡率。術(shù)語"治療"既指治療性治療也指預(yù)防性或預(yù)防性措施，其中目經(jīng)患有該病癥的人，以及那些有該病癥傾向的人，或那些應(yīng)該在他們中防止該病癥的人。"先天畸形"是非遺傳的、但是出生時(shí)即存在的異常。在此使用的任何特定的蛋白質(zhì)變體的名稱，包括所有片段、前體、和天然存在的變體，例如可變剪接的和等位變體和同等型，以及指定蛋在的變體)。因此，例如，當(dāng)聲稱檢測觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738)的豐度時(shí)，該陳述特定地包括檢測在(Swiss-Prot登錄號P00738下所列的蛋白質(zhì)的任何片段、前體、或天然存在的變體，而且如果受試者不是人的話，它的非人同源物和天然存在的變體。II.i羊細(xì)i兌明本發(fā)明涉及基于母親或胎兒的生物液體蛋白質(zhì)組語早期、可靠和非侵入性檢測母體和胎兒狀況的方法和手段。本發(fā)明利用本領(lǐng)域已熟知的蛋白質(zhì)組技術(shù)，如例如在下面的教科書中所描述的，其內(nèi)容以此特意地通過參考合并入本文二ProteomeResearch:NewFrontiersinFunctionalGenomics(PrinciplesandPractice),M.R.Wilkinsetal.，eds.，SpringerVerlag,1007;2-DProteomeAnalysisProtocols,AndrewLLink,editor,HumanaPress1999;ProteomeResearch:Two-DimensionalGelElectrophoresisandIdentificationMethods(PrinciplesandPractice),T.Rabilloudeditor,SpringerVerlag,2000;ProteomeResearch:MassSpectrometry(PrinciplesandPractice),P.Jameseditor:SpringerVerlag,2001;IntroductiontoProteomics,D.C.Lieblereditor,HumanaPress,2002;ProteomicsinPractice:ALaboratoryManualofProteomeAnalysis,R.Westermeieretal"eds.,JohnWiley&Sons,2002.本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到許多類似或等同于在此描述的方法和材料的那些方法和材料，其可用于實(shí)施本發(fā)明。當(dāng)然，本發(fā)明決不限于所描述的方法和才才:纖。1.#定蘭務(wù)濕#^《這的蛋冷^和/i根據(jù)本發(fā)明，生物液體的蛋白質(zhì)組分析可以利用本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)4亍。典型地，比較來自不同來源的樣品(例如正常的生物液體(正常樣本)和檢測生物液體(試驗(yàn)樣品))的蛋白質(zhì)模式(蛋白質(zhì)組圖語)，以檢測在疾病中被上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可隨后被切下來用于鑒定和充分表征，例如利用肽質(zhì)量指紋技術(shù)和/或質(zhì)譜分析法和測序方法，或者正常的和/或疾病特異的蛋白質(zhì)組圖譜能被用于直接診斷所關(guān)心的疾病，或證實(shí)疾病存在或不存在。在比較性分析中，重要的是以完全一樣的方式處理正常的和試驗(yàn)樣品，以正確代表蛋白質(zhì)的相對豐度和獲得精確結(jié)果。所需要的總蛋白量取決于使用的分析技術(shù)，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易地確定。存在于生物樣品中的蛋白質(zhì)典型地通過二維凝膠電泳(2-DE)依照它們的pI和分子量分離。蛋白質(zhì)首先通過它們的電荷利用等電聚焦(1DGE)分離。這一步驟可以例如利用固定化的pH梯度(IPG)條(其可以從市場上買到)來進(jìn)行。第二個(gè)維度是正常SDS-PAGE分析，其中聚焦的IPG條被用作樣品。二維電泳分離后，蛋白質(zhì)可以用傳統(tǒng)的染料顯形，如考馬斯藍(lán)或銀染，并利用已知的技術(shù)和設(shè)備成像，例如Bio-RadGS800比重計(jì)和PDQUEST軟件，兩者都可以在市場上買到。單個(gè)點(diǎn)然后從凝膠上切下來，脫色，并進(jìn)行胰蛋白酶消化。肽混合物通過質(zhì)譜(MS)分析?；蛘?，肽可以例如通過毛細(xì)管高壓液相色譜法(HPLC)分離，并且可以通過MS，或者個(gè)別地、或者合并在一起加以分析。質(zhì)譜儀由離子源、質(zhì)量分析器、離子^r測器和數(shù)據(jù)獲取裝置組成。首先，肽在離子源中被電離。然后，被電離的肽依照它們的質(zhì)荷比在質(zhì)量分析器上分離，分離的離子被檢測。質(zhì)譜分析法被廣泛用于蛋白質(zhì)分析，特別是自從發(fā)明了基質(zhì)輔助激光解吸附電離/飛行時(shí)間(MALDI-TOF)和電噴射電離作用(ESI)方法以后。有若干種質(zhì)量分析器，包括例如MALDI-TOF和三極或四極-TOF、或偶聯(lián)于ESI的離子阱質(zhì)量分析器。因此，例如，Q-Tof-2質(zhì)譜儀利用垂直飛行時(shí)間分析器，其允許在整個(gè)質(zhì)語范圍同時(shí)檢測離子。有關(guān)詳細(xì)情形參見例如Chemusevichetal.,J.MassSpectrom.36:849-865(2001)。如果需要的話，肽片段的氨基酸序列、以及最終該肽片段所來源的蛋白質(zhì)可以通過現(xiàn)有技術(shù)已知的技術(shù)來確定，例如質(zhì)譜分析法的某些變化或Edman降解作用。2.憂Jf于早^和#侵入##錄的7^乂6母謬炎況巡IAI(IAI)是妊娠期間羊水和子宮內(nèi)容物的急性細(xì)菌感染。前瞻性研究顯示IAI發(fā)生在所有分娩當(dāng)中的4%至10%(Newton,E.R.,Prihoda,T丄，andGibbs，R.S.:Logisticregressionanalysisofriskfactorsforintra-amnioticinfection.Obstet.Gynecol.73:571,1989;Soper,D.E.，Mayhall,C.G.，andDalton，H.P.:Riskfactorsforintraamnioticinfection:aprospectiveepidemicologicstudy.AmericanJournalofObstetricsandGynecology161:562，1989;andLopez-Zeno,J.A.，Peaceman,A.M.，Adashek，J.A.,andSocol,M.L.:Acontrolledtrialofaprogramfortheactivemanagementoflabor.N.Engl丄Med.326:450，1992)。用于描述IAI的其它術(shù)語包括羊水感染、羊膜炎和臨床絨毛膜羊膜炎。IAI臨床上通過母親發(fā)燒、子宮觸痛、白細(xì)胞增多、和胎兒心動過速診斷，應(yīng)該與組織學(xué)的絨毛膜羊膜炎區(qū)別開。IAI是母親和新生兒發(fā)病的重要原因。IAI導(dǎo)致圍產(chǎn)期10-40。/。的發(fā)熱性致病病例，與20-40%的早期新生兒敗血癥和月申炎病例相聯(lián)系(Newton,E.R.:Chorioamnionitisandintraamnioticinfection.Clin.Obstet.Gynecol.36:795,1993)。母體敗血癥發(fā)生在2-6%的患有IAI的患者中，提高了產(chǎn)后感染的致病率。在患有IAI的患者當(dāng)中不正常分娩(dysfunctionallabor)和剖腹產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)也提高。Duffetal.報(bào)導(dǎo)，在發(fā)生IAI并有陣痛的患者當(dāng)中，不正常分娩發(fā)生率為75%,剖腹產(chǎn)發(fā)生率為34。/。(Duff，P.,Sanders,R.，andGibbs，R.S.:Thecourseoflaborintermpregnancieswithchorioamnionitis.AmericanJournalofObstetricsandGynecology147:391，1983)。IAI也與新生兒發(fā)病率和死亡率提高有關(guān)，特別在早產(chǎn)新生兒當(dāng)中。通常，患IAI的母親所生的低出生重量新生兒中，圍產(chǎn)期死亡率增加三至四倍(Gibbs，R.S.，Castillo,M.A.，andRodgers,P丄ManagementofAcuteChorioamnionitis.AmericanJournalofObstetricsandGynecology136:709，1980;Gilstrap，L.C.,IIILeveno,K丄，Cox,S.M.，Burris，J.S.,Mashburn,M.,andRosenfdd,C.R.:Intrapartumtreatmentofacutechorioamnionitis:impactonneonatalsepsis.Am.J.Obstet.Gynecol.159:579,1988)。呼吸窘迫綜合4正、月鹵室內(nèi)出血、和新生兒敗血癥的發(fā)生也增力口(W丄Theeffectofchorioamnionitisonthedevelopmentaloutcomeofpreterminfantsatoneyear.ObstetricsandGynecology70:183，1987)。最近，也報(bào)道IAI涉及新生兒腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricularleukomalacia)和大腦性麻痹；大腦白質(zhì)損害和大腦性麻痹的風(fēng)險(xiǎn)在IAI的背景下要高九倍(Bejar,R.Wozniak，P.,Allard,M.,Benirschke,K.,Vaucher，Y.，Coen,R.,Berry，C.，Schragg,P.,Villegas,I.，andResnik,R.:Antenataloriginofneurologicdamageinnewborninfants.I.Preterminfants.Am.J.Obstet.Gynecol.159:357,1988;Grether,J.K.andNelson,K.B.:Maternalinfectionandcerebralpalsyininfantsofnormalbirthweight.JAMA278:207,1997)。最后，在至少10%的完整胎膜過早陣痛婦女中發(fā)現(xiàn)臨床癥狀不明顯的IAI,提示IAI是早產(chǎn)的一個(gè)重要的、可能可預(yù)防的早產(chǎn)原因(Romero,R.,Avila,C.,Brekus,C.A.,andMorotti,R.:Theroleofsystemicandintrauterineinfectioninpretermparturition.AnnualsoftheNewYorkAcademyofSciences622:355,1991)。Newton所做的文獻(xiàn)述評顯示，臨床IA1的發(fā)生率在胎齡小于27周時(shí)為41%,在胎齡27-37周時(shí)為15%,在妊娠38周或更長時(shí)為2%(Newtonetal.,見上)。在所有過早陣痛、胎膜完整、但沒有IAI的臨床征象的婦女當(dāng)中，有10-20。/o的婦女的羊水中也回收到下生殖道固有的細(xì)菌(Romeroetal.，見上)，高達(dá)67。/。的過早陣痛的婦女妊娠終止于23-24周(Watts,D.H.，Krohn,M.A.,Hillier,S.L.,andEschenbach,D.A.:Theassociationofoccultamnioticfluidinfectionwithgestationalageandneonataloutcomeamongwomeninpretermlabor.ObstetGynecol79:351,1992)。大多數(shù)這些患者快速分娩，在許多患者中發(fā)生臨床上明顯的IAI。這些觀察支持如下假設(shè)，即上行的、最初臨床癥狀不明顯的子宮內(nèi)感染先于過早陣痛發(fā)生，并且可能是極端早產(chǎn)的一個(gè)重要原因。先兆子癇先兆子癇，定義為母體高血壓伴隨蛋白尿、浮腫或兩者，發(fā)生在7%的沒有于妊娠前三個(gè)月終止的妊娠中。雖然原因未知，它在極端年齡分4免(extremesofageinchildbearing)、母親糖尿病、多次妊娠、以及先前就已經(jīng)存在的母體腎病和/或高血壓中更常見。先兆子癇與圍產(chǎn)期死亡率增加相聯(lián)系，并且可能也導(dǎo)致驚厥，其特征在于母親癲癇發(fā)作以及產(chǎn)婦死亡率提高。目前先兆子癇的支柱治療是分娩和用硫酸鎂進(jìn)行抗驚厥預(yù)防。在硫酸鎂治療出現(xiàn)之前，所觀察到的產(chǎn)婦死亡率為20-30%。然而，隨著迅速診斷、用硫酸鎂抗驚厥治療、抗高血壓、和分娩，產(chǎn)婦死亡率已經(jīng)降低到接近零。令人遺憾的是，基于一般所能識別的癥狀和體征診斷先兆子癇常常很困難，并且在疾病過程的晚期才發(fā)生。常常胎兒生長或健康受損害是先兆子癇最初能識別出的表現(xiàn)。先兆子癇的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記物包括蛋白尿定量和血清尿酸或肌酸酐濃度升高。目前沒有可用的早期先兆子癇血清標(biāo)記物，或者能鑒定哪個(gè)婦女會發(fā)生先兆子癇的標(biāo)記物。近來，在一項(xiàng)研究中，有希望的血清標(biāo)記物(包括瘦蛋白和尿酸)已經(jīng)與隨后的先兆子癇聯(lián)系起來(GursoyT,etal.Preeclampsiadisruptsthenormalphysiologyofleptin.:AmJPerinatol.19(6):303-10,2002)，但是還需要很多的工作來證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。開發(fā)早期和可靠急迫的，過早陣痛和早產(chǎn)2)定義為在37周完整妊娠之前出生。在美國，在所有活產(chǎn)當(dāng)中早產(chǎn)的發(fā)生率為10-11%,盡管積極治療過早陣痛，該發(fā)生率還在提高。總體上來說，早產(chǎn)及其結(jié)果導(dǎo)致不歸因于先天畸形的圍產(chǎn)期死亡的80%，每年添加大約$50億國家衛(wèi)生保健預(yù)算。早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素包括非白種人、年輕、低社會經(jīng)濟(jì)地位、母親重量不到55kg、未產(chǎn)婦、妊娠前三個(gè)月流血、多次妊娠(MeisPJ，MichielutteR,PetersTJ，etal.FactorsassociatedwithpretermbirthinCardiff,Wales:11.Indicatedandspontaneouspretermbirth.AmJObstetGynecol173:597-602，1995)。令人遺憾的是，預(yù)測患者自發(fā)早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)通常令人失望(CreasyRK,lamsJD.Pretermlaboranddelivery.InMaternal-FetalMedicine,CreasyRK,ResnikR(eds.).W.B.SaundersCompany,Philadelphia,PA4thedition,1999.Pages498-531)。先前確定最大早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)、以及從而可能受益于早期介入的群體的努力包括風(fēng)險(xiǎn)記分指數(shù)、宮頸胎兒纖連蛋白的生物化學(xué)檢測、宮頸長度的超聲測量、和在家子宮活力監(jiān)視。這些方案既昂貴，而且也因?yàn)椴荒軠?zhǔn)確地預(yù)測哪個(gè)患者能受益于早期介入或預(yù)防而受到妨礙。所有方法都受到陽性預(yù)測值低(大約30%)的困擾，大多數(shù)患者都鑒定為足月分娩"有風(fēng)險(xiǎn)"。介入治療是有效的，包括藥理學(xué)的治療以抑制子宮收縮，但是取決于過早陣痛的早期和可靠的診斷。因此需要早期和可靠的標(biāo)志物來鑒定有最大的早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的患者，來降低巨大的代價(jià)和與早產(chǎn)有關(guān)的新生兒死亡和發(fā)病。染色體非整倍性染色體異常是圍產(chǎn)期發(fā)病和死亡的經(jīng)常原因。染色體異常的發(fā)生率為200個(gè)活產(chǎn)中有1個(gè)。這些異常的主要原因是非整倍性，從父母繼承下來的染色體的數(shù)目異常。最時(shí)常發(fā)生的染色體非整倍性是21三體型(唐氏綜合癥)，其在800個(gè)活產(chǎn)中有l(wèi)個(gè)發(fā)生(HookEB,HamertonJL:Thefrequencyofchromosomeabnormalitiesdetectedinconsecutivenewbornstudies:Differencesbetweenstudies:Resultsbysexandbyseverityofphenotypicinvolvement.InHookEB,PorterIH(eds):PopulationCytogenetics,pp63-79,NewYork,AcademicPress,1978)。21三體型的主要風(fēng)險(xiǎn)因子是母親年齡大于35，但是80%的具有21三體型的孩子是小于35歲的婦女所生。其它常見的非整倍體狀況包括l3和18三體型、Tumer綜合癥和Klinefelter綜合癥。因?yàn)?0%的21三體型孩子是小于35歲的婦女所生，僅僅基于母親年齡而設(shè)計(jì)的產(chǎn)前診斷篩選程序是徒勞的。因此，出生前篩選方案還補(bǔ)充有母親血清篩選與胎兒染色體非整倍性有關(guān)的分析物、超聲、或兩者相結(jié)合法。已經(jīng)廣泛使用的候選血清標(biāo)記物包括曱胎蛋白(AFP)、非結(jié)合的雌三醇、人絨毛膜促性腺激素(hHCG)和抑制素(inhibin)-A。然而，由于篩選的陽性率僅為2-5%,21三體型及其他非整倍性的檢出率令人失望，檢出率僅僅70-86%(CuckleH.BiochemicalscreeningforDownsyndrome.EurJObstetGynecolReprodBiol.92(1):97-101,2000)。此外，真陽性檢測率，即篩選陽性檢測中的21三體型僅僅為1-2%,導(dǎo)致總假陽性率超過98%。母親血清篩選和超聲后確診染色體非整倍性需要在妊娠前三個(gè)月的中期進(jìn)行遺傳學(xué)羊膜穿刺術(shù)。這是侵入性過程，與0.5%的妊娠喪失風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。此外，羊水細(xì)胞的染色體分析是勞動強(qiáng)度大和耗時(shí)的過程，耗時(shí)2周。因此需要可靠的檢測法來從母體血清檢測染色體非整倍性、降低母體篩選令人無法接受的高假陽性率、和提高羊膜穿刺術(shù)后羊水診斷的速度和效率。■5.,/^^#濕#的蛋冷1邀潘診浙#者/#乂乙炎況本發(fā)明提供早期和可靠的、非侵入方法，用于通過生物液體的蛋白質(zhì)組分析，例如羊水、血清、血漿、CVF(CVF)、尿、腦脊髓液、母乳、粘液、或唾液，診斷上述及其他類似的母親/胎兒狀況。如同之前所述的，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"蛋白質(zhì)組語"用來指生物樣品中多個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的代表，例如在某一給定時(shí)間的生物液體。蛋白質(zhì)組鐠可以例如表示為質(zhì)語，但是也包括基于這些蛋白質(zhì)的任何物理化學(xué)或生物化學(xué)性質(zhì)的其它表現(xiàn)形式。雖然有可能鑒定和測序存在于生物液體蛋白質(zhì)組中所有或一些蛋白質(zhì)，對于按照本發(fā)明生成的蛋白質(zhì)組語的診斷用途而言，這不是必需的。診斷特定疾病可以基于正常蛋白質(zhì)組鐠和待診斷的疾病或病理情況存在時(shí)在相同情形下獲得的同樣生物液體的蛋白質(zhì)組譜之間的特征性差異(獨(dú)特表達(dá)信號)。獨(dú)特表達(dá)信號可以是檢測或參比生物樣品中蛋白質(zhì)組譜內(nèi)的任何獨(dú)特特性或圖式，其以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式不同于從相同類型的來源處獲得的相應(yīng)正常生物樣品的蛋白質(zhì)組譜。例如，如果該蛋白質(zhì)組譜以質(zhì)譜的形式存在，該獨(dú)特表達(dá)信號典型地是一個(gè)峰或峰的組合，其定性地或定量地不同于相應(yīng)正常樣品的質(zhì)譜。因此，質(zhì)譜中新的峰或新的峰的組合的出現(xiàn)，或已經(jīng)存在的峰或已經(jīng)存在的峰的組合中振幅或形狀的統(tǒng)計(jì)上顯著的改變，或已經(jīng)存在的峰的消失，在質(zhì)譜中可以被認(rèn)為是獨(dú)特表達(dá)信號。當(dāng)來自哺乳動物受試者的檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜與包含表征病理性母親或胎兒狀況的獨(dú)特表達(dá)信號的參考樣品的蛋白質(zhì)組譜比較時(shí)，如果它和參考樣品一樣也具有該獨(dú)特表達(dá)信號，則該哺乳動物受試者被診斷為患有這種病理情況。[Olll]通過比較來自待診斷受試者的生物液體的蛋白質(zhì)組譜和以同樣方式獲得和處理的同一種類正常生物液體的蛋白質(zhì)組譜，可以診斷特定的病理性母親/胎兒狀況。如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜和正常樣品的蛋白質(zhì)組譜基本上一樣，則認(rèn)為該受試者沒有所討論的病理性母親/月臺兒狀況。如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組i普相對于正常樣品的蛋白質(zhì)組譜顯示獨(dú)特表達(dá)信號，則該受試者被診斷為具有所討論的母親/胎兒狀況?？蛇x的或者另外，檢測樣品蛋白質(zhì)組譜可以與從被獨(dú)立地診斷為具有該病理性母親/胎兒狀況的受試者的生物液體處獲得的參考樣品的蛋白質(zhì)組譜進(jìn)行比較。在這種情況下，如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組譜與參考樣品的蛋白質(zhì)組譜都具有至少一個(gè)代表獨(dú)特表達(dá)信號的特征或者特征的組合，則該受試者被診斷為具有該病理情況。在本發(fā)明的方法中，正常生物樣品的蛋白質(zhì)組譜具有重要的診斷作用。正如以上所討論的，如果檢測樣品的蛋白質(zhì)組語與正常生物樣品的蛋白質(zhì)組譜基本上一樣，則該患者被診斷為沒有所要鑒定的病理性母親/胎兒狀況。這一"負(fù)"診斷具有重大意義，因?yàn)樗恍枰獙颊哌M(jìn)行不必要的治療或者介入，這種治療或介入具有可能的副作用，或者能給患者、胎兒、或者新生兒帶來風(fēng)險(xiǎn)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以確定差異是否是統(tǒng)計(jì)上顯著的。本發(fā)明的診斷方法的敏感性可以通過在分析之前利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離方法除去在正常和患病的蛋白質(zhì)組中具有基本上相同表達(dá)水平的蛋白質(zhì)(常見蛋白，例如白蛋白和免疫球蛋白)來增強(qiáng)。除去這種不是獨(dú)特表達(dá)信號的一部分的常見蛋白導(dǎo)致敏感性和診斷準(zhǔn)確度改善。可選的或者另外，常見蛋白的表達(dá)信號可以通過結(jié)果的電子計(jì)算機(jī)分析來消除(或除去信號)，典型地利用機(jī)器生成的i普選擇算法，來獲得診斷性信號。在下面實(shí)施例中所詳述的結(jié)果提供了表征IAI(IAI)和過早陣痛的蛋白質(zhì)組譜，其以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式不同于羊水(AF)或CVF(CVF)正常蛋白質(zhì)組譜。另外，實(shí)施例提供了表征IAI、早產(chǎn)、唐氏綜合癥、及其他母親或胎兒狀況的表達(dá)標(biāo)記物和獨(dú)特表達(dá)信號。用于進(jìn)行本發(fā)明非侵入性診斷方法的一種特別有利的生物液體是CVF(CVF)。CVF是一種復(fù)雜的生物液體，由水、電解質(zhì)、低分子量有機(jī)化合物(葡萄糖、氨基酸、和脂類)、細(xì)胞(白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、和上皮細(xì)胞)和主要由宮頸內(nèi)膜合成的大量蛋白和蛋白水解酶組成(Blandauetal.，TheBiologyofthecervix.UniversityChicagoPress:Chicago,1973;pxi,450p.)。CVF也含有陰道細(xì)胞分泌物，包括粘蛋白、防衛(wèi)素、補(bǔ)體因子、免疫球蛋白、乳運(yùn)鐵蛋白和膠原凝集素(collectin)(Blandauetal.，見上)。CVF流過和潤滑整個(gè)女性生殖道，包括陰道、宮頸和子宮區(qū)域。CVF形成阻止外來病原體的第一道防線、指示生育力、幫助授精、妊娠和分娩(Blandauetal.，見上；Bigelow，J丄.etal.,HumReprod2004，19，(4)，889-92)。CVF也含有菌群，例如巻曲乳才干菌(丄acto6acz'〃/cn^/a/w力和陰道乳才干菌(Lactobacillivaginalis)。這一菌群產(chǎn)生的分泌物賦予CVF低pH值，增強(qiáng)其抗病原體活性(Blandauetal.，見上)。陰道菌群的任何失調(diào)或外來菌群的侵入都會導(dǎo)致細(xì)菌性陰道炎。應(yīng)對細(xì)菌性陰道炎，由宮頸和陰道內(nèi)皮分泌入CVF的若干細(xì)胞因子分泌也改變，例如IL-la、IL-l卩、IL-IO、IL-6和TNF-a(Mattsby-Baltzer,Ietal.,ActaObstetGynecolScand1998，77,(7),701-6;Eschenbach,D.A.etal.，JClinMicrobiol1989,27，(2),251-6)。無法控制細(xì)菌性陰道炎與宮頸癌(Mikamo，Hetal.，JInfectChemother1999,5,(2)，82-85)、盆腔炎癥性疾病(Ness，R.B.etal.,AmJEpidemiol2005,162,(6),585-90.)、子宮內(nèi)膜炎(Haggerty,C.Letal.，ClinInfectDis2004、39、(7)、990-5;Morris、M.etal.、Bjog2001、108、(5)、439-50)和輸卵管性不育(Morrisetal.,見上)正相關(guān)。孕婦的細(xì)菌性陰道炎與過早陣痛和早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)(Gravett,M.G.etal.，Jama1986,256,(14),1899-903)。缺陷病毒例如HIV和單純皰滲病毒(HSV)的感染、復(fù)制和增殖中也起重要作用(Poli，G.etal.，AIDSResHumRetroviruses1992,8,(2),191-7;Zara，F(xiàn).etal.，SexTransmInfect2004,80,(2),濯-12;John,M.etal"JInfectDis2005,192，(10)，1731-40)。對CVF的陽離子多肽級分進(jìn)行分析鑒定了20種有助于抗HIV活性的多肽(Venkataraman，N.etal.,JImmunol2005，175,(11)，7560-7)。先前的研究也確定了CVF在捕獲HIV病毒粒子、因而防止感染中的作用(Maher，D.etal.，ProcNatlAcadSciUSA2005，102，(32),11504-9;Quinones-Mateu,M.Eetal.,Aids2003,17，(16)，F(xiàn)39-48)。最近的研究已經(jīng)檢測了CVF中若干免疫應(yīng)答分子與導(dǎo)致早產(chǎn)的臨床癥狀不顯的胎膜早破(prematureruptureofmembrane,PROM)的發(fā)生率之間的相關(guān)性(Helmig，B.R.etal.，JMatemFetalNeonatalMed2002,12，(4)，237-46;Ogino,M.etal"JObstetGynaecolRes2005，31,(5),421-6)。妊娠期間，或者由于絨毛膜的蛻膜接觸面的破裂或由于該接觸面的平行分泌，CVF可以含有來源于子宮的羊水(AF)。羊水向CVF中的這一"滲漏"提供了目前用于診斷胎兒纖連蛋白的存在的非侵入診斷的基礎(chǔ)，其已經(jīng)被用于預(yù)測婦女的過早陣痛(Swamy，G.K.etal.，JReprodMed2005，50,(11),851-6)。由于與羊水即羊膜穿刺術(shù)相比其最低限度侵入性的收集方法，CVF是在孕婦中監(jiān)視母親胎兒健康的重要的潛在診斷部位。在此提供的在CVF蛋白質(zhì)組中表達(dá)的蛋白的全面目錄能夠使得更好地了解導(dǎo)致或反映妊娠期間或陰道病理學(xué)的各種CVF的潛在作用。比較蛋白質(zhì)組語的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在本領(lǐng)域中為大家所熟知。例如，就質(zhì)譜來說，蛋白質(zhì)組語被定義為沿著語橫軸在關(guān)鍵質(zhì)量/電荷(M/Z)位置上的峰幅度值。因此，特征性蛋白質(zhì)組譜可以例如用在給定M/Z值的i普振幅的組合所形成的模式來表征。通過用適當(dāng)?shù)乃惴▽z測樣品的蛋白質(zhì)組譜(模式)與參比或正常樣品的蛋白質(zhì)組譜(模式)相匹配，可以確定特征性表達(dá)信號的存在或不存在，或者兩個(gè)譜實(shí)質(zhì)上的一致性。分析蛋白質(zhì)組學(xué)模式的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在例如PetricoinIII,etal.,TheLancet359:572-77(2002).;Issaqetal.,BiochemBiophysCommun292:587-92(2002);Balletal"Bioinformatics18:395-404(2002);和Lietal"ClinicalChemistryJournal,48:1296-1304(2002)中公開。4.秀*謬遂都定本發(fā)明的蛋白質(zhì)組語進(jìn)一步用于篩選測定法，用于鑒定治療特定的母親/胎兒狀況的藥物候選者。這種篩選測定法基于檢測分子將含有表征待治療的母親/胎兒狀況的表達(dá)信號的蛋白質(zhì)組諳轉(zhuǎn)換成沒有該表達(dá)信號的蛋白質(zhì)組譜的能力。在一個(gè)特定的具體實(shí)施方式中，檢測測試化合物將病理性表達(dá)譜轉(zhuǎn)換成正常表達(dá)譜的能力。在另一具體實(shí)施方式中，該篩選測定檢測測試化合物將表征病理情況的獨(dú)特表達(dá)信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的正常表達(dá)信號的能力。這種篩選測定可以通過處理患病的生物樣品、和比較處理前后的蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)譜而體外進(jìn)行?？蛇x的或者另外，藥物篩選可以通過用測試化合物治療顯示該靶病理性的母親/胎兒狀況的實(shí)驗(yàn)室動物、在治療前后取得該動物生物液體的樣本、并且比較兩樣品的蛋白質(zhì)組譜而進(jìn)行。在該測定中，也有可能在治療后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取得生物液體的樣本，并且跟蹤治療的時(shí)程。這種方法學(xué)也可用于表征藥物試劑的毒理學(xué)，以及鑒定特定療法的最佳候選者。測試化合物可以例如是肽、非肽小有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、多肽、抗體(包括抗體片段)、反義分子、寡核苷酸誘辨(decoys)、和任何其它先前已經(jīng)用作藥物或藥物候選者的分子種類。生物液體可以例如是羊水、血清(例如母體血清)、血漿、尿、月S脊髓液、母乳、粘液或唾液。殺口的制劑的目錄可以在Remington，sPharmaceuticalSciences,latestedition,MackPublishingCompany,Easton，PA中找到。查閱該手冊在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。5.蛋^萍W上述討論的診斷和篩選測定都可以利用蛋白陣列進(jìn)行。最近幾年中，蛋白陣列作為檢測蛋白、監(jiān)視蛋白表達(dá)水平和研究蛋白相互作用與功能的強(qiáng)大手段，已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可。當(dāng)可以利用自動化方法同時(shí)進(jìn)行大量測定時(shí)，它們能夠進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)分析。在起初被開發(fā)用于DNA陣列的微陣列或芯片格式中，可以進(jìn)行這種測定，其最低限度地使用材料，然而生成大量數(shù)據(jù)。雖然通過如上所述的2D凝膠電泳和質(zhì)語分析法分析蛋白質(zhì)組是非常有效的，但它不總是能提供所需要的高靈敏度，并可能遺漏許多以低豐度表達(dá)的蛋白。蛋白微陣列除了其高效率之外，敏感性也提高。統(tǒng)的藥物制劑。本領(lǐng)域已蛋白陣列通過利用本領(lǐng)域熟知的各種共價(jià)和非共價(jià)附著化學(xué)方法，將蛋白質(zhì)固定在固體表面上，例如玻璃、硅、微孔、硝酸纖維素、聚偏二氟乙烯薄膜和微珠。該固相支持體應(yīng)該在結(jié)合過程前后都是化學(xué)上穩(wěn)定的，允許有好的點(diǎn)形態(tài)，顯示最小的非特異性的結(jié)合，不應(yīng)該構(gòu)成檢測系統(tǒng)的本底，并應(yīng)該與不同的4企測系統(tǒng)相適應(yīng)。通常，蛋白質(zhì)微陣列使用與DNA陣列讀數(shù)所通常使用的檢測方法同樣的檢測方法。類似地，與用來閱讀DNA微陣列的裝置同樣的裝置也適合于蛋白質(zhì)陣列。因而，俘獲陣列(例如抗體陣列)可以用來自兩種不同來源，例如正常和患病的生物液體的焚光標(biāo)記蛋白質(zhì)來^r測。在這種情況下，讀數(shù)是基于反映靶蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化的熒光信號的變化?？蛇x的讀出過程包括但不限于熒光共振能量傳遞、表面等離子共振、滾環(huán)DNA擴(kuò)增、質(zhì)譜分析法、共振光散射、和原子力顯微術(shù)。有關(guān)詳細(xì)情形參見例如ZhouH,etal.,TrendsBiotechnol.19:S34-9(2001);Zhuetal.,CurrentOpin.Chem.Biol.5:40-45-(2001);WilsonandNock,AngewChemIntEdEngl42:494-500(2003);和SchweitzerandKingsmore，CurrOpinBiotechnol13:14-9(2002)。生物分子陣列也公開于美國專利號6,406,921，于2002年6月18日授權(quán)，其公開全文在此通過參考明確合并于此。6.名瘦縱本發(fā)明的診斷測定法還可以以本領(lǐng)域已熟知的各種免疫測定形式進(jìn)行。有兩種主要的免疫測定類型，均相(homogenous)和非均相(heterogenous)。在均相免疫測定中，抗原和抗體的免疫反應(yīng)以及該反應(yīng)的抬r測都在均一反應(yīng)中進(jìn)行。非均相免疫測定包括至少一個(gè)分離步驟，其允許將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的試劑區(qū)別開來。ELISA是一種非均相免疫測定，自從二十世紀(jì)七十年代早期其已經(jīng)被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐。該測定可用于4企測各種形式的抗原。在"三明治"形式中，待測抗原被夾在兩個(gè)不同的抗體之間。在這個(gè)方法中，固體表面首先用固相抗體包被。然后添加含有抗原(即診斷性蛋白質(zhì))的檢測樣品，允許其與已經(jīng)結(jié)合的抗體反應(yīng)。任何未結(jié)合的抗原酶標(biāo)記的抗體與結(jié)合抗原反應(yīng)。任何過量的未結(jié)合的酶連接的抗體在反應(yīng)后都被洗掉。然后添加測定中所用酶的底物，底物和酶之間的反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化?？梢姷念伾兓牧渴菍εc特定酶共軛的結(jié)合抗體、以及因此對存在于檢測樣品中的抗原的直接測量。ELISA還可以被用作竟?fàn)幏治龇?。在竟?fàn)幏治龇ㄐ问街校写郎y抗原的檢測樣品與精確量的酶標(biāo)記抗原混合，兩者竟?fàn)幣c附著于固體表面的抗抗原抗體的結(jié)合。洗掉過量的游離酶標(biāo)記抗原，然后添加酶底物。酶底物相互作用產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度的量是對檢測樣品中抗原量的測量。均相免疫測定包括例如酶倍增免疫測定技術(shù)(theEnzymeMultipliedImmunoassayTechnique,EMIT),其典型地包括包含待測量的一種或多種化合物的生物樣品、待測量化合物的酶標(biāo)記的分子、結(jié)合該待測量化合物的一種或多種特異抗體、以及特異性酶產(chǎn)色底物。在一個(gè)典型的EMIT中，向生物樣品中加入過量的特異性抗體。如果該生物樣品含有待檢測蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合。然后向混合物中加入已知量的相應(yīng)的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)。沒有被樣品中蛋白質(zhì)分子占據(jù)的抗體結(jié)合位點(diǎn)用所添加的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)分子占據(jù)。結(jié)果，因?yàn)橹挥杏坞x的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)可以與底物作用，酶活性被降低。從無色形式變?yōu)橛猩问降牡孜锏臄?shù)量決定了留在混合物中游離酶的數(shù)量。樣品中高濃度的待測蛋白質(zhì)引起較高的吸光率讀數(shù)。樣品中較少的蛋白質(zhì)導(dǎo)致較少的酶活性，因此導(dǎo)致較低的吸光率讀數(shù)。當(dāng)抗原酶復(fù)合物被抗體結(jié)合時(shí)，酶標(biāo)記失活，這使得EMIT成為一種獨(dú)特的系統(tǒng)，不需要像其它免疫測定方法所需要的那樣，將結(jié)合的化合物與非結(jié)合的化合物分開，就能夠進(jìn)行檢測。本發(fā)明的一部分也是一種免疫分析試劑盒，其在分開的容器中包含(a)單克隆或多克隆的抗體，其具有對用于診斷特定母體/胎兒狀況(例如IAI或早產(chǎn))的多肽的結(jié)合特異性；b)以及針對該抗體的免疫球蛋白。該免疫分析試劑盒可以用于實(shí)施在此提供的各種方法。單克隆或多克隆抗體以及抗抗體免疫球蛋白可以以大約0.001mg至1OO克的量提供，更優(yōu)選大約0.01mg至l克。針對抗體的免疫球蛋白可能是多克隆免疫球蛋白、蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G或其功能片段，其可以在使用前通過本領(lǐng)域已知的方法標(biāo)記。診斷特定母體/胎兒狀況所用的特異于多肽的單克隆或多克隆抗體可以利用本領(lǐng)域已有的讀數(shù)設(shè)備利用比色或電荷狀態(tài);險(xiǎn)測來適于進(jìn)行快速斑點(diǎn)定量。7.基于質(zhì)譜分析法的測定質(zhì)譜分析法的最新發(fā)展(AndersonandHunterC丄.，MolCellProteomics,2006Apr;5(4):573-88)使得能夠通過監(jiān)視特定的離子通過質(zhì)量選擇定量特殊蛋白質(zhì)和多肽。這些測定使用質(zhì)量選擇來提供絕對特異性，第一步的選擇(MS1)涉及俘獲母離子，第二步俘獲母離子的特定碎片(多反應(yīng)監(jiān)測，MRM),才企測和定量。利用對于特定蛋白質(zhì)的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)，MRM測定可以提供對分析物的可靠定量，以監(jiān)視各種疾病特異性生物標(biāo)記物。母體胎兒疾病標(biāo)記物的單克隆或多克隆抗體可用于通過MRM測定俘獲和分析。8.if斷和治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的診斷方法對于開業(yè)醫(yī)生進(jìn)行迅速的治療決定是有價(jià)值的工具，這些決定對于嬰兒和/或母親的存活常常是決定性的。因而，例如，如果孕婦顯示過早陣痛的癥狀，重要的是進(jìn)行診斷性試驗(yàn)來決定是否存在子宮內(nèi)感染。如果本文的迅速非侵入性診斷試驗(yàn)證實(shí)子宮內(nèi)感染存在，醫(yī)生必須假定不可避免要發(fā)生早產(chǎn)，需要立即采取步驟來提高早產(chǎn)嬰兒的存活機(jī)會，限制對母親健康帶來的風(fēng)險(xiǎn)。如果對子宮內(nèi)感染的檢測是陰性的，早產(chǎn)是否仍會發(fā)生仍然是一個(gè)問題。目前，有時(shí)單一標(biāo)記物胎兒纖連蛋白(fFN)檢測被用于這一目的。在懷孕患者CVF中沒有fFN很好地指示妊娠將再延續(xù)至少兩周。然而，基于fFN的存在(正檢驗(yàn))，不可能可靠地預(yù)測是否可能發(fā)生早產(chǎn)。本發(fā)明所提供的多標(biāo)記物診斷性試驗(yàn)無論在陰性還是在陽性檢測結(jié)果的情況下都能可靠地預(yù)測早產(chǎn)的可能性?？蛇x地，如果該患者顯示早產(chǎn)的癥狀，并且診斷性試驗(yàn)(或者是在此所描述的測試，還者是任何臨床上使用的其它檢測)被用來評價(jià)早產(chǎn)的可能性，可以進(jìn)行子宮內(nèi)感染的測試作為后續(xù)檢查，以提供更特異的信息和使得醫(yī)生能夠做出更好的處理決定。實(shí)施例l為了確定IAI的診斷標(biāo)記物所進(jìn)行的羊水蛋白質(zhì)組學(xué)分析中所用的規(guī)程下列規(guī)程被用于在以下實(shí)施例2-13中所描述的羊水蛋白質(zhì)組學(xué)分析"/的克長類#,型本規(guī)程經(jīng)俄勒岡州國立靈長類研究中心(theOregonNationalPrimateResearchCenter)的7^共機(jī)構(gòu)動物關(guān)愛利用委員會(InstitutionalAnimalCareUtilizationCommittee)批準(zhǔn)，并遵循人道關(guān)懷的指導(dǎo)方針。對三只懷孕的恒河猴(Macacamulatta)的妊娠時(shí)程進(jìn)行監(jiān)視，如同先前描述的長期插管(HaluskaGJ,etal.，TemporalchangesinuterineactivityandprostaglandinresponsetoRU486inrhesusmacaquesinlategestation,AmJObstetGynecol157:1487-95(1987);andGravettMG,etal,,Anexperimentalmodelforintramnioticinfectionandpretermlaborinrhesusmonkeys.AmJObstetGynecol171:1660-7(1994))。簡言之，在妊娠的大約110天(167天足月)，使懷孕動物習(xí)慣于護(hù)套和系《連系統(tǒng)(jacketandtethersystem)(DucssayCA,etal.,Simplifiedvestandtethersystemformaintenanceofchronicallycatheterizedpregnantrhesusmonkeys.Lab.AnimSci38:343-4(1988》。適應(yīng)后，在妊娠第119到126天之間在全身麻醉下進(jìn)行子宮內(nèi)手術(shù)。通過手術(shù)才直入母體股骨動脈和靜脈導(dǎo)管、胎兒動脈和靜脈導(dǎo)管、兩個(gè)末端開口的羊膜壓力導(dǎo)管、子宮肌層肌電圖測量電極、和胎兒肌電圖測量電極。手術(shù)后1至5天所有動物都接受硫酸間羥叔丁腎上腺素(lmg靜脈內(nèi)3至5小時(shí)，每天兩次)以控制子宮躁動。動物也接受頭孢唑啉(每12小時(shí)250毫克靜脈內(nèi)注射)，細(xì)菌接種之前至少48小時(shí)停止注射。術(shù)后穩(wěn)定8-13天(妊娠第126-138天)，然后通過羊膜腔內(nèi)接種106集落形成單位(cfo)的III型B組鏈球菌(在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心、洗滌、和懸浮在0.5ml的鹽溶液中)(n-3只動物)和生長在液體培養(yǎng)基中的107cfu的角罕脲支原體(t7reap/os1wawrea(y"cwm)(1只動物)或腳cop/asma/zo而'"&(1只動物)建立羊膜腔內(nèi)感染。在研究期間連續(xù)地從所有動物收集羊水樣品(接種之前每天收集，接種之后每4到12小時(shí)收集)用于定量細(xì)菌培養(yǎng)，通過血球計(jì)數(shù)器分析白細(xì)胞，以及細(xì)胞因子和前列腺素濃度(先前報(bào)導(dǎo)的，GravettMG,etal"Anexperimentalmodelforintra-amnioticinfectionandpretermlaborinrhesusmonkeys.AmJObstetGynecol171:1660-7(1994》。從手術(shù)直到分娩連續(xù)不斷地記錄胎兒心電圖和子宮活性(肌電圖和羊膜內(nèi)壓力)。子宮收縮性記錄為每小時(shí)收縮曲線下的面積，表示為以毫米汞柱乘以秒/小時(shí)表示的每小時(shí)收縮面積(hourlycontractionarea,HCA)。感染之前和感染之后連續(xù)經(jīng)陰道觸診母體宮頸。每次4全查中記錄堅(jiān)實(shí)度、宮頸管消失和擴(kuò)張。一只動物經(jīng)陰道生產(chǎn)，其余動物皆剖腹產(chǎn)，產(chǎn)后從感染動物獲得蛻膜、胎盤和內(nèi)膜細(xì)菌培養(yǎng)物以證實(shí)感染，進(jìn)行組織病理學(xué)研究。收集羊水樣品(3ml)20分鐘后，立即于4。C、3,000rpm離心20分鐘。回收沉淀物用于細(xì)胞分析，上清液-20。C保存在無熱原的無菌小瓶中直到測定。人的研《研究群體來自309名婦女，她們因過早陣痛(prematurelabor)但胎膜完整于1991年6月25日至1997年6月30日之間收入華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心或西雅圖的相關(guān)醫(yī)院，如先前所描述(HittiJ，etal.,Amnioticfluidtumornecrosisfactor-aandtheriskofrespiratorydistresssyndromeamongpreterminfants.AmJObstetGynecol177:50-6(1997))。所有婦女都提供了書面知情同意書，研究規(guī)程經(jīng)所有參加項(xiàng)目醫(yī)院的組織機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。參與者的胎齡從末次月經(jīng)或從最早可利用的超聲算起22到34周。所有參與者在加入研究時(shí)都具有完整胎膜。過早陣痛(Pretermlabor)定義為規(guī)j律宮縮頻率lO分鐘，并且或者具有確認(rèn)的(documented)宮頸變化，或者宮頸口擴(kuò)張l厘米，或者宮頸管消失50%。入院時(shí)宮頸口擴(kuò)張>4厘米或破膜的婦女被排除。具有多次妊娠史、宮頸環(huán)扎、前置胎盤、胎盤早期剝離、糖尿病、高血壓、和先兆子癇的婦女如果她們滿足研究標(biāo)準(zhǔn)則也認(rèn)為合格。所有研究參與者都在超聲指導(dǎo)下進(jìn)行經(jīng)腹壁羊膜穿刺術(shù)，在參與研究時(shí)通過靜脈穿刺收集母體靜脈血。從這一研究群體中，回顧性地確定子集(表1A和B)，用于本文所報(bào)導(dǎo)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。該子集包括ll名具有子宮內(nèi)感染證據(jù)的患者(定義為從羊水收獲樣i生物病原，或羊水IL-6濃度〉2,000pg/ml);和隨機(jī)選擇的ll個(gè)患者的子集，他們不具有子宮內(nèi)感染但是具有早產(chǎn)；以及l(fā)l個(gè)不具有感染、具有過早陣痛、但是對子宮收縮抑制療法有反應(yīng)、隨后足月產(chǎn)的患者。這些患者構(gòu)成本報(bào)導(dǎo)的研究群體。研究群體被分成三組1)基于從羊水收獲的微生物或者羊水IL-6濃度〉2,000pg/ml而有子宮內(nèi)感染證據(jù)的患者；2)沒有子宮內(nèi)感染證據(jù)、在妊娠35周之前發(fā)生過早陣痛和分娩的患者；和3)對子宮收縮抑制療法有反應(yīng)、>35周妊娠分娩的患者。這三組之間在母體年齡、種族、或經(jīng)產(chǎn)狀況之間沒有差異(表1A和B)。然而，子宮內(nèi)感染的患者在入院時(shí)胎齡稍早(p=0.10)，分娩時(shí)孕齡顯著早于早產(chǎn)但沒有感染、或足月分娩的患者(27.3+0.9周，相對于分別為29.8+1.0和37.0+0.9周，pO.OOOl)。此外，患有子宮內(nèi)感染的患者入院至分娩之間的時(shí)間間隔顯著較短(2.1+5.6天，相比于另外兩組的8.4+6.3和46.9+5.6天，p0.0001)。9P/o的患子宮內(nèi)感染的患者在入院七天內(nèi)分娩。在11名感染患者當(dāng)中，從四人中回收到微生物(2個(gè)為大腸桿菌，l個(gè)為白色念珠菌，l個(gè)為混合厭氧菌)；所有這些患者都在七天內(nèi)分娩。其它七名患者基于羊水IL-6濃度大于2,000pg/ml也被確診。羊水平均白細(xì)胞介素-6的濃度在這些患者當(dāng)中為27.7+7.8ng/ml，與此相比，沒有感染卻早產(chǎn)的患者為0.68+0.20ng/ml，過早陣痛和足月分娩的患者為0.25+0.13ng/ml(p<0.01)。研究群體的特征顯示于表1A。在表1A中，數(shù)據(jù)表示為平均標(biāo)準(zhǔn)差。連續(xù)數(shù)據(jù)用ANOVA分析，分類數(shù)據(jù)用卡方分析?？s寫PMD，<35周早產(chǎn)；IUI，子宮內(nèi)感染；PML，過早陣痛但沒有分4免。篩選結(jié)果顯示于表1B。在表1A和1B中，數(shù)據(jù)表示為平均標(biāo)準(zhǔn)差。連續(xù)數(shù)據(jù)用ANOVA分析，分類數(shù)據(jù)用卡方分析?？s寫PMD,<35周早產(chǎn)；IUI,子宮內(nèi)感染；PML,prematurelabor沒有分娩。表1C顯示篩選測試結(jié)果的Fisher's檢驗(yàn)顯著性值。羊水的蛋^^^紐夢為Vvfl-維(l-D)凝膠電泳分析100(ig的羊水用碘乙酰胺還原后加載到15。/o的SDS-PAGE凝膠上。在80V進(jìn)行電泳以分離樣品中的蛋白質(zhì)。電泳后凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色，用Bio-RadGS800光密度計(jì)和PDQUEST軟件收集圖像。從凝膠上切下單個(gè)條帶，脫色，37。C在凝膠中用胰蛋白酶消化24-48小時(shí)。肽用0.1。/。TFA提取，在speedvac中干燥。提取物溶于0.1。/。TFA,用Millipore的ZipTipds移液管槍頭纟屯4b(MarvinL.，etal.Identificationofproteinsfromone-dimensionalsodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisusingelectrosprayquadrupok-time-of—flighttandemmassspectrometry.RapidCommunMassSpectrom.14(14):1287-92,2000)。二維(2-D)凝力交電泳分析除去或不除去白蛋白的羊水(400-2000jag)溶于正F緩沖液中，并且在室溫下再水化12小時(shí)到24cmlPG條帶上(pH3-10)。再水化后，IPG條帶在7090kVhr下進(jìn)行一維電泳。IPG條帶然后相繼用DTT平衡緩沖液I和IAA平衡緩沖液II平衡15分鐘，然后進(jìn)行第二維SDS-PAGE分析。然后將IPG條帶加載到4-20%SDS-PAGE凝膠上，在120V電泳12小時(shí)以分辨第二維度上的蛋白質(zhì)。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色，Bio-RadGS800光密度計(jì)和PDQUEST軟件成象。從凝膠上切下單個(gè)斑點(diǎn)，脫色，37。C在凝膠中用胰蛋白酶消化24-48小時(shí)。肽用0.1。/。TFA提取，用Millipore的ZipTip^移液管槍頭純化(2-DMolecularBiology:112,1999)。HPLC分級分離人羊水樣品在除去白蛋白和IgG后(1-15mg蛋白質(zhì))溶于20mMTris-HCl,pH7.5。在裝備有自動采樣器和紫外線吸光率檢測器的Waters1525HPLC上利用TSK凝膠DEAE-5PW進(jìn)行陰離子交換色語。用線性鹽洗脫梯度來分級分離蛋白質(zhì)。以一分鐘間隔收集級分。合并級分，用胰蛋白酶消化，利用質(zhì)語儀(Q-Tof-2)分析肽混合物。質(zhì)譜分析(1)Q-Tof-2凝膠內(nèi)消化后，樣品在與MicromassCapLC連接的MicromassQ-Tof-2質(zhì)語儀上分析。Q-Tof-2配備有常規(guī)Z-spray或納米噴霧源，連接到IntegrafritC1875umIDx15cm熔凝硅石毛細(xì)管柱。儀器用帶有WindowsNT和MassLynx3.5軟件的Compaq工作站控制，數(shù)據(jù)也用該工作站獲得。Q-Tof-2用GlulFibrinopeptideB通過直接輸注或注射入CapLC來校準(zhǔn)。MS/MSMS檢查法被用來獲得MS/MSMS譜。掃描質(zhì)量400至1500用于MS檢測，質(zhì)量50至1900用于MSMS。在帶有Windows2000和SEQUEST(版本1.3)和/或LUTEFISK的個(gè)人計(jì)算機(jī)上進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析。生成峰列表，利用機(jī)內(nèi)自動操作程序進(jìn)行峰收集和將質(zhì)心擬合用于每個(gè)峰。(2)LCQ-MS切下干燥的考馬斯藍(lán)染色凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，在0.5ml的20mM碳酸氫銨、50%乙腈溶液中再水化/洗滌30分鐘。凝膠區(qū)域然后通過真空離心干燥，通過在20nM測序級修飾的胰蛋白酶(ProMega，Madison，WI，USA)中利用Courchesne和Patterson的方法(Identificationofproteinsbymatrix-assistedlaserdesorption/ionizationmasses,MethodsMol.Biol.112:487-511(1999))再水化。胰蛋白酶消化產(chǎn)物然后通過真空離心濃縮，通過反相色譜法分離，肽通過LCQ型離子阱質(zhì)語儀(ThermoFinnigan，SanJoseCA)分析。樣品用ZorbaxC-180.5mmx150mm微孔柱分離，利用10mLmiiT'流速和0至40。/。B(水中的75%乙腈)的梯度在一個(gè)小時(shí)的時(shí)間內(nèi)利用1100CapillaryLC系統(tǒng)(AgilentTechnologies,FosterCity,CA)。肽直接輸入標(biāo)準(zhǔn)ThermoFinnigan電噴霧源。以自動方式利用標(biāo)準(zhǔn)LCQ軟件獲得MS/MS譜，然后進(jìn)一步利用SEQUEST(ThermoFinnigan)分析。詳纟田內(nèi)容參見Courchesne,P丄.andPatterson,S.D.見上。數(shù)據(jù)分析(1)Sequest和DTASelect如Yatesetal.，MethodsMol.Biol.112:553-69(1999)所述利用SEQUEST軟件(ThermoFinnigan)進(jìn)行串4關(guān)質(zhì)語(MS/MS)的自動分析。SEQUEST將不間斷的串if關(guān)質(zhì)"i普和凄丈據(jù)庫肽序列匹配。沖企索利用來自ProteinInformationResource(發(fā)稿時(shí)間)和SwissProt(發(fā)稿時(shí)間)的蛋白質(zhì)序歹'J的組合標(biāo)引的非冗余數(shù)據(jù)庫利用缺省參數(shù)運(yùn)行。數(shù)據(jù)庫利用XcaliburDatabaseManager(ThermoFinnigan)構(gòu)建。S-Carboxyamidated半胱氨酸是唯一被考慮的修飾。Sequest結(jié)果進(jìn)一步利用DTASelect(TheScrippsResearchInstitute,Tabb，2002)分析。DTASelect組織和過濾SEQUEST命中。除以下情形之外，使用缺省參數(shù)1)在蛋白質(zhì)描述中包括字串"角蛋白"的任何數(shù)據(jù)庫匹配都被排除，和2)LCQ質(zhì)譜儀的譜用互相關(guān)評分截取值2.4來過濾掉雙電荷離子。目視檢查DTASelect所選擇的每個(gè)譜和建議的序列對，最終結(jié)果輸入電子數(shù)詳細(xì)情形也參見TabbDL，etal.，DTASelectandContrast:ToolsforAssemblingandComparingProteinIdentificationsfromShotgunProteomics.J.ProteomeRes.1:21-26(2002)。(2)Lutefisk利用計(jì)算機(jī)程序Lutefisk1900vl么5進(jìn)行所有語的自動化從頭測序(TaylorJA,JohnsonRS.Implementationandusesofautomateddenovopeptidesequencingbytandemmassspectrometry.AnalChem73(11):2594-604(2001)。Lutefisk為譜生成肽序列，所生成的肽序列中有些足夠詳細(xì)，可用于基于同源性的順序檢索。也考慮了修飾作用、丙烯酰胺、carbamidomethylation和磷酸化作用。MALDI檢測規(guī)程和參數(shù)(JensenON,etal.,DirectobservationofUV-crosslinkedprotein-nucleicacidcomplexesbymatrix-assistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry.RapidCommunMassSpectrom7(6):496-501(1993))上進(jìn)行MALDI質(zhì)語分析法。大約l(aL的樣品溶液與lmLSA(在60:40水/乙腈中的芥子酸，0.1%TFA終濃度)混合。l.OpL小滴該分析物/基質(zhì)溶液放置于基質(zhì)預(yù)結(jié)晶的樣品探針上，在空氣中干燥。通過用(355nm)Nd:YAG激光(SpectraPhysics)照射樣品，和在23kV以700ns/1.0kV延遲操作離子源產(chǎn)生質(zhì)譜。每個(gè)質(zhì)譜記錄為20個(gè)連續(xù)語的總和，每個(gè)譜由單個(gè)光子脈沖產(chǎn)生。來自所加入的標(biāo)準(zhǔn)的離子被用于質(zhì)量4交準(zhǔn)。羊水SELDI分析來自羊水樣品的總共0.5-3.0ug蛋白質(zhì)點(diǎn)樣至NormalPhaseNP20(二氧化硅表面)、ReversePhaseH4(疏水表面C-16(長《連脂肪族的)、或固定化的4臬(IMAC)SELDIProteinChip⑧陣歹寸(CiphergenBiosystems、Inc.Fremont,CA)上。室溫保溫l小時(shí)后，NP1和H4芯片用5ul水淋洗以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)和干擾物質(zhì)(即緩沖液、鹽、洗滌劑)。風(fēng)干2-3分鐘后，兩次添加0.5ul在50。/c)乙腈(v/v)、0.5%三氟乙酸0")中的芥子酸飽和溶液，在CiphergenProteinBiologySystemII(PBSII)中進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(Issaq,J.H，etal.:TheSELDI-TOFMSApproachtoProteomics:ProteinProfilingandBiomarkerIdentification.BiochemBiophysResCommun.5:292(3):587-92,2000)。實(shí)施例2鑒定在羊水中表達(dá)的蛋白質(zhì)和多肽使用在實(shí)施例1中描述的材料和方法，鑒定在正常和感染羊水中表達(dá)的蛋白質(zhì)和多肽。如實(shí)施例l所描述將人和靈長類羊水樣品(合并的和單獨(dú)的)用于蛋白質(zhì)分離技術(shù)(1-D、2-D和HPLC分級分離)。所分離的蛋白質(zhì)(凝膠條帶、斑點(diǎn)和級分)用胰蛋白酶消化以生成肽池(pool)。肽池用串聯(lián)MS分析來破譯它們的氨基酸序列和組成。使用譜審核程序選擇五千個(gè)MS鐠。這些譜的文件使用從頭測序程序(Lutefisk,Peaks)分析，來生成相當(dāng)于每個(gè)肽的氨基酸序列。如實(shí)施例l所描述，從肽池生成的從頭序列被用來檢索蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫。利用同源性圖譜和序列證實(shí)，在羊水中發(fā)現(xiàn)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)。根據(jù)已知的結(jié)構(gòu)相似性(序列同源性圖語)分析被檢測蛋白質(zhì)的可能功能。發(fā)現(xiàn)涉及大范圍疾病的、屬于重要功能分類的蛋白質(zhì)。首次在人羊水中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)和多肽按照這些可能的功能種類列在附加的表2中。免疫測定也顯示差異表達(dá)的蛋白質(zhì)、和在感染羊水中更豐富地或唯一代表的蛋白質(zhì)被分別標(biāo)記。此時(shí)，相對豐度定義為在檢測樣品中代表某一多肽或蛋白質(zhì)的肽相對于參考樣品中的數(shù)量。相應(yīng)地，如果來源于同一蛋白質(zhì)的肽在感染羊水中比在非感染羊水參考樣品中多，則在感染羊水中該蛋白質(zhì)更豐富。表3列舉了先前已知存在于羊水中的蛋白質(zhì)和多肽，本測定法再次證實(shí)了它們的存在。作為感染相關(guān)事件已知標(biāo)記物的蛋白質(zhì)被各別標(biāo)記。子宮內(nèi)狀況的^^斷標(biāo)記物鑒于它們的已知的生物功能，上表所列的若干蛋白質(zhì)是檢測和監(jiān)視子宮內(nèi)狀況的有前途的候選者。這種狀況的一些例子和相應(yīng)蛋白質(zhì)標(biāo)記物以下更詳細(xì)討i侖。#力蘭長發(fā)'f"缺潛的標(biāo)記參的,動蛋^源控和^農(nóng)蛋^在表2的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中列舉的膜突蛋白(Moesin)(膜組織延伸刺哭蛋白，Membrane-organizingextensionspikeprotein)已知負(fù)責(zé)將3夸月莫蛋白連接至肌動蛋白細(xì)胞骨架，涉及各種細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路(SpeckO,etal.:MoesinfunctionsantagonisticallytotheRhopathwaytomaintainepithelialintegrity.Nature2:421(6918):83-7,2003)。已經(jīng)顯示p-家族GTP酶和它們的效應(yīng)物能調(diào)制肌動蛋白修飾分子例如肌動蛋白絲切蛋白和肌動蛋白抑制蛋白(也列入表2的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)中)的活性，導(dǎo)致與生長錐加長或退縮有關(guān)的細(xì)胞骨架變化(TangBL.Inhibitorsofneuronalregeneration:mediatorsandsignalingmechanisms.NeurochemInt，42(3):189-203,2003)。冠蛋白樣蛋白p57(列在表2中的另一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì))也涉及肌動蛋白交聯(lián)和加帽(WeitzdoerferRetal.:Reductionofactin-relatedproteincomplex2/3infetalDownsyndrome.BiochemBiophysResCommun,293:836,2002)，其在已知的生長發(fā)育缺陷中失調(diào)。另一種肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，凝溶膠蛋白(gelsolin)(參見表2中作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/結(jié)合蛋白所列舉的凝溶膠蛋白前體)，已知也在生長發(fā)育過程中被調(diào)節(jié)，在器官系統(tǒng)中起重要作用(AraiM,KwiatkowskiDJ.Differentialdevelopmentallyregulatedexpressionofgelsolinfamilymembersinthemouse.DevDyn,215,297,1999)。14-3-3蛋白也是已知的上皮標(biāo)記物，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化途徑，對腦及其他重要器官的正常發(fā)育必不可少(WuC,MuslinAJ.Roleof14-3-3proteinsinearlyXenopusdevelopment.MechDev,119,45,2002)。相應(yīng)地，在人羊水中首次鑒定的、在此所列舉的肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白及其他在發(fā)育過程中起重要作用的相關(guān)分子可用于檢測各種的器官系統(tǒng)生長發(fā)育缺陷，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及其他肌骨胳畸形，其可以例如由染色體非整倍體而產(chǎn)生。這對于語I是特別正確的，其已顯示在感染羊水中差異表達(dá)，該差異表達(dá)已經(jīng)被免疫測定證實(shí)。J染和名瘦^吝^/^病癥的標(biāo)記敎本發(fā)明在感染羊水中^r測巨噬細(xì)胞加帽蛋白(macrophagecappingprotein)、白細(xì)胞彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatenase-associatedlipocalin)、骨逸過氧化物酵(myleoperoxidase)、L-絲束蛋白(L-plastin)(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白)和鈣粒蛋白(calgranulin)(參見表2中免疫反應(yīng)相關(guān)基因的列表),首次表明這些蛋白在IAI中的存在和調(diào)節(jié)。這些蛋白中的有些已知是響應(yīng)感染、炎癥和應(yīng)激的免疫細(xì)胞的應(yīng)答物。巨噬細(xì)胞加帽蛋白(MCP)是Ca(2+)敏感蛋白，其調(diào)節(jié)肌動蛋白微絲和涉及炎性過程(DabiriGA，MolecularcloningofhumanmacrophagecappingproteincDNA.Auniquememberofthegelsolin/villinfamilyexpressedprimarilyinmacrophagesJBiolChem15;267(23):16545-52,1992)。類似地，鉤粒蛋白是4丐結(jié)合蛋白，已知在損傷和傷口愈合中起作用(ThoreyIS.etal.TheCa2+-bindingproteinsS100A8andS100A9areencodedbynovelinjury-regulatedgenes.JBiolChem21;276(38):35818-25，2001)。白細(xì)胞彈性蛋白酶和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)參與抑菌和溶菌機(jī)制(GoetzDH.etal.TheneutrophillipocalinNGALisabacteriostaticagentinterfereswithsiderophore-mediatedironacquisition.MolCell10(5):1033-43,2002)。除了上述免疫調(diào)節(jié)劑之外，我們也首次在感染羊水中發(fā)現(xiàn)兩種抗菌蛋白Fall-39和天青殺素(azurocidin)。抗菌蛋白Fall-39(LL-37)與細(xì)菌脂多糖(lps)結(jié)合，在骨髓、睪丸和中性粒細(xì)胞中表達(dá)。Fall-39刺激肥大細(xì)胞脫粒，是肥大細(xì)胞強(qiáng)有利的趨化因子。除了它的抗菌活性之外，F(xiàn)all-39也具有動員肥大細(xì)胞到炎癥病灶的能力。在有基礎(chǔ)培養(yǎng)基E存在的情況下，合成的FALL-39高效阻止大腸桿菌D21和巨大芽孢桿菌Bm11。有人提議Fall39具有保護(hù)作用，當(dāng)皮膚屏障的完整性被損害時(shí)，其參與第一道防線，防止局部傳染和微生物的全身性侵入(AgerberthB,etal.:FALL-39,aputativehumanpeptideantibiotic,iscysteine-freeandexpressedinbonemarrowandtestis.ProcNatlAcadSciUSA,3:92(1):195-9,1995)。天青殺素(CAP37)是分離自人中性粒細(xì)胞的陽離子抗菌蛋白，在寄主防衛(wèi)和炎癥中具有重要的意義。它在炎癥期間被釋放，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能，例如趨化性，提高存活和分化(PereiraHA.CAP37,aneutrophil-derivedmultifunctionalinflammatorymediator.JLeukocBiol57(6):805-12，1995)。蛋白酶和蛋白酶抑制劑在蛋白調(diào)節(jié)中扮演關(guān)鍵角色，因此控制若千關(guān)鍵生理機(jī)制。我們首次在人羊水、包括IAI中鑒定到絲氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白酶(Serpin)家族的表達(dá)(絲氨酸蛋白酶抑制蛋白蛋白酶、鱗狀細(xì)胞癌抗原1和2，神經(jīng)膠質(zhì)來源的連接蛋白)。絲氨酸蛋白酶抑制劑的絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族在控制許多生物途徑中的蛋白酶類和涉及構(gòu)型疾病例如淀粉樣變、朊病毒腦病和亨廷頓病和阿耳茨海默病中具有主要的作用(LomasDA，CarrellRW,Serpinopathiesandtheconformationaldementias.NatRevGenet;3:759,2002)。另夕卜，在IAI中，我們鑒定到一種眾所周知的涉及免疫調(diào)控的蛋白酶抑制因子--胱抑蛋白的表達(dá)(VrayB，HartmannS,HoebekeJ.Immunomodulatorypropertiesofcystatins.CellMolLifeSci:59(9):1503-12,2002)。所列的蛋白是感染和/或免疫應(yīng)答相關(guān)病癥的有前途的標(biāo)記物。值得注意的是，代表巨噬細(xì)胞加帽蛋白、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、髓過氧化物酶前體、L-絲束蛋白、天青殺素、抗菌蛋白Fall-39、鈣粒蛋白、肌動蛋白抑制蛋白I、神經(jīng)膠質(zhì)來源的連接蛋白、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白I2、和胱抑蛋白的肽在感染羊水中比在正常羊水中更豐富地或唯一地被檢測到，和/或在免疫測定中顯示差異表達(dá)。相應(yīng)地，這些蛋白作為IAI和/或免疫應(yīng)答相關(guān)病癥的標(biāo)記物特別重要。^人卓水中趁豸到的^它^病,赫'^)###蛋^#已經(jīng)在人感染羊水中檢測到的、表2中所列的Gp-340變體蛋白先前在肺中被鑒定為清道夫受體(scavengerreceptor)。該蛋白已知結(jié)合細(xì)菌(鏈球菌和變體)。在感染的羊水中檢測到該蛋白補(bǔ)充了本發(fā)明的敏感的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來鑒定IAI的生物標(biāo)志物。因此，在感染的羊水中鑒定的Gp-340變體蛋白能夠用于檢測新生兒敗血癥。/GF^P-/f蛋冷,爽方度)如表2所示，顯示IGFBP-1在感染羊水中的差異表達(dá)。胰島素樣生長因子(IGF)系統(tǒng)決定性地參與胎兒和胎盤的生長，在子宮內(nèi)膜中通過自分泌/旁泌性機(jī)制調(diào)節(jié)甾族激素行為。IGF-I和IGF-II刺激增殖和分化，在體外在若干細(xì)胞類型中維持分化細(xì)胞功能。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IGF-I和IGF-II以及高親合力IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)。調(diào)節(jié)IGF行為的六種高親合力IGFBP的mRNA在人子宮內(nèi)膜內(nèi)表達(dá)。人子宮內(nèi)膜中最豐富的IGFBP是IGFBP-1，其由蛻膜前(predecidualized)/蛻膜(decidualized)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在分泌晚期以及在妊娠期間分泌。這在臨床產(chǎn)科學(xué)和婦科學(xué)上具有意義，在這些領(lǐng)域中IGFBP-l在先兆子癇、子宮內(nèi)生長受限、多室卵巢綜合癥以及滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜贅生物中有病理生理作用。IGFBP-1蛋白水解片段在人羊水和母體的血清中的存在和調(diào)節(jié)為監(jiān)視與妊娠有關(guān)的子宮內(nèi)和母體狀況打開了一條新路。有關(guān)詳細(xì)情形參見下面的實(shí)施例12。實(shí)施例3子宮內(nèi)感染后靈長類羊水的蛋白表達(dá)譜圖1A-C顯示與相應(yīng)正常表達(dá)譜相比較，子宮內(nèi)感染后靈長類羊水的蛋白表達(dá)i普。如圖1A-C所示，對照和感染羊水的整體蛋白表達(dá)譜是不同的。在較小質(zhì)量范圍內(nèi)詳細(xì)的羊水表達(dá)譜(圖1B和1C)顯示在大約3-5KDa和10-12KDa范圍內(nèi)對照和感染樣品之間蛋白表達(dá)語的明顯且特征性的差異。這說明了響應(yīng)子宮內(nèi)感染而對蛋白表達(dá)的整體調(diào)節(jié)以及檢測能診斷子宮內(nèi)感染的獨(dú)特表達(dá)信號的能力。實(shí)施例4早期檢測靈長類羊水中感染的診斷性模式/譜圖2A-C顯示靈長類羊水響應(yīng)感染(GBS)的時(shí)程分析。接種細(xì)菌之前收集羊水，感染后連續(xù)地收集羊水，如實(shí)施例l所描述的進(jìn)行SELDI-TOF分析。圖2A顯示感染之前的蛋白表達(dá)譜，圖2B為感染12小時(shí)后，圖2C為感染36小時(shí)后。如圖2C所示，子宮內(nèi)感染的一個(gè)診斷峰(10-11KDa)在急性感染的36小時(shí)內(nèi)清楚地達(dá)到高表達(dá)水平。這顯示診斷性蛋白譜能用于監(jiān)視疾病狀態(tài)以及對于治療的反應(yīng)。實(shí)施例5子宮內(nèi)感染后人羊水的蛋白表達(dá)語圖3A-C顯示與化學(xué)上限定的正相親水芯片(normalphasechip)陣列結(jié)合的羊水提取物的SELDI-TOF分析結(jié)果。圖3A顯示在235激光強(qiáng)度的整個(gè)譜。圖3B是詳細(xì)語，顯示在10-12kDa區(qū)域感染和對照樣品之間的差異。圖3C是詳細(xì)譜，顯示在3-5kDa區(qū)域感染和對照樣品之間的特征性差異。如圖3A-C所示，對照和感染羊水的整體蛋白表達(dá)譜是不同的。在較小質(zhì)量范圍內(nèi)詳細(xì)的羊水表達(dá)譜(圖3B和C)顯示在對照和感染樣品之間不同的表達(dá)蛋白(3-5KDa和10-12KDa范圍)。分析蛋白峰的相對強(qiáng)度顯示存在兩個(gè)不同的診斷性簇(10-12kDa和3-5kDa范圍)。這說明響應(yīng)子宮內(nèi)感染的對蛋白表達(dá)的整體調(diào)節(jié)和檢測獨(dú)特表達(dá)信號的能力，該信號能診斷人和靈長類模型子宮內(nèi)感染。值得注意的是，人羊水的該診斷模式與靈長類羊水的診斷模式很好地吻合(實(shí)施例3和4)。實(shí)施例6利用不同質(zhì)譜儀生成診斷譜可以利用不同類型的質(zhì)譜儀檢測診斷性蛋白表達(dá)譜?？疾椴煌馁|(zhì)譜儀是否產(chǎn)生類似的診斷譜。如果診斷譜實(shí)質(zhì)上不依靠于質(zhì)譜儀的種類，在羊水中檢測的差異性蛋白表達(dá)能為子宮內(nèi)感染提供診斷性信號。圖4A和4B顯示在普通的MALDI-TOF質(zhì)譜儀上(JensenON,etal.,DirectobservationofUV-crosslinkedprotein-nucleicacidcomplexesbymatrix-assistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry.RapidCommunMassSpectrom7(6):496-501(199")利用來自沒有子宮內(nèi)感染的人對照(A)的羊水和帶有子宮內(nèi)感染的樣品(B)獲得的質(zhì)譜。如圖4A和B所示，利用別的質(zhì)語儀檢測的在10-12KDa范圍內(nèi)的子宮內(nèi)感染的診斷語類似于利用SELDI-TOF機(jī)器檢測的譜。這顯示有差異的蛋白表達(dá)語是穩(wěn)固的，能用各種各樣的現(xiàn)有質(zhì)譜儀檢測?？傊?，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羊水蛋白和多肽顯示能夠診斷疾病狀態(tài)的不同的表達(dá)模式。在這里提供的結(jié)果顯示疾病特異性診斷模式能用多種質(zhì)譜分析法方法檢測。人和靈長類的模式或蛋白表達(dá)語具有可比性。該語可用于監(jiān)視時(shí)程(感染或治療)效應(yīng)。實(shí)施例7定量羊水中的蛋白和多肽表達(dá)用于診斷和預(yù)后監(jiān)視SDS-PAGE:含有高鹽的人羊水(AF)蛋白用丙酮沉淀。100嗎的羊水蛋白在15%SDS-PAGE上電泳。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色。凝膠圖像用Bio-Rad凝膠掃描器掃描。圖5顯示如下的SDS-考馬斯藍(lán)染色凝膠A)合并的4個(gè)人對照羊水樣品；B)單個(gè)對照羊水樣品；C)4個(gè)合并的人感染羊水樣品；和D)單個(gè)感染的羊水樣品。圖5顯示在10-15KDa范圍內(nèi)對照和感染蛋白表達(dá)水平的顯著差別。結(jié)論是，用質(zhì)譜儀在這一質(zhì)量范圍內(nèi)檢測的一些蛋白和蛋白水解片段導(dǎo)致產(chǎn)生反映蛋白表達(dá)水平的診斷譜，具有診斷和預(yù)后用途。實(shí)施例8子宮內(nèi)感染的羊水Western印跡分析100(ig的羊水蛋白用200V電壓在4-20。/。SDS-PAGE上電泳60分鐘，以90mM轉(zhuǎn)移到PVDF膜上75分鐘。膜用5Q/o牛奶PBST室溫封閉45分鐘，在4。C用1呢/ml第一抗體(SantaCruzandDako)過夜保溫。用TBST洗3次后，膜在室溫用第二抗體IgG-HRP(Sigma)保溫90分鐘，用ECL(Pierce)顯象。結(jié)果如圖6所示A)對照羊水樣品(合并的)；B)感染的羊水樣品(合并的)；圖6顯示與未感染的羊水相比，在感染的羊水中IGFBPl(llKDa)、肌動蛋白抑制蛋白和血漿銅藍(lán)蛋白(130KDa)以更高水平表達(dá)。與對照羊水樣品相比，L-絲束蛋白水平在感染樣品中較低。這些蛋白質(zhì)也用MS方法(從頭測序)從人感染的樣品中鑒定，列于上面的實(shí)施例2中。實(shí)施例9子宮內(nèi)感染的羊水的免疫沉淀分析2微克的第一抗體與600嗎的羊水蛋白質(zhì)混合，在fC保溫過夜。添加15pl的蛋白G瓊脂糖珠，在室溫下在搖床上保溫60分鐘。珠用IP緩沖液洗6次。結(jié)果顯示于圖7，其中(A)顯示對照羊水樣品(合并的)，(B)顯示感染羊水樣品。圖7顯示血漿銅藍(lán)蛋白(130KDa)和鈣粒蛋白(16KDa)在感染羊水中比對照羊水以更高水平表達(dá)。實(shí)施例IO在人羊水和母體血清中檢測蛋白質(zhì)表達(dá)的差異考查在羊水中差別表達(dá)的蛋白質(zhì)是否能被用作主要標(biāo)記物，來測量母體血清中的類似蛋白質(zhì)。這能夠開發(fā)快速和非侵入的檢測用于診斷和監(jiān)視。結(jié)果顯示于圖8中，其中(A)是對照樣品(合并的)，(B)是感染樣品(合并的)。圖8顯示，響應(yīng)子宮內(nèi)感染，IGFBP-1較小的蛋白水解片段在羊水和母體血清中一致地被區(qū)別表達(dá)。實(shí)施例ll子宮內(nèi)感染的羊水的蛋白質(zhì)微陣列分析抗體IGFBP1(DSL);補(bǔ)體C3，結(jié)蛋白，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，NSE抗體(DAKO);鈣粒蛋白，血漿銅藍(lán)蛋白，TIMP-1,絲束蛋白和肌動蛋白抑制蛋白(SantaCruz)?？贵w點(diǎn)樣抗體以100(ig/ml的濃度溶于40%glycerol、60%PBS、pH7.5，用Arrayer(Cartesian)點(diǎn)沖羊在醛載3皮片上。在室溫下在潮濕的小室中保溫3小時(shí)后，載玻片在含有1%BSA(w/v)的PBS溶液pH7.5中在室溫下保溫1小時(shí)，同時(shí)溫和攪拌。蛋白質(zhì)的生物素化生物素-NHS以50mg/l溶于雙蒸水。添加10ul這種溶液至母體血清蛋白溶液(5mg/ml溶于10mMPB,pH8.5),在搖床上保溫3小時(shí)。加入5ul乙醇胺以終止反應(yīng)。生物素化的蛋白質(zhì)在200ulTNB緩沖液中稀釋，添加到抗體陣列中，在4。C保溫過夜。在TNT緩沖液中洗三次后，添加鏈霉抗生物素蛋白-HRP,在室溫下保溫30分鐘。用Cy5-酪胺鹽(tyramide)熒光檢測抗原-抗體相互作用。載玻片在PE熒光掃描機(jī)上掃描用于定量。對照和感染載玻片的圖像用圖像分析程序相互重疊，以生成相對豐度的偽彩色圖像。結(jié)果顯示于圖9，其為蛋白質(zhì)陣列的偽彩色圖像，顯示相應(yīng)蛋白質(zhì)與它們的抗體的結(jié)合。綠色代表感染樣品，紅色代表對照樣品。第二部分是陣列的放大區(qū)域，顯示鉤粒蛋白表達(dá)(綠色)在感染血清樣品中較高。第三部分是calgranulinIP的Western印跡，顯示在感染羊水樣品中類似地發(fā)生表達(dá)提實(shí)施例12進(jìn)一步分析在感染羊水的獨(dú)特診斷信號中表示的蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示對照和感染羊水的SELDI-TOF語顯示10-12KDa質(zhì)量范圍的獨(dú)特信號(圖l、2和3),其代表感染陽性樣品。在1-D凝膠上解析的對照和感染羊水(圖5)也顯示10-12KDa質(zhì)量范圍的條帶，該條帶在合并或單個(gè)感染羊水樣品中更豐富。分離這些1-D凝膠條帶，進(jìn)一步利用LCQ-MS如圖13所示分析，鑒定代表IGF-BR-1和S-100鈣結(jié)合蛋白的肽。使用抗IGF-BP1抗體如圖8所示進(jìn)行對照和感染羊水的Western印跡分析，也顯示在感染中蛋白水解片段(11KDa)的差異表達(dá)。對羊水多肽的測序也鑒定了在感染羊水中IGF-BP1和鈣粒蛋白的存在(表3)。所鑒定的IGFBP-1的新的蛋白水解片段的序列顯示于圖12(SEQIDNO:1)。在該圖中，在對感染羊水進(jìn)行1-D凝膠電泳、胰蛋白酶消化和MS/MS分析后，在樣品"0426seq_HI—12"和"0425seq_HI-113"中發(fā)現(xiàn)的肽序列用小寫字母顯示(SEQIDNo:2和3)。對感染羊水進(jìn)行胰蛋白酶消化得到10.5-12KDa條帶，對其進(jìn)行1-D凝膠(低分子量范圍，圖5)、Western印跡(圖6)、和MS/MS分析(圖13),檢測到的IGF-BP-1的蛋白水解片段在下劃線序列區(qū)域中表示(SEQIDNO:4)。的確，MS/MS分析和順序檢索結(jié)果顯示，圖13所示質(zhì)語中母離子434.89代表IGF-BP-1序列(RSPGSPEIR)，其也在圖12的IGF-BP-1蛋白水解片段的序列圖中顯示。母離子1082.97代表S-100鈣結(jié)合蛋白(即鈣粒蛋白A和B),其也獨(dú)立地通過羊水的從頭測序鑒定(表2和3)。圖14顯示圖13所示的17.55-18.21分鐘保留時(shí)間峰的質(zhì)謙。很明顯優(yōu)勢峰出現(xiàn)在質(zhì)量434.9。圖15顯示圖14所示434.9峰的母離子的MS/MS鐠。根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索，母離子對應(yīng)于IGFBP-1的部分序列。實(shí)施例13表征染色體非整倍性的診斷譜使用母體血清篩選，考查蛋白質(zhì)組學(xué)譜的用途，來更準(zhǔn)確地鑒定21三體型。利用一組祐:較好表征的母體血清樣品(對照(11=6)，21三體型(n=6)和18三體型(n=4))(用標(biāo)準(zhǔn)染色體作圖方法檢驗(yàn)同一病例的匹配羊水樣品，確認(rèn)三體型的存在)，如上所述利用SELDI-TOF方法學(xué)分析子宮內(nèi)感染才莫型。圖IO顯示在母體血清中有差異的蛋白質(zhì)表達(dá)才莫式，獨(dú)特的譜區(qū)分了三體型。如方法中所描述的，使用l微克的母體血清(利用蛋白質(zhì)分離柱，BioRadtechnologies,除去白蛋白和免疫球蛋白后)來進(jìn)行與化學(xué)上限定的正相親水芯片陣列結(jié)合的母體血清提取物的SELDI-TOF分析。在235-激光強(qiáng)度收集的整個(gè)譜顯示在峰強(qiáng)度上的差異。A)對照血清；B)21三體型(唐氏)血清；C)18三體型血清。詳細(xì)的譜顯示對每一種情況獨(dú)特的在4-15KDa區(qū)域的差異。箭頭顯示診斷峰，其可組合使用，以形成開發(fā)診斷性篩選測試的算法。實(shí)施例14用于人CVF全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析的規(guī)程^^品收桌fp^^工該研究經(jīng)俄勒閃健康與科學(xué)大學(xué)(OregonHealth&ScienceUniversity)IRB委員會批準(zhǔn)。所有的受試者都前瞻性(prospectively)地加以確定，知情書面同意參與該研究。錄取七個(gè)受試者，平均胎齡(GA)18.5周，標(biāo)準(zhǔn)差+/-2.1周。在無菌窺器檢查時(shí)將2個(gè)無菌6英寸帶Dacron尖端的塑料涂藥器(Solon，Skowhegan,ME)放入后陰道官窿，收集CVF樣品。收集后，蛋白質(zhì)被^是耳又入含有蛋白酶抑制劑混合物(proteaseinhibitorcocktail)(RocheDiagnostics,Alameda,CA)的磷酸鹽緩沖鹽水。提取后離心樣品，以除去任何碎片和細(xì)胞材料，上清液存儲在-70。C。通過組合胎齡匹配的樣品(胎齡16-18周，19-21周)制備兩個(gè)合并的樣品(每種合并11=3)。來自每個(gè)合并樣本的總共H0嗎蛋白質(zhì)用丙酮沉淀，溶于10mMTris、pH8.5，用于2D-LC分析。來自兩個(gè)單個(gè)樣品的每種100)ig用于一維凝膠電泳(1DGE)。二舉濕初悉遵gp-丄C)來自每一合并樣本的530嗎蛋白質(zhì)被干燥，溶于100(il含有8M尿素、1MTris石咸、100mM曱胺和10mMCaCl2(pH10.5)的消化緩沖液中。樣品首先在50。C在12.5pl的0.9MDTT中保溫15分鐘，然后在25pl的1.0M石典乙酰胺中在室溫下黑暗中再保溫15分鐘，以還原和烷基化樣本。額外向溶液中添加12.5^10.9MDTT和210jil水、lNNaOH,以調(diào)整pH至8.5。樣品用40(il的lmg/ml胰蛋白酶(Promega)儲備溶液37。C過夜消化。用40pl的曱酸終止消化，用C18SepPakPlus柱體脫鹽。消化物(lml)被注射到聚磺酸乙基強(qiáng)陽離子交換柱上(2.1-mmIDxlOOmm,5卞m粒度和300-A孔徑大小(TheNestGroup,Southborough,MA),用裝備有UV檢測器和餾分收集器的HPLC分級分離。溶劑A是含有25。/。乙腈(ACN)的10mM磷酸鉀(pH3)，溶劑B是含有25。/。ACN的10mM磷酸鉀(pH3)、350mMKCl。肽分級分離使用95分鐘梯度，流速200[i1/分。總共收集80個(gè)級分，蒸發(fā)，再懸浮在100inl的0.P/()TFA中，用96孔VydacC18silicaspinplate(TheNestGroup,Southborough，MA)脫鹽。級分在80%ACN/0.1。/。曱酸(FA)中洗脫，蒸發(fā)，再懸浮在20(il的50/。FA中，每種級分5ji1在連接到CapLC(Waters，Milford，MA)的Q-Tof-2質(zhì)譜儀上分析。一舉〃-A)凝i^泳#浙來自兩個(gè)樣品中每個(gè)樣品的100iug蛋白質(zhì)用碘乙酰胺還原，在Tris-tricine、10-20。/。梯度SDS-PAGE凝膠上分析。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色。每個(gè)泳道切成25個(gè)單獨(dú)的條帶，脫色，37。C在凝膠中用胰蛋白酶消化24小時(shí)。肽用碳酸氬銨提取，然后用0.22(xmMultiScreen濾板(Millipore,Billerica，MA)過濾。濾過的溶液干燥，在5%曱酸中復(fù)原，在裝備CapLC的Q-Tof-2質(zhì)語儀上(Waters,Inc.,Milford，MA)分析。用NanoeaseC1875卞mIDx15-cm熔凝硅石毛細(xì)管柱(WatersInc.,Milford,MA)95分鐘水/ACN梯度進(jìn)一步分離2D-LC級分和凝膠消化物。質(zhì)譜儀用Glu1FibrinopeptideB校準(zhǔn)。使用MS/MSMS測定法獲得語。掃描m/z400到1500的質(zhì)量，用于MS測量，掃描m/z到1900的質(zhì)量，用于MSMS。從2D-LC級分總共獲得10,824個(gè)MS/MS譜。原始MS/MS語用ProteinLynxGlobalServerv.2.1軟件(WatersInc.,Milford,MA)預(yù)處理。圖16A和B顯示蛋白質(zhì)和肽鑒定工藝流程。來自2D-LC樣品或1DGE樣品的原始MS/MS譜通過對原始數(shù)據(jù)選擇單一同位素峰(de-isotoping)和質(zhì)心化(centroiding)來進(jìn)一步加工。來自樣品不同級分的預(yù)處理的MS/MS譜被合并用于進(jìn)一步分析。通過將合并的MS/MS譜與含有已知污染物的組合匹配，鑒定出存在于樣品中的肽。用三種相互獨(dú)立的搜索引擎TurboS叫uest(ThermoFinnigan,Waltham，MA)、X！Tandem和OpenSea進(jìn)行肽標(biāo)示4企索。Sequest和X！Tandem是數(shù)據(jù)庫檢索引擎，將實(shí)驗(yàn)譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫經(jīng)假設(shè)性的酶消化生成的理論語匹配。OpenSea是基于從頭序列的搜索引擎，在不精確的從頭序列和數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列之間進(jìn)行容錯(cuò)匹配。峰軟件(BioinformaticsSolutions,Ontario,CA)被用來向OpenSea搜索引擎提供從頭序列。樣品加工的還原和烷化步驟在蛋白質(zhì)所有的半胱氨酸殘基上引入固定的carbamidomethylation修飾。因此，所有的程序都被設(shè)定成使用修飾的半胱氨酸質(zhì)量(160.03Da)作為所有半胱氨酸殘基的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量。從頭測序儀以及所有搜索引擎被設(shè)定成使用單同位素質(zhì)量來計(jì)算母離子和碎片離子質(zhì)量。峰軟件被設(shè)定成分別使用0.2Da和0.1Da作為母離子和碎片離子質(zhì)量公差。Peaks軟件對每個(gè)MS/MS譜報(bào)導(dǎo)的前五個(gè)候選從頭序列被提供給OpenSea用于容錯(cuò)數(shù)據(jù)庫匹配。OpenSea被設(shè)定成用0.25Da作為碎片離子質(zhì)量公差。對于Sequest檢索，用的母離子質(zhì)量公差2.0Da來計(jì)算母離子質(zhì)量。X！Tandem被設(shè)定成母離子和碎片離子分別使用0.5Da和0.25Da的質(zhì)量公差。為了加速S叫uest檢索，不將其設(shè)定為搜索任何可變修飾。然而，根據(jù)我們在前的經(jīng)驗(yàn)，X！Tandem和OpenSea被設(shè)定成檢索可變修飾(即曱硫氨酸的氧化、在N末端形成焦谷氨酸、氮末端的氨基曱?；?、內(nèi)部絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基的脫水、和谷氨酰胺和天門冬酰胺的脫酰胺基中間產(chǎn)物)，其或者作為樣品加工的假象、或者由于肽破碎機(jī)制而已經(jīng)存在于MS/MS語中。用Scaffold(版本1.3.2，ProteomeSoftware,Portland,OR)中運(yùn)行的概率性蛋白命中算法將來自單個(gè)搜索引擎的肽表示合并成蛋白質(zhì)標(biāo)示。具有至少一個(gè)獨(dú)特的、高度可信(概率^).9)的肽命中的蛋白命中被認(rèn)為可能存在于樣品中。如果一個(gè)蛋白質(zhì)用三個(gè)高度可信的獨(dú)特肽采樣(hits)在至少一個(gè)樣品中被可靠地鑒定，該蛋白質(zhì)不需手工證實(shí)就被收錄入綜合目錄。不滿足這一濾過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)用手工證實(shí)。利用參考文獻(xiàn)中所列的所有標(biāo)準(zhǔn)(Wilmarth,P.A.etal.,JProteomeRes2004,3,(5),1017-23),天冬氨酸C末端的破碎增強(qiáng)(Gu,C.,etal.，AnalChem2000,72,(23),5804-13)、每當(dāng)脯氨酸、絲貞氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸存在于肽序列中時(shí)低質(zhì)量immonium離子(脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸)的存在來進(jìn)行手工證實(shí)。實(shí)施例15人宮頸陰道體(CVF)的全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析分析遵循實(shí)施例14描述的規(guī)程，利用兩種不同的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù):2D-LC和1DGE,分析人CVF。胰蛋白酶消化兩個(gè)合并的樣品，進(jìn)行SCX分級分離，產(chǎn)生總共40個(gè)級分。兩個(gè)單個(gè)樣品用1DGE分級分離，產(chǎn)生的條帶進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。通過在LC-ESI-qTOF質(zhì)譜儀上分析所有級分，收集總共27,397個(gè)MS/MS語。所有的MS/MS譜用Sequest、X！Tandem和OpenSea檢索。用Scaffold將來自所有程序的肽命中組裝成蛋白命中。當(dāng)使用可能性最低的肽識別概率閾(0.2)時(shí)，單個(gè)肽命中水平上總共831個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定。鑒定的蛋白質(zhì)中30%是假陽性命中(反向數(shù)據(jù)庫條目)。列表中也存在若干蛋白質(zhì)同種型和作為其它蛋白質(zhì)子集的蛋白質(zhì)。此外，低得分(肽識別概率<0.9)的肽命中沒有顯示通過方法一節(jié)所列的人工確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)所需的特征。大比例(54%)的蛋白質(zhì)采樣也是單個(gè)肽命中。既然單個(gè)肽蛋白命中很可能是假陽性的，因此不足以進(jìn)行蛋白質(zhì)定量和推斷病理性生物功能，將肽標(biāo)示概率0.9建立為最低標(biāo)準(zhǔn)，以僅考慮高度可信的肽和蛋白命中。筒并蛋白命中被集中在一起并報(bào)告為一個(gè)條目，任何是其它蛋白質(zhì)的子集的蛋白質(zhì)都從分析中排除。在進(jìn)行上述過濾之后，來自所有實(shí)驗(yàn)的總共206個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)被作圖到55。/。的實(shí)驗(yàn)性MS/MS語上。該列表中分別有3%和15%的被鑒定的蛋白質(zhì)是假陽性命中和單個(gè)肽命中。除去污染物例如角蛋白、胰蛋白酶和牛酪蛋白之后，余留總共177個(gè)蛋白。在至少一個(gè)實(shí)驗(yàn)中具有至少三個(gè)獨(dú)特肽采樣的105個(gè)蛋白無需進(jìn)一步手工證實(shí)就被接受。余下的蛋白命中用方法一節(jié)中列舉的標(biāo)準(zhǔn)手工證實(shí)。另外的45個(gè)蛋白通過了手工證實(shí)；它們中的29個(gè)具有至少2個(gè)獨(dú)特肽采樣，16個(gè)具有單個(gè)肽采樣。這使得用至少2個(gè)獨(dú)特肽采樣加以鑒定的蛋白的數(shù)目提高到134個(gè)，具有至少一個(gè)獨(dú)特肽采樣的蛋白的數(shù)目提高到150。為了保證蛋白命中的可靠性，所有檢索都用組合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，該數(shù)據(jù)庫被構(gòu)建成在前向序列的末端附加有數(shù)據(jù)庫的反向條目。通過所有蛋白命中標(biāo)準(zhǔn)的反向數(shù)據(jù)庫條目的數(shù)目被認(rèn)為反映了方法一節(jié)中所列的蛋白命中標(biāo)準(zhǔn)的可靠性。既然沒有反向條目滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，該蛋白命中的可靠性被估計(jì)成100%。MS/MS譜計(jì)數(shù)通常被認(rèn)為是測量蛋白豐度的敏感和半定量的方法(Old,W.M.,etal"MolCellProteomics.2005,4，(10),1487-502.Epub2005Jun23)。然而，同源蛋白由于它們的高序列相似性而給精確MS/MS譜計(jì)數(shù)表示法帶來了更大的問題。為了避免同源蛋白MS/MS譜計(jì)數(shù)的夸張或壓縮，進(jìn)行最終水平的過濾，來組合序列同源性大于50%的蛋白同系物的MS/MS譜計(jì)數(shù)。例如，鱗狀細(xì)胞癌1和2抗原的序列同源性大于90%。雖然我們鑒定到提示這兩種蛋白在樣品中存在的肽采樣，它們的MS/MS譜計(jì)數(shù)被組合到一起，表示為單個(gè)條目。按照這一標(biāo)準(zhǔn)被組合的蛋白有IGHA1和IGHA2、IGHG1、IGHG2和IGHG4、SCCA1和SCAA2、和SPR2A、SPR2B、和SPR2D。相互之間不具有高序列同源性的蛋白所都具有的肽MS/MS譜計(jì)數(shù)被認(rèn)為傾向于很可能(更多的肽采樣數(shù)目)存在于樣品中的蛋白。最后，通過組合蛋白在所有實(shí)驗(yàn)中各MS/MS譜計(jì)數(shù)，建立每個(gè)蛋白的組合MS/MS譜計(jì)數(shù)。該組合MS/MS譜計(jì)數(shù)用MS/MS譜的總數(shù)(12,827)來歸一化，該總數(shù)在所有實(shí)驗(yàn)中以單個(gè)肽概率閾0.9與非污染物蛋白相匹配。歸一化的語計(jì)數(shù)不是嚴(yán)格定量的，但是它們可用于估計(jì)存在于樣品中的蛋白相對于彼此的相對豐度。具有至少2個(gè)獨(dú)特肽采樣、并且通過手工證實(shí)的最終134個(gè)蛋白按照它們歸一化MS/MS語計(jì)數(shù)的降序列在附加的表4上。乂CFF蛋^I遂具有在人CVF中發(fā)現(xiàn)的至少2個(gè)肽命中的蛋白用它們的SwissProt/TrEmbl登記號&和說明加以列表。同源的蛋白命中作為單個(gè)條目被集中在一起。利用SwissProt網(wǎng)站上的CalPI/MW工具(Gasteiger,E.etal.，NucleicAcidsRes2003,31，(13),3784-8)計(jì)算理論上的PIsb和單同位素分子量(monoisotopicmolecularweights)c。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(Dennis,G.,Jr.etal.,GenomeBiol2003，4,(5),P3)生物信息學(xué)資源進(jìn)行功能性評注d。來自1DGE和2D-LC實(shí)驗(yàn)的每一蛋白命中的組合譜計(jì)數(shù)用在所有樣品中以0.9的單個(gè)肽概率閾匹配的MS/MS譜的總數(shù)(12,827)(非污染物蛋白)來歸一化。該表中的蛋白按照漸減的歸一化譜計(jì)數(shù)排列?；蛘咴谘蛩?A)和/或在血清(S)中出現(xiàn)的蛋白也凈皮相應(yīng)地標(biāo)記。16種具有單個(gè)肽采樣、并通過手工證實(shí)的蛋白按照組合MS/MS譜計(jì)數(shù)的降序被列在附加的表5中。因此，在表5中，在人CVF中發(fā)現(xiàn)的、通過方法一節(jié)中所列的手工確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的單個(gè)肽蛋白命中用它們的SwissProt/TrEmbl登記號和說明加以列舉。同源蛋白命中被集合成單個(gè)條目。利用SwissProt網(wǎng)站上的CalPI/MW工具計(jì)算理論上的PIsb和單同位素分子量c。利用DAVID數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)資源進(jìn)行功能性評注d。表中的蛋白質(zhì)按照1DGE和2D-LC實(shí)驗(yàn)中每個(gè)蛋白命中的組合譜計(jì)數(shù)c的降序加以排列?；蛘咴谘蛩?A)和/或血清(S)中出現(xiàn)的蛋白f也被相應(yīng)地標(biāo)記(參見討論)。表4和5中所列的蛋白質(zhì)才艮據(jù)DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery(DAVID)的分類來就其功能加以評注(Dennis,G.,Jr.,etal.,GenomeBiol2003,4,(5),P3)。在本研究中發(fā)現(xiàn)的CVF蛋白質(zhì)與高度可信的HUPO血漿蛋白質(zhì)組(Anderson,N.L.etal"MolCellProteomics2004,3,(4)，311-26;States,D.J.etal.,NatBiotechnol2006，24,(3),333-8)和羊水蛋白質(zhì)組(Park,S.J.etal.,Proteomics2006,6,(1),349-63;Michel,P.E.etal"Electrophoresis2006,27,(5-6)，1169-81)互相參照。只要可能就將IPI數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)登記號轉(zhuǎn)換成SwissProt/TrEmbl蛋白質(zhì)登記號和除去常見的污染物如角蛋白，從而使HUPO血漿蛋白質(zhì)組進(jìn)一步校正(curated)。由于缺乏能分辯不同的同種型的直接MS/MS語證據(jù)，在HUPO血漿蛋白質(zhì)組中報(bào)告的蛋白質(zhì)同種型被擠入單個(gè)蛋白質(zhì)條目。校正的HUPO血漿蛋白質(zhì)組(526個(gè)蛋白質(zhì))與Andersonetal.2004見上所列的195個(gè)蛋白質(zhì)組合，構(gòu)成非冗余的、高度可信的HUPO血漿蛋白質(zhì)組(數(shù)據(jù)未顯示)。在相應(yīng)表中的最后一欄中，CVF蛋白命中根據(jù)它們的SwissProt/TrEmbl蛋白質(zhì)注釋與校正的HUPO血漿蛋白質(zhì)組和羊水蛋白質(zhì)組比較，并被相應(yīng)地標(biāo)記(A-在羊水中發(fā)現(xiàn)，S-在血清中發(fā)現(xiàn))。討論2D-LC技術(shù)已知與傳統(tǒng)的基于凝膠的電泳法相比能提高分級分離。圖17顯示來自2D-LC分級分離的每個(gè)SCX級分鑒定的獨(dú)特肽的數(shù)目。無疑地，當(dāng)與RP-HPLC結(jié)合時(shí)，該技術(shù)的增強(qiáng)的分級分離能力有助于命中每個(gè)SCX級分中更大數(shù)量的獨(dú)特肽，以及在總體上導(dǎo)致樣品中大量蛋白命中。最近的研究表明，利用多個(gè)搜索引擎可以充分表征MS/MS數(shù)據(jù)集，來鑒定數(shù)據(jù)集中的肽，(Resing,K.A.etal.，AnalChem2004，76,(13),3556-68)。當(dāng)用不同的搜索引擎來鑒定數(shù)據(jù)集中的肽時(shí)，由于相應(yīng)搜索引擎中被編碼的直觀推斷法的差異，它們鑒定不同組的MS/MS譜。因此，在同一數(shù)據(jù)集上的不同的搜索引擎結(jié)果的組合產(chǎn)生肽命中的更為綜合的列表。在本研究中，我們使用了三種不同的搜索引擎Sequest、X!Tandem和OpenSea，來鑒定存在于樣品中的肽。使用這種組合的方法，我們能鑒定在其中一個(gè)2D-LC實(shí)驗(yàn)中獲得的MS/MS譜中的59%。譜命中的百分比在三個(gè)程序之間的分配(超過相應(yīng)程序的得分截止值)(圖18A)顯示只有38。/。的譜被所有三個(gè)程序所鑒定，而21%的譜只唯一地通過一個(gè)程序被鑒定。有趣的是，15%的譜只被OpenSea搜索引擎所鑒定。這是由于OpenSea具有鑒定帶遺漏的碎片離子和意外序列修飾的語的能力。由于組合檢索技術(shù)，也提高了在樣品中鑒定的候選蛋白質(zhì)的總數(shù)。在如圖18B所示總共118個(gè)候選蛋白命中當(dāng)中，66%用所有三個(gè)程序被鑒定出來，而13%只唯一通過一個(gè)程序被鑒定出來。因此，本研究中所使用的組合檢索技術(shù)鑒定出來自數(shù)據(jù)集的更多的肽和候選者蛋白命中。各種體液的組成，特別是妊娠期間的CVF,隨時(shí)間變化。圖19顯示來自2D-LC實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中鑒定的蛋白質(zhì)之間的重疊。69%的蛋白質(zhì)在兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都鑒定到，而31%的蛋白質(zhì)只在其中一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中鑒定到。這并非出乎意料，因?yàn)閮蓚€(gè)樣品胎齡相差2周。質(zhì)譜儀對低豐度蛋白質(zhì)的隨機(jī)抽樣可能也導(dǎo)致以上差異。在65個(gè)通過1DGE技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)鑒定的蛋白質(zhì)當(dāng)中，69%在兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都鑒定到了，而31%只在其中一個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中被唯一地鑒定到。這凸顯了當(dāng)表征蛋白質(zhì)組時(shí)應(yīng)該有生物學(xué)和技術(shù)上的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的重要。圖20中概括了蛋白命中數(shù)目隨著向分析中添加實(shí)驗(yàn)而產(chǎn)生的總體增加。當(dāng)使用單個(gè)1DGE實(shí)驗(yàn)時(shí)，用我們的蛋白命中標(biāo)準(zhǔn)鑒定出總共40個(gè)蛋白質(zhì)。當(dāng)在分析中分別增加一個(gè)1DGE技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)、2D-LC實(shí)驗(yàn)和其相應(yīng)的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別觀察到蛋白命中增加了15、69和16個(gè)。這是頭一個(gè)使用各種分析程序、技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)、生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)性方法來表征人CVF蛋白質(zhì)組的全面蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過揭示大量先前不知道存在于CVF中的蛋白質(zhì)，本研究中所應(yīng)用的組合蛋白質(zhì)組學(xué)方法表征了妊娠期間CVF的蛋白質(zhì)組學(xué)組成。表4和5列出了存在于CVF中涉及生殖區(qū)域穩(wěn)態(tài)和胎兒保護(hù)的全面的蛋白質(zhì)組。表4中所列蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽譜顯示于圖21。89%以上的蛋白質(zhì)具有至少2個(gè)獨(dú)特肽命中。肽譜還顯示CVF含有各種蛋白質(zhì)，其具有寬范圍的胰蛋白酶肽生產(chǎn)物。圖22顯示妊娠期間CVF蛋白質(zhì)組的功能分類。CVF中的主要功能群體是免疫和防衛(wèi)相關(guān)分子(例如鈣粒蛋白A和B)和新陳代謝分子(從蛋白酶如組織蛋白酶B和G,到侶伴蛋白如HSP90-a)。本研究中發(fā)現(xiàn)的免疫應(yīng)答蛋白質(zhì)分成三種類型親炎癥應(yīng)答分子(pro-inflammatoryresponsemolecules)，#元炎應(yīng)答分子(anti-inflammatoryresponsemolecules)和抗微生物分子。除了通常存在的免疫球蛋白以外，在CVF中發(fā)現(xiàn)的最著名的親炎癥性應(yīng)答分子是兩種來自S100家族的鈣結(jié)合蛋白鈣粒蛋白A和B。這些蛋白質(zhì)在CaW離子介導(dǎo)下形成異二聚體，通常涉及急性期炎癥應(yīng)答和慢性炎癥應(yīng)答(Kerkhoff,C.etal.，BiochimBiophysActa1998,1448,(2)，200-11)。當(dāng)與白蛋白相比時(shí)，這些蛋白質(zhì)在對照CVF樣品中的相對豐度(表4)提示它們在對抗陰道感染中的重要作用。有趣的是注意到鈣粒蛋白A和B還在IAI的羊水內(nèi)發(fā)現(xiàn)(Gravett,M.G.etal.，Jama2004,292，(4),462-9.;Ruetschi,U.etal"JProteomeRes2005,4,(6),2236-42)，其可導(dǎo)致過兒免疫排斥、或?qū)τ诒苊庀日鬃影B是極重要的(Lachapelle，M.H,etal.,JImmunol1996,156,(10)4027-34;Borzychowski,A.M.etal"EurJImmunol2005，35，(10)，3054-63)。我們在CVF中檢測到的幾種蛋白質(zhì)，最顯著的是白細(xì)胞介素l受體拮抗劑(ILl-ra)和熱休克蛋白70kDa(HSP70)，屬于當(dāng)在妊娠期間表達(dá)時(shí)幫助下調(diào)免疫應(yīng)答的那組分子。與陰道感染糾纏在一起的HSP70妊娠期間分泌入CVF,誘導(dǎo)ILl-ra的表達(dá)(Genc，M.R.etal"AmJObstetGynecol2005,192，(3),916-21)。大概，這是盡管存在感染的不良作用，但仍在免疫調(diào)節(jié)水平上保護(hù)妊娠的機(jī)制?？刮⑸锏鞍踪|(zhì)在防止陰道被細(xì)菌和真菌病原體感染中起重要作用。我們在CVF中檢測到中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素(NeutrophilDefensin)l(防衛(wèi)素家族)和乳運(yùn)鐵蛋白，其已知具有抗菌性質(zhì)，能保護(hù)陰道不被像淋病奈瑟氏菌(Neisseriaegonorrhoeae)禾口HSV感染(MasCasulloetal.,見上)，從而證實(shí)了先前的報(bào)導(dǎo)(MasCasullo,V.etal，ViralImmunol2005，18，(4),595-606)。另外，我們也檢測到幾種來自組蛋白家族的蛋白質(zhì)(H4、H2A、H2B、和H1.2)。傳統(tǒng)上，組蛋白被認(rèn)為是涉及核內(nèi)染色質(zhì)排列的胞內(nèi)蛋白質(zhì)。然而，最近的研究顯示分泌的neutrophilextracellulartraps(NET)含有纟且蛋白(Brinkmann，V.etal.,Science2004,303,(5663)，1532-5;Buchanan,J.T.etal.,CurrBiol2006，16,(4),396-400),而且分泌的組蛋白具有廣泛的抗菌性質(zhì)(Venkataraman,N.etal"JImmunol2005,175,(11),7560-7;Silphad腿g,U.etal"BiochemBiophysResCommun2006，340，(2)，648-55;Jacobsen,F.etal"JAntimicrobChemother2005,55,(5),735-41;Kim,H.S.etal.,JImmunol2002,168,(5),2356-64;Rose,F.R.etal.，InfectImmun1998,66,(7),3255-63)。4全測到廣泛的親炎癥和抗炎應(yīng)答分子，以及各種的抗微生物分子，提示CVF具有復(fù)雜的先天免疫應(yīng)答環(huán)境。在本研究中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)中的一個(gè)很大比例(32%)涉及各種新陳代謝活性(圖22)，如炎癥調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)降解和蛋白酶抑制。在我們所觀察到的炎癥調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)當(dāng)中，有熱休克蛋白90-a(HSP90-A)、緩激肽(激肽原l前體)和激肽釋放酶(激肽釋放酶l1和13前體)。HSP90-A近來已經(jīng)被報(bào)道涉及細(xì)胞介導(dǎo)的親炎癥性緩激肽-激肽釋放酶復(fù)合物的活化(Joseph,K.etal.,ProcNatlAcadSciUSA2002,99,(2)，896-900)。這種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫已經(jīng):帔顯示在阻止感染女性下生殖道的病原體中是關(guān)4定因素(Pudney,J.etal.，BiolReprod2005，73,(6),1253-63)。蛋白酶和蛋白酶抑制劑之間的平衡對于保持健康組織是關(guān)鍵的，不平衡常常導(dǎo)致嚴(yán)重的宮頸上皮病理。在我們在CVF中觀察到的幾種蛋白酶和抗蛋白酶中，有意思的一對是組織蛋白酶B和al抗胰蛋白酶(A1AT)。在宮頸癌中，組織蛋白酶B在CVF中的水平升高，而A1AT的水平無變化(Bh扁rahamurthy，V.etal"MolCellBiochem1995，144，(1)，35-43;Makarewicz,R,etal.，Neoplasma1995,42,(1),21-4;Benitez-Bribiesca,L.etal"ArchInvestMed(Mex)1980,11,(4),523-45)。因此，宮頸中蛋白酶和抗蛋白酶表達(dá)之間的不平衡能導(dǎo)致擴(kuò)散性宮頸癌。在CVF中檢測到上述新陳代謝蛋白質(zhì)提示CVF含有調(diào)節(jié)從調(diào)節(jié)炎癥性應(yīng)答到保持宮頸組織健康在內(nèi)的各種功能的酶。除了免疫應(yīng)答和新陳代謝的蛋白質(zhì)之外，我們還發(fā)現(xiàn)幫助細(xì)胞分化(11%)、運(yùn)輸(9%)、細(xì)胞組織(8%)、酶調(diào)節(jié)(6°/。)、信號轉(zhuǎn)換(3%)和細(xì)胞增殖(3%)的蛋白質(zhì)。一種蛋白質(zhì)可以具有多種功能，取決于它的環(huán)境。例如，根據(jù)DAVID功能注釋工具，組蛋白被分類成涉及細(xì)胞組織的蛋白質(zhì)。然而，如早先所討論的，當(dāng)分泌到細(xì)胞外時(shí)，它們還具有抗菌性質(zhì)。因此，在妊娠期間在CVF中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)其它蛋白的作用仍然不清楚，需要進(jìn)一步的研咒。在本研究之前，妊娠期間天然存在于CVF中的蛋白質(zhì)的相對豐度在很大程度上未知。表4中的蛋白質(zhì)按照它們歸一化譜計(jì)數(shù)的降序排列。在我們的分析中的IgG/IgA蛋白質(zhì)豐度的一般比例與先前的研究很好地吻合(Mestecky,J.etal.,AmJReprodImmunol2005,53，(5),208-14)。有意思的是注意到CVF和血清的蛋白質(zhì)豐度譜差別很大。在15種最豐富的CVF蛋白質(zhì)當(dāng)中，6種蛋白質(zhì)已知在血清中或者不天然存在和/或低豐度(鱗狀細(xì)胞癌抗原、鈣粒蛋白A和B、小的富含脯氨酸的蛋白3、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白和粘蛋白5B)(Anderson,N.L.etl.,MolCellProteomics2004,3,(4)、311-26;Wilmarth，P.A.etal.，JProteomeRes2004，3,(5),1017-23;Qin,S.etal.，Proteomics2005，5,(12),3183-92;KatzA.B.etal"JInvestDermatol1999,112,(5),818-21)。此外，在血清中已知具有中等豐度的蛋白質(zhì)(補(bǔ)體因子C4、補(bǔ)體因子H、和載脂蛋白A-l)被發(fā)現(xiàn)在CVF中是低豐度的(Andersonetal.,見上)。檢查表4提示，CVF中前10名最豐富蛋白質(zhì)中的40%是炎癥應(yīng)答分子。這進(jìn)一步支持如下論斷CVF具有有效和積極的細(xì)胞因子應(yīng)答系統(tǒng)，以對付病理發(fā)生。進(jìn)行羊水、血清和CVF蛋白質(zhì)組之間重疊的定量分析，表4和表5的最后一欄表示在羊水(A)和血清(S)中也觀察到的CVF蛋白質(zhì)。已知活躍的血清運(yùn)輸和局部合成是宮頸血清蛋白的來源(Bard,E.etal.,JImmunoassayImmunochem2002,23，(2),145-62)。我們發(fā)現(xiàn)了slgA復(fù)合物，其在宮頸中局部合成，從而證實(shí)了這一點(diǎn)(Hocini，H.etal.，ScandJImmunol1995，42,(2),269-74)。此外，我們在CVF中檢測到若干豐富的血清蛋白(Anderson,N.L.etal.，見上；States,D.Jetal.，見上；Bard,E.etal.,見上)，如血清白蛋白、a-1-抗胰蛋白酶前體、載脂蛋白A1前體、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳運(yùn)鐵蛋白、載脂蛋白A1前體、a-2-HS糖蛋白、Igyl，2和4鏈C區(qū)域、和卩-2糖蛋白l前體。有意思的是，我們還;f企測到若干在羊水中、而不是在血清中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，如小的富含脯氨酸的蛋白3、CD59糖蛋白前體、胱抑蛋白A、胱抑蛋白B、角質(zhì)蛋白(comifin)A、內(nèi)披蛋白(involucrin)、碌^氧還蛋白。絨毛膜蛻膜的平行分泌可能是CVF中這些蛋白質(zhì)的來源。在所有三種生物液體中都存在的蛋白質(zhì)當(dāng)中，A1AT和血漿銅藍(lán)蛋白(銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)已知具有診斷重要性。母體的陰道分泌物和血清中血漿銅藍(lán)蛋白豐度與過早破膜(PROM)的發(fā)生率之間反相關(guān)(Ogino,M.etal.，JObstetGynaecolRes2005,31,(5),421-6;Kiilholma,P.etal.GynecolObstetInvest1984,17,(4),194-201)，血清中A1AT表達(dá)增加也已經(jīng)與宮頸癌癥相關(guān)(Benitez-Bribiesca，L.;etal.,ArchInvestMed(Mex1980,11,(4),523-45)。這提示對容易獲得的體液如CVF或血清進(jìn)行系列評定可用于母體和胎兒健康診斷?？傊覀兝枚鄠€(gè)生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)、用于蛋白質(zhì)和肽分級分離的多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)來運(yùn)用組合蛋白質(zhì)組學(xué)方法，并且在本研究中使用了多種數(shù)據(jù)采集搜索引擎來表征CVF蛋白質(zhì)組。這一多路方法鑒定出一大組先前不知道存在于CVF中的蛋白質(zhì)。對CVF蛋白質(zhì)組的功能分類提示存在各式各樣在對抗病原體和保護(hù)胎兒中扮演重要作用的細(xì)胞因子應(yīng)答蛋白質(zhì)。對血清、羊水和CVF蛋白質(zhì)組之間的重疊進(jìn)行定量分析鑒定了妊娠期間存在于CVF中的若干血清和羊水蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中有些蛋白質(zhì)的差異表達(dá)已經(jīng)與過早破膜和宮頸癌癥聯(lián)系到一起。然而，妊娠期間在CVF中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)新蛋白質(zhì)的確切作用仍然不清楚，需要多方面的進(jìn)一步研究。大規(guī)模高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對于增加我們對于妊娠期間CVF蛋白質(zhì)組的了解、將其發(fā)展為監(jiān)視母體和胎兒健康的潛在診斷工具是不可缺少的。實(shí)施例16整體分析非人靈長類CVF蛋白質(zhì)組的規(guī)程利用多維蛋白命中技術(shù)(MudPIT)的實(shí)驗(yàn)性IAI模型4#乂^長類哞的^驗(yàn)^Z4/本規(guī)程經(jīng)俄勒岡健康和科學(xué)大學(xué)的公共機(jī)構(gòu)動物關(guān)愛利用委員會批準(zhǔn)。如先前所描述的，四只妊娠時(shí)間加以監(jiān)視的懷孕恒河猴(Macacamulatta)在妊娠120天長期插管(足月為167天)(Gravett，M.G.etal.，AmJObstetGynecol1994，171,(6),1660-7)。通過羊膜腔內(nèi)接種生長在10B培養(yǎng)基中的l()7集落形成單位的臨床低傳代脲支原體(Ureaplamsaparvum),serovar1建立實(shí)馬全性IAI(NovyMJ，etal.,ExperimentalprimatemodelforUreaplasmachorioamnionitisandpretermlabor.SocietyforGynecologicInvestigation,2001，Toronto,Canada,March14-17,2001)。每個(gè)動物充當(dāng)它自己的對照。如先前報(bào)導(dǎo)的，接種前和接種后，連續(xù)收集羊水和CVF樣品，用于定量細(xì)菌培養(yǎng)、白細(xì)胞分析和細(xì)胞因子和前列腺素濃度(Gravettetal.，見上，Novyetal.，見上)，并用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。CVF用無菌Dacron拭子(Solon,目錄#36816)從陰道后官窿收集，然后將其放入含有蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnositics,目錄#11836)的磷酸鹽緩沖鹽水中。蛋白質(zhì)提取后，離心樣品以除去細(xì)胞碎屑，上清液存儲在-70。C直到測定。對于這些測定而言，感染之前獲得的樣品和感染之后24-72小時(shí)的樣品都使用合并的CVF樣品。子宮收縮性記錄為羊水壓力曲線下的面積，表示為每小時(shí)收縮面積(HCA;mmHg乘以秒/每個(gè))。感染動物剖腹產(chǎn)生產(chǎn)后獲得胎兒、蛻膜、胎盤和細(xì)菌培養(yǎng)物來證實(shí)感染，進(jìn)行組織病理學(xué)研究來證實(shí)組織學(xué)絨毛膜羊膜炎。CVF和羊水的MALDI-TOF-MS譜來自CVF和羊水的總共0.5-3.0嗎的未分級分離的蛋白質(zhì)在裝備有脈沖離子提取源的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀(AutoFLEXIITOF/TOF,BrukerDaltonics,Billerica,MA)上分析。簡要地說，1)!l的樣品用4fi150%乙腈(ACN)/0.1Q/。三氟乙酸(TFA)和5(il的基質(zhì)溶液(在50o/。ACN/0.5。/。TFA中的飽和芥子酸)稀釋。樣品一式四份(2^1)點(diǎn)樣到382孔光滑鋼(groundsteel)Scout靶上(BmkerDaltonics,Billerica，MA)。以線性模式使用Autoflex，加速電壓+20kV。脈沖離子extractiondrop電壓為1500V，延遲時(shí)間350ns。用最大離子門控設(shè)定將基質(zhì)離子壓縮(suppressed)至高達(dá)3000Da。采樣率2.0GHz，每個(gè)譜語代表向10個(gè)不同位置發(fā)射的500個(gè)激光發(fā)射(shot)的總和。在50Hz運(yùn)行的氮激光器(人二337nm)被用來照射樣品。激光的輸出能量是llO^J,以偏移量62%、和36%的范圍衰減。樣品用激光功率30%、標(biāo)準(zhǔn)20%來照射。在固定的激光功率下手工收集m/z3000到20000的譜。譜用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)I混合物(BrukerDaltonics,Billerica,MA)通過外校準(zhǔn)來校準(zhǔn)，該混合物含有胰島素(m/z5734.6)、泛蛋白(m/z8565.9)、細(xì)胞色素C(m/z12361.9)和肌紅蛋白(m/z16952.6)，用ClinProt軟件版本2.0(BrukerDaltonics，Billerica,MA)分析。與丄C-肘6/似>^為、浙偶聯(lián)的一舉炎丙錄應(yīng)展凝履^泳lOOjig來自對照和感染樣品的CVF蛋白質(zhì)用碘乙酰胺還原，在Tris-tricine、10-20。/。梯度SDS-PAGE凝膠上分離。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色。從每個(gè)泳道上切下凝膠的清晰條帶，脫色，37。C利用Courchesne和Patterson的方法(Courchesne，P.L.etal"MethodsMolBiol1999,112，487-511)。然后肽用0.1。/。TFA提取，用來自Millipore的Zip-Tipcl8移液管槍頭純化。凝膠內(nèi)消化后，樣品在偶聯(lián)有CapLC(Waters,Inc.,Milford,MA)的Q-Tof-2質(zhì)譜儀(MicromassUKLtd,Unitedkingdom)上分析。掃描從400至1500Da的質(zhì)量用于MS測量，掃描從50到1900Da的質(zhì)量用于MS/MS。如下面在MudPIT分析中所描述的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析用于蛋白命中。M^/尸/r蛋冷命哞和潘//炎為了進(jìn)行CVF的MudPIT分析，從4個(gè)對照和感染樣品中每一個(gè)取1OO叱合并，得到來自每一狀況的0.4mg樣品。蛋白質(zhì)溶于100pl含有8M尿素、1MTris堿、80mM曱胺和8mMCaCl2(pH8.5)的消化緩沖液中。為了進(jìn)行半胱氨酸殘基的還原和烷化，樣品首先在50。C在12.5jil的0.9MDTT中保溫15分鐘，然后在25jil的1.OM碘乙酰胺中在室溫下在黑暗中再保溫15分鐘。添加40(al質(zhì)譜等級胰蛋白酶(l(ig/^il;Promega,MadisonWI)之前，添加額外12.5|11的0.9MDTT以及210jil的水和lNNaOH,以調(diào)整溶液pH至8.5。樣品然后充分混合，37。C過夜保溫。添加4(Hil曱酸來停止消化。在MudPIT分析之前利用C18Sep-Pak柱體(Waters，Inc.,Milford,MA)4吏消化產(chǎn)物脫鹽。脫鹽的消化產(chǎn)物(lml)注射到聚磺酸乙基強(qiáng)陽離子交換柱(2.1mmIDx100mm,5拜顆粒和300卞孑L徑大小(NestGroup,Southborough,MA)上，利用裝備有UV檢測器和餾分收集器的HPLC分級分離。溶劑A是含有25。/。乙腈(ACN)的5.6mM磷酸鉀(pH3)，溶劑B是含有25。/。ACN的5.6mM磷酸鉀(pH3)和350mMKC1。使用95分鐘梯度，流速200ji1/分，來分級分離肽100%AIO分鐘，緩慢轉(zhuǎn)換至50。/。B45分鐘，緩慢轉(zhuǎn)換至100。/。B15分鐘，緩慢轉(zhuǎn)換回IOO%AO.l分鐘，保持在IOO%A20分鐘?？偣彩占?0個(gè)級分，儲存在-20。C。蒸發(fā)級分，再懸浮在100^11的0.1%TFA中，利用96孔離心柱(spincolumn)(VydacC18二氧化娃NestGroup,Southborough，MA)脫鹽。在80%ACN/0.1。/o曱酸(FA)中洗脫后，級分一皮合并成43個(gè)級分，蒸發(fā)，再懸浮在25ial的5%曱酸中。SCX級分(每種5jJ)在連接到CapLC(WatersInc.,Milford,MA)上的Q-Tof-2質(zhì)譜儀上分析。Q-Tof-2安裝有納米噴霧源。每一SCX級分利用N肌oeaseC1875(xmIDx15cm熔凝硅石毛細(xì)管柱(WatersInc.，Milford,MA)和95分鐘水/ACN梯度分離。質(zhì)譜儀用Glu1FibrinopeptideB校準(zhǔn)。使用MS/MSMS測量法獲得語。掃描m/z400到1500的質(zhì)量用于MS測量，掃描m/z50到1900的質(zhì)量被用于MSMS。MS/MS譜用ProteinLynxGlobalServerv.2.1軟件(WatersInc.,Milford，MA)處理。使用三個(gè)相互獨(dú)立的搜索引擎OpenSea、TurboS叫uest(ThermoFinnigan,Waltham，MA)和X!Tandem,來自對照樣品的總共3，120個(gè)MS/MS譜和來自IAI樣品的2,800個(gè)MS/MS語針對組合數(shù)據(jù)庫來檢索，該數(shù)據(jù)庫含有已知的污染物和Swiss-Prot人類數(shù)據(jù)庫(版本46.6)的正反向條目。PEAKS軟件(BioinformaticsSolutions,Ontario,CA)被用來生成OpenSea搜索引擎的從頭序列。用Scaffold軟件(ProteomeSoftware,Portland,OR)中運(yùn)行的概率性蛋白命中算法將來自單個(gè)搜索引擎結(jié)果的蛋白命中加以組合。52%的來自對照樣品語和50°/。的來自IAI樣品的譜被分配給具有至少一個(gè)可信肽(概率^0.8)命中的蛋白質(zhì)。具有至少2個(gè)獨(dú)立肽命中(概率三0.8)的蛋白命中被認(rèn)為是可能存在于樣品中的。多義謦《沐^^)^gW^77名j€伊遂免疫原性肽和/或重組蛋白質(zhì)被用來生成兔和山羊多克隆抗體(DSLLaboratories,Webster,TX)。親合純化的抗體然后被用來進(jìn)行Westem印跡。100fig的CVF蛋白質(zhì)在4-20。/。SDS-PAGE上解析，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用溶于PBST的5。/。脫脂乳在室溫下封閉45分鐘，用lmg/ml第一抗體(IGFBP-1、天青殺素、4丐粒蛋白-A、鈣粒蛋白-B、膜聯(lián)蛋白II、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Lipocalin)、肌動蛋白抑制蛋白)4。C過夜保溫。用TBST洗三次后，膜用IgG-HRP第二抗體(Sigma-AldrichCo.)保溫，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(Pierce)顯象。用語計(jì)數(shù)來確定在對照和感染MudPIT樣品之間差別表達(dá)的蛋白質(zhì)。所有帶有兩個(gè)以上的可信肽命中的蛋白質(zhì)都考慮使用譜計(jì)數(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過將類似蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白、a-l-酸性糖蛋白l和2、和妊娠特異的糖蛋白)的譜計(jì)數(shù)壓縮成單個(gè)條目，進(jìn)一步校正所鑒定的蛋白質(zhì)的列表。同一肽在不相似蛋白質(zhì)之間的譜計(jì)數(shù)以相等比例在蛋白質(zhì)之間分配。合并兩個(gè)樣品的校正的蛋白質(zhì)列表，用樣品之間每一蛋白質(zhì)譜計(jì)數(shù)的獨(dú)立2x2j^企驗(yàn)來發(fā)現(xiàn)在它們之間有區(qū)別的蛋白質(zhì)。為了降低有豐度差別的蛋白質(zhì)的假陽性率，只有p值O.l、和在至少一個(gè)樣品中至少2個(gè)獨(dú)立的肽與至少四個(gè)MS/MS譜相匹配(概率>0.8)的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。利用發(fā)表的計(jì)算譜計(jì)數(shù)比例的公式確定滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)(Old,W.M.etal.，MolCellProteomics2005，4,(10),1487-502)。實(shí)施例17用多維蛋白命中技術(shù)(MudPin在非人靈長類實(shí)驗(yàn)性IAI模型中整體分析CVF蛋白質(zhì)組利用實(shí)施例16中描述的規(guī)程，獲得以下結(jié)果。結(jié)果在厲il^^Wreap/aymflpwvMm)感染^的^-發(fā)'/:^4/羊膜腔內(nèi)接種后，在所有動物中很快建立起感染。接種脲支原體(^e甲/fl，fl戸n;w附)后平均于54小時(shí)(范圍34-72小時(shí))子宮收縮性從基礎(chǔ)水平100HCA提高到超過3,000-6,000HCA,導(dǎo)致如Bishop得分所測量的累進(jìn)的宮頸變化。子宮收縮性4是高之前，親炎癥性細(xì)胞因子TNF-a、IL-1(3、IL-6和IL-8和前列腺素E2和F2a如先前報(bào)導(dǎo)的顯著提高(Gravett,M.G.,etal.,AmJObstetGynecol1994,171,(6),1660-7;NovyMJ，etal.:ExperimentalprimatemodelforUreaplasmachorioamnionitisandpretermlabor.SocietyforGynecologicInvestigation.2001,Toronto,Canada,March14-17,2001)。在子T收縮性最初提高的時(shí)候，沒有動物顯示其它IAI臨床征象。分娩后，病理組織學(xué)檢查在所有病例中證實(shí)絨毛膜羊膜炎。利用多維蛋白命中技術(shù)(MudPIT)在非人靈長類實(shí)驗(yàn)性IAI模型中整體分析CVF蛋白質(zhì)組對基于質(zhì)鐠的肽命中和定量方法的信心增強(qiáng)，使得與MS/MS偶聯(lián)的大范圍和多種多維肽分離得以發(fā)展。這種"鳥槍"肽測序法能夠產(chǎn)生可靠的蛋白命中以及相對定量的信息來比較平行分析的樣品組。利用MudPIT和基于凝膠的分級分離(與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)的一維PAGE)分析在CVF中鑒定到的總共205個(gè)獨(dú)特蛋白質(zhì)(表6)。利用GeneOntology檢索詞項(xiàng)(DAVIDV2.1)對CVF蛋白質(zhì)組進(jìn)行功能注釋，顯示(圖23A)它們中的大多數(shù)與新陳代謝(25%)和免疫應(yīng)答(23%)有關(guān)。對從CVF鑒定的蛋白質(zhì)預(yù)測的亞細(xì)胞的位置進(jìn)行分析(圖23B)顯示注釋的蛋白質(zhì)來自于細(xì)胞質(zhì)(24%)、分泌的(18%)、細(xì)胞骨架(14%)、和核(14%)類型。所鑒定的蛋白質(zhì)中13%的蛋白質(zhì)的細(xì)胞位置沒有相關(guān)信息。為了分析感染環(huán)境下有差異的蛋白水平，實(shí)驗(yàn)性IAI前后獲得的CVF樣品用胰蛋白酶消化，并且進(jìn)行MudPIT分析。來源于MudPIT分析的MS/MS語導(dǎo)致以高可信度(2個(gè)或更多肽/蛋白質(zhì))分別在對照和感染樣品中鑒定出149和151個(gè)蛋白質(zhì)。為了降低假陽性蛋白命中率，MS/MS譜針對含有已知污染物(即胰蛋白酶、角蛋白和血清白蛋白)的數(shù)據(jù)庫檢索，并且使用三個(gè)獨(dú)立的搜索可1擎利用來自theSwiss-Prot人和靈長類數(shù)據(jù)庫的正向和反向肽序列條目進(jìn)行檢索。利用基于概率的算法Scaffold(ProteomeSoftwareInc.,Portland,OR)組合來自這三種搜索引擎的結(jié)果。多個(gè)檢索算法的運(yùn)用通過降低偶然發(fā)生的肽命中提高了所報(bào)告命中的可信度。上面所報(bào)告的蛋白命中數(shù)目具有兩種或更多種獨(dú)特肽命中。為了定量比較對照和IAI樣品，進(jìn)行鐠計(jì)數(shù)法。譜計(jì)數(shù)能夠不靠復(fù)雜的差異性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)就在兩個(gè)樣品庫之間快速4全測豐度差異(Zybailov2005)。匯總對照和IAI的經(jīng)過校正的蛋白質(zhì)列表，進(jìn)行每一蛋白質(zhì)譜計(jì)數(shù)的獨(dú)立f檢驗(yàn)。計(jì)算的義2值超過2.706(90%置信區(qū)間)的蛋白質(zhì)在表7中報(bào)告。在該表中包括的是對照和IAI樣品的諳計(jì)數(shù)和與給定蛋白質(zhì)匹配的MS/MS肽語數(shù)目。也計(jì)算了對每一個(gè)顯著蛋白質(zhì)而言對照和IAI之間的倍數(shù)變化。在通過譜計(jì)數(shù)被認(rèn)為在對照和IAI之間存在差別的27個(gè)蛋白質(zhì)中，19個(gè)蛋白質(zhì)的^值在99%置信區(qū)間內(nèi)，8個(gè)蛋白質(zhì)的％2值在95%的置信區(qū)間內(nèi)。當(dāng)與利用蛋白質(zhì)分離(一維PAGE液相色i普MS/MS)進(jìn)行的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比時(shí)，通過譜計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)的15種蛋白質(zhì)與基于一維凝膠的實(shí)驗(yàn)中所見到的在的低豐度血清蛋白是MudPIT分析的優(yōu)點(diǎn)之一。多維前端肽分離(SCX和RP-LC)允許在基于凝膠的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和MALDI譜技術(shù)中研究寬動態(tài)范圍的濃度。概括在表7中的用于檢測CVF中IAI的潛在生物標(biāo)志物主要是免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。這些中的幾種，包括鈣粒蛋白A和B、天青殺素、和IGFBP-1，它們在IAI羊水中有差異地存在，在IAICVF中也被認(rèn)為上調(diào)?？侷GFBP-1的有差異的豐度(表7)反映了通過圖24A-D中的Western印跡鑒定出的完整30-kDa蛋白質(zhì)和蛋白水解片段。然而，存在于IAI情況中的大多數(shù)IGFBP-1由蛋白水解片段組成(圖24)。在3-5kDa峰中也鑒定到先前作為羊膜內(nèi)或下生殖道感染標(biāo)記物而鑒定到的防衛(wèi)素(defensin)。然而，譜分析中它們在對照CVF和IAICVF中的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性。使人感興趣的是，一些免疫調(diào)節(jié)的肽的基礎(chǔ)水平在CVF中比在羊水中高，這與富含樣i生物的下生殖道與正常無菌羊膜腔相比是更長期的炎癥性環(huán)境相一致。遞i^M4ZX>/-rOF7kg,;t/J/蛋冷,潘CVF和羊水蛋白質(zhì)提取物的MALDI-TOFMS分析顯示感染和非感染靈長類和人CVF和羊水之間在3-5-kDa和11-12-kDa區(qū)域若千峰強(qiáng)度差異(圖24A-D)，類似于先前報(bào)告的通過SELDI-TOF獲得的羊水的蛋白質(zhì)信號譜(Gravett,M.G.etal.，Jama2004,292，(4)，462-9)。在所有病例中在感染CVF和羊水中10.8-kDa簇都一致地被上調(diào)。使人感興趣的是，感染后在CVF樣品中該峰的相對強(qiáng)度比羊水樣品高，與下生殖道環(huán)境的基本狀態(tài)是親炎癥性的這一假設(shè)相一致。與CVF相比，在羊水中，響應(yīng)IAI而產(chǎn)生的3-5kDa蔟表達(dá)增加得比CVF中更多。在IAI存在的情況下在羊水和CVF中質(zhì)量3432and4128Da的蛋白質(zhì)都過表達(dá)。這些質(zhì)量可能代表防衛(wèi)素，如早先報(bào)告的(Buhimschi,I.A.;etal.,Bjog2005，112,(2),173-81)。脲支原體(Ureaplasmaparvum)感染后縱向采樣顯示，早在接種后24小時(shí)10.8-kDa蔟強(qiáng)度就增力口，先于感染動物CVF和羊水樣品中HCA的升高(數(shù)據(jù)未顯示)。"/i參標(biāo)4務(wù)的名^趁^/為了證實(shí)在IAI中鑒定的蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，我們選擇了從MudPIT分析中鑒定的標(biāo)記物中的5個(gè)。產(chǎn)生針對釣粒蛋白A和B的抗體、針對IGFBP-1的抗體、針對天青殺素的抗體、針對脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(Lipocalin)的抗體、針對膜聯(lián)蛋白II的抗體、和針對一種未調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)(觸珠蛋白)的抗體，以證實(shí)潛在的IAI生物標(biāo)志物的豐度差異。如圖25所示，Western印跡分析證實(shí)了所有這些生物標(biāo)志物的差異性存在，其所顯示的有差異的水平與IAICVF中進(jìn)行的蛋白命中實(shí)驗(yàn)相一致。討論臨床癥狀不明顯的IAI存在于至少50%的極端早產(chǎn)(extremelyprematurebirth)中，在極端早產(chǎn)中新生兒的發(fā)病率和死亡率都不相稱地高(Goldenberg,R.Letal"NEnglJMed2000,342,(20),1500-7)。IAI的早期臨床診斷是困難的，原因在于IAI的征象在感染晚期才顯現(xiàn)。此外，現(xiàn)有的非侵入性診斷性試驗(yàn)(例如母體白細(xì)胞計(jì)數(shù)或C反應(yīng)蛋白)的預(yù)測價(jià)值有限。其它檢驗(yàn)，包括測量羊水的葡萄糖、白細(xì)胞、白細(xì)胞介素-6或革蘭氏染色，需要進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)，并且此外就羊水培養(yǎng)物來說，結(jié)果的獲得過于遲緩，超過臨床最佳時(shí)間段。在非人靈長類實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示了與在婦女中觀察到的過程平行的IAI和早產(chǎn)之間的因果關(guān)系(Gravett,M.G.etal.,AmJObstet1994,171,(6),1660-7)。在先前的實(shí)施例中描述的研究中，我們利用SELDI-TOF質(zhì)譜來表征羊水的蛋白質(zhì)語，這些羊水來自具有實(shí)驗(yàn)性IAI的恒河猴和具有臨床癥狀不明顯的IAI和早產(chǎn)的婦女(也參見Gravett,M.G.etal.,Jama2004,292,(4),462-9)。我們鑒定了獨(dú)特的SELDI-TOF譜，其中在所有感染后羊水樣本中在3-5kDa和10.8kDa分子量范圍內(nèi)的肽水平升高，而在感染之前獲得的羊水中則沒有見到升高。類似地，在所有患有IAI和早產(chǎn)的婦女中都觀察到這一獨(dú)特蛋白質(zhì)譜，在過早陣痛中卻沒有感染、并且隨后足月分娩的婦女中則沒有觀察到。在這些質(zhì)量范圍之內(nèi)用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出的蛋白質(zhì)包括鈣粒蛋白A和B和IGFBP-1的獨(dú)特蛋白水解片段。這些發(fā)現(xiàn)最近被證實(shí)，并且鑒定了IAI的其它蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，Buhimschi,etal.Bjog2005，112，(2),173-81。在本研究中，我們首先試圖表征CVF的蛋白質(zhì)組，并利用如先前所描述的同樣的實(shí)驗(yàn)性模型表征具有實(shí)驗(yàn)性IAI的恒河猴的CVF蛋白質(zhì)譜，和與羊水相比較(Gravett，M.G.etal.,AmJObstetGynecol1994,171,(6)，16607;NovyMJ,etal.ExperimentalprimatemodelforUreaplasmachorioamnionitisandpretermlabor.SocietyforGynecologicInvestigation.2001，Toronto,Canada,March14-17,2001;GravettM.G.etal.,Jama2004,292,(4)，462-9)。這還是頭一個(gè)在允許非侵入性收集系統(tǒng)樣品的部位從更易接近的母體的采樣點(diǎn)利用MALDI-TOF質(zhì)譜和多維蛋白命中技術(shù)(MudPIT)表征CVF的蛋白質(zhì)譜并鑒定IAI的新的生物標(biāo)志物的報(bào)告。這可用來進(jìn)行IAI病因?qū)W中上行子宮內(nèi)感染的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測或診斷，并且通過與母體血清和胎兒羊水取樣進(jìn)行比較，對IAI的病理發(fā)生提供新的理解。我們利用了公認(rèn)的非人靈長類模型，其中實(shí)驗(yàn)性IAI由羊膜腔內(nèi)接種脲支原體(t/reop/asma;arvwm)而引起。我們選擇這一病原體，因?yàn)樗鼜幕加薪M織學(xué)絨毛膜羊膜炎的婦女的胎盤中最常分離到的微生物(Hillier,S.L.etal.，NEnglJMed1988,319,(15),972-8)orfromAFofwomeninpretermlaborwithintactfetalmembranesareUreaplasmaspecies(U.urealyticumandU.parvum).脈支原體的物種(Ureaplasmaspecies)也涉及產(chǎn)后子宮肌內(nèi)膜炎、新生兒敗血癥、腦膜炎、和新生兒支氣管肺發(fā)育異常(Chaim,W.etal.,EurJObstetGynecolReprodBiol2003,109,(2)，145-8;Viscardi，R.M.etal.，PediatrDevPathol2002,5,(2),141-50;Yoon，B.H.etal"AmJObstetGynecol2000,183，(5),1130-7)。是快速蛋白質(zhì)指紋技術(shù)方法(MALDI-TOFMS)，其生成不同的表達(dá)譜并可用來開發(fā)快速的篩選測定法，另一種是一種詳細(xì)的蛋白命中和定量方法(LC-LC-MS/MS，MudPIT)，其提供適合于通過傳統(tǒng)免疫測定進(jìn)行鑒定的生物標(biāo)志物標(biāo)示。將基于MALDI-TOF-MS的譜技術(shù)作為目標(biāo)是因?yàn)樗鼈兊哪陀?、易用和高處理能力的性質(zhì)。到目前為止所使用的大多數(shù)語研究利用MALDI-MS蛋白語方法評價(jià)疾病狀態(tài)，該i普方法涉及利用與MALDI-TOF-MS偶聯(lián)的色譜技術(shù)進(jìn)行血清分級分離。雖然從這些研究中得到的MS蛋白i普也許已鑒定出能辯別正常和紊亂樣本的獨(dú)特質(zhì)量，所使用的方法學(xué)不能鑒定和證實(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的只基于MALDI-MS蛋白質(zhì)m/z值的蛋白質(zhì)類另ll(classifier)。通常用于檢測有差異的蛋白質(zhì)表達(dá)模式的二維凝膠電泳(2-DE)(Tsangaris,G.;etal"Electrophoresis2005,26,(6),1168-73;Pieper,R.etal"Proteomics2003,3,(7),1345-64)偏向檢測高豐度蛋白質(zhì)，檢測低豐度蛋白質(zhì)的能力有限(Gorg，A.,etal.,Proteomics2004,4，(12),3665-85)。與MS/MS偶聯(lián)的2D-LC方法(多維蛋白命中技術(shù)，MudPIT)上的進(jìn)展使得能進(jìn)行更好的樣品富集、分離、和深入的肽覆蓋率，以研究來自復(fù)雜混合物胰蛋白酶消化的整體蛋白質(zhì)表達(dá)變化(Washbum,M.P.etal.,NatBiotechnol2001，19，(3),242國7.;Schi薩r,E.C.etal.，Science2003,301,(5638),1380畫2.;LeRoch,K.G.etal"GenomeRes2004,14,(11),2308-18;Peng，J.etal.,.NatBiotechnol2003,21,(8)，921-6;Ideker,T.etal.，Science2001，292,(5518),929-34)。最近，從復(fù)雜肽混合物進(jìn)行MS/MS譜抽樣已經(jīng)被確定為相對的定量信息的來源。利用譜計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)通過MudPIT分析的復(fù)雜肽混合物中的肽命中的總數(shù)與蛋白質(zhì)豐度在100-倍的濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)，并且比質(zhì)譜來源的離子色譜具有更寬的動態(tài)范圍、更可復(fù)制(Old,W.M.etal"MolCellProteomics2005,4,(10),1487-502;Liu,H.etal".AnalChem2004,76，(14)，4193-201;Zybailov，B.etal.，AnalChem2005,77,(19),6218-24)。利用MudPIT分析表征在對照和IAI中在CVF中表達(dá)的蛋白質(zhì)顯示出在IAI中上調(diào)的很多免疫應(yīng)答/防衛(wèi)相關(guān)蛋白質(zhì)。在IAI的時(shí)候在羊水和CVF之間豐度有差別的蛋白質(zhì)存在相當(dāng)大程度的重疊。在我們的研究中，先前已經(jīng)被確定為羊水中潛在生物標(biāo)志物的4丐粒蛋白、天青殺素、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、L-絲束蛋白等，在CVF中也有差別。除了上述免疫調(diào)節(jié)劑之外，在CVF中檢測響應(yīng)感染的抗菌蛋白質(zhì)天青殺素為子宮內(nèi)免疫應(yīng)答提供了新的理解。天青殺素(CAP37)是從人中性粒細(xì)胞分離的一種陽離子抗菌蛋白，其在寄主防御和炎癥中具有可能的重要作用(Gabay，J.E.etal.,ProcNatlAcadSciUSA1989，86，(14),5610-4)。在IAI中表達(dá)升高的另一種抗菌蛋白質(zhì)是抗微生物肽前體(cathelin)，其具有C末端37個(gè)殘基的a-螺旋肽，具有抗細(xì)菌感染活性(Zhao,C.etal.,AntimicrobAgentsChemother2001,45,(10),2695-702)。在感染CVF中膜聯(lián)蛋白水平升高可能涉及CVF-特異性IAI應(yīng)答。膜聯(lián)蛋白是一組Ca"結(jié)合蛋白，與炎癥和防御反應(yīng)有關(guān)。膜聯(lián)蛋白A2在病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和在人腫瘤中上調(diào)(Filipenko，N.R.etal"JBiolChem2004，279，(10)，8723-31)。膜聯(lián)蛋白1調(diào)節(jié)甾體激素的抗炎作用(Castro-Caldas，M.etal.,MediatorsInflamm2001,10，(5)，245-51)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP是一類鋅依賴的內(nèi)肽酶家族，在許多炎癥狀況下表達(dá)，促進(jìn)結(jié)締組織分解。有人認(rèn)為，細(xì)菌產(chǎn)物和/或親炎癥性細(xì)胞因子IL-1(3和TNF-a作為旁泌性或自分泌信號可能引起胎月莫(amniochorion)細(xì)月包i秀導(dǎo)MMP表達(dá)(Vadillo-Ortega，F(xiàn).etal.,AmJObstetGynecol2002,186,(1),128-38;Vadillo-Ortega,F.etal.,Bjog2005，112Suppl1，19-22)。在第二種方法中，我們利用MALDI-TOFMS，4企測在實(shí)驗(yàn)性靈長類IAI情況下在CVF中顯著過表達(dá)的10.8-kDa蔟。這類似于在我們先前的研究中觀察到的羊水蛋白質(zhì)組譜(Gravett,M.G.etal.,Jama2004，292,(4),462-9),證實(shí)了該信號譜在檢測CVFIAI中的特異性。這一過表達(dá)簇可代表針對感染的基本子宮內(nèi)免疫應(yīng)答，因?yàn)樵谠摢?dú)特簇中鑒定到的一組蛋白質(zhì)，即鈣粒蛋白，是S-100鈣結(jié)合蛋白家族的成員，其通過巨噬細(xì)胞和通過上皮細(xì)胞在急性炎癥組織中表達(dá)。該簇的第二個(gè)候選者，IGFBP-1的蛋白水解片段，顯示響應(yīng)感染的潛在的蛋白酶相關(guān)機(jī)制。完整IGFBP-1是羊水中的主要IGFBP，由胎膜和母體蛻膜合成。然而，值得注意的是，這個(gè)信號存在于CVF樣本中(雖然以較低的相對濃度)，但是不在感染之前的羊水樣本中存在。這些免疫調(diào)節(jié)肽的較高的基礎(chǔ)水平可能反映與羊水環(huán)境相比陰道環(huán)境基本的炎癥性特征。羊水通常無菌，炎癥性標(biāo)記物的濃度極微。相反，陰道的特點(diǎn)在于親炎癥性的、微生物豐富的環(huán)境。因此，雖然CVF樣本也許具有容易進(jìn)行非侵入性取樣的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果可能被局部炎癥性狀況例如細(xì)菌陰道炎所混淆。表征CVF蛋白質(zhì)組和鑒定很多在IAI中差別表達(dá)的蛋白質(zhì)對敏感的蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行了補(bǔ)充，這些蛋白質(zhì)組學(xué)方法通常用于鑒定生物標(biāo)志物和它們在發(fā)展IAI非侵入性測定中的潛在價(jià)值。通過分析CVF、羊水和母體的血清的和定量的樣本，可以了解很多關(guān)于IAI的病理發(fā)生的內(nèi)容。通過考察其它宮頸陰道炎癥性生物標(biāo)志物，例如親炎癥性的細(xì)胞因子和胎兒纖連蛋白，也已經(jīng)提出類似的問題(Rizzo,G.etal.,AmJObstetGynecol1996,175，(4Pt1)，812-7;Hoist,R.M.etal.，ActaObstetGynecolScand2005,84,(6),551-7;DiNaro,E.etal"ActaObstetGynecolScand2003，82，(12)，1072-9;Yoon，B.H.etal"AmJObstetGynecol2001,185,(5)，1137-42)。這些觀察結(jié)果，以及我們的觀察結(jié)果，都與如下假設(shè)一致，即在與感染相關(guān)的早產(chǎn)中，在絨毛膜蛻膜接觸面發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)的破裂，在該接觸面產(chǎn)生的炎癥性介質(zhì)達(dá)到陰道池(pool)，也許與宮頸屏障的破環(huán)相聯(lián)系。總之，我們利用兩種互補(bǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，來表征宮頸陰道蛋白質(zhì)的整體表達(dá)，以及鑒定CVF中IAI的潛在生物標(biāo)志物。鑒定到有差別的免疫調(diào)節(jié)肽，其在實(shí)驗(yàn)性IAI后表達(dá)有差異。用免疫測定證實(shí)了這些肽的差異表達(dá)，并提供了機(jī)會來開發(fā)用于診斷IAI的非侵入性的可靠的測定法。實(shí)施例18利用多維蛋白命中技術(shù)(MudPIT)整體分析在IAI中的人CVF蛋白質(zhì)組利用實(shí)施例14所描述的規(guī)程，獲得以下結(jié)果。結(jié)果從人研究中，如這里所報(bào)告的，回顧性地鑒定了一個(gè)亞組的患者。這個(gè)子集包括20名具有子宮內(nèi)感染證據(jù)的患者(定義為從羊水收獲微生物病原，或羊水IL-6濃度〉2,000pg/ml)，和一個(gè)隨機(jī)選擇的20個(gè)患者的子集，他們不具有子宮內(nèi)感染但是具有早產(chǎn)，以及20個(gè)不具有感染、具有對子宮收縮療法起反應(yīng)的過早陣痛、但是隨后足月產(chǎn)的患者。這些患者構(gòu)成本研究的研究群體。通過在無菌窺器檢查中將2個(gè)無菌的6-英寸帶Dacron尖端的塑料涂藥器(Solon,Skowhegan,ME)放入后陰道官窿，收集人CVF樣品。收集后，蛋白質(zhì)被提取入含含有蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Alameda,CA)的磷酸鹽緩沖鹽水。提取后離心樣品，以除去任何碎片和細(xì)胞材料，上清液存儲在-70。C。與液相色語MS/MS分析偶聯(lián)的一維PAGE100mg從每一組樣品合并的CVF蛋白質(zhì)用碘乙酰胺還原，在Tris-tricine、10-20。/。梯度SDS-PAGE凝膠上分離。凝膠用考馬斯藍(lán)R-250染色，從凝膠上切下每個(gè)泳道上的清晰的條帶，脫色，在凝膠中用胰蛋白酶37。C消化24小時(shí)。肽用0.1。/。TFA提取，用Millipore的Zip-Tipcl8移液管槍頭純化。凝膠內(nèi)消化后，樣品在偶聯(lián)有CapLC(Waters,Inc.，Milford,MA)的Q-Tof-2質(zhì)語儀(MicromassUKLtd,Unitedkingdom)上分析。掃描從400至1500Da的質(zhì)量用于MS測量，掃描從50到1900Da的質(zhì)量用于MS/MS。如下面在MudPIT分析中所描述的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析用于蛋白命中。MudPIT蛋白命中和語計(jì)數(shù)為了進(jìn)行CVF的MudPIT分析，從每一樣本(每一組中n=20)中取50ul合并，得到來自每一狀況的0.6mg樣品。蛋白質(zhì)溶于100ml含有8M尿素、1MTris堿、80mM曱胺和8mMCaCl2(pH8.5)的消化緩沖液中。為了進(jìn)行半胱氨酸殘基的還原和烷化，樣品首先在50。C在12.5ml的0.9MDTT中保溫15分鐘，然后在25ml的1.0M碘乙酰胺中在室溫下在黑暗中再保溫15分鐘。添加40ml質(zhì)i普級月夷蛋白酶(lmg/ml;Promega,MadisonWI)之前，添力。額夕卜12.5ml的0.9MDTT以及210ml的水和lNNaOH，以調(diào)整溶液pH至8.5。樣品然后充分混合，37。C過夜保溫。添加40ml曱酸來停止消化。在MudPIT分析之前利用C18Sep-Pak柱體(Waters，Inc.,Milford,MA)使消化產(chǎn)物脫鹽。脫鹽的消化產(chǎn)物(1ml)注射到聚磺酸乙基強(qiáng)陽離子交換柱(2.1mmIDxlOOmm，5mm顆粒和300-m孔徑大小(NestGroup,Southborough,MA)上，利用裝備有UV檢測器和餾分收集器的HPLC分餾。溶劑A是含有25%乙腈(ACN)的5.6mM磷酸鉀(pH3),溶劑B是5.6mM磷酸鉀(pH3)和含有25。/。ACN的350mMKCl。使用95分鐘梯度，流速200ml/分，來分級分離肽100%A10分鐘，緩慢換至50%B45分鐘，緩慢換至100%B15分鐘，緩慢換回到100%AO.l分鐘，保持在100%A20分鐘?？偣彩占?0個(gè)級分，儲存在-20。C。蒸發(fā)級分，再懸浮在100ml的0.1%TFA中，以利用96孔離心柱(VydacC18二氧化硅NestGroup,Southborough,MA)脫鹽。在80%ACN/0.1。/o曱酸(FA)中洗脫后，級分被合并成43個(gè)級分，蒸發(fā)，再懸浮在25ml的5。/。FA中。SCX級分(每種5ul)在連接到CapLC(WatersInc.,Milford,MA)上的Q-Tof-2質(zhì)鐠儀上分析。Q-Tof-2配備有納米噴霧源。每一SCX級分利用NanoeaseC1875mmIDx15cm熔凝硅石毛細(xì)管柱(Inc.，Milford,MA)和95分鐘水/ACN梯度分離。質(zhì)i普儀用GlulFibrinopeptideB校準(zhǔn)。使用MS/MSMS鑒定法獲得語。掃描m/z400到1500的質(zhì)量用于MS測量，掃描m/z50到1900的質(zhì)量用于MSMS。MS/MS語用ProteinLynxGlobalServerv.2.1軟件(WatersInc.:Milford,MA)加工。使用三個(gè)相互獨(dú)立的搜索引擎OpenSea14、15，TurboSequest(ThermoFinnigan,Waltham,MA)和X!Tandem,來自每一組的平均2，800個(gè)MS/MS譜針對組合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行4全索，該數(shù)據(jù)庫含有已知的污染物和Swiss-Prot人類數(shù)據(jù)庫(版本46.6)的正反向條目。PEAKS軟件(BioinformaticsSolutions,Ontario,CA)被用來生成OpenSea搜索引擎的從頭序列。用Scaffold軟件(ProteomeSoftware,Portland,OR)中運(yùn)行的概率性蛋白命中算法將來自單個(gè)搜索引擎結(jié)果的蛋白命中加以組合。具有至少2個(gè)獨(dú)立的肽命中(概率>0.8)的蛋白命中被認(rèn)為是可能存在于樣品中的。結(jié)果i2Nf萍4(^efem7/aZw，P7Z」還^EZ4/——比較過早陣痛和IAI，顯示33個(gè)豐度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p〈0.05)的蛋白質(zhì)(表10)。這些蛋白質(zhì)之間的差異從+45倍到-8.7倍。在過早陣痛中有21種蛋白質(zhì)與IAI相比更豐富，包括鱗狀細(xì)胞癌抗原1(SCCA-1)、膜聯(lián)蛋白A2(膜聯(lián)蛋白II)、S100鈣結(jié)合蛋白A7(牛皮痺素)、斑周蛋白(Periplakin)、熱激關(guān)聯(lián)(Heatshockcognate)71kDa蛋白質(zhì)、內(nèi)披蛋白(Involucrin)、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(E-FABP)、硫氧還蛋白(源自ATL的因子)(ADF)、組蛋白H4、成神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白質(zhì)AHNAK、膜聯(lián)蛋白A1(膜聯(lián)蛋白I)(脂皮質(zhì)蛋白(Lipocortin)I)、肌動蛋白、cytoplasmicl(卩-肌動蛋白)、熱休克蛋白質(zhì)卩-l(HspBl)、果糖-二磷酸醛縮酶A(EC4.1.2.13)、粘蛋白-5B前體、小的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)2A(SPR-2A)(2-1)、胱抑蛋白A(StefinA)(胱抑蛋白AS)、髓過氧化物酶前體(EC1.11.1.7)(MPO)、角質(zhì)蛋白(Cornifm)A(小的富含脯氨酸的蛋白IA)(SPR-IA)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白前體。十二種蛋白質(zhì)在IAI中顯著更豐富，包括血紅素結(jié)合蛋白(hemopexin)前體((3-1B-糖蛋白)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(轉(zhuǎn)鐵蛋白)過氧化氫酶(EC1.11.1.6)、溶菌酶C前體(EC3.2.1.17)、基質(zhì)金屬蛋白酶9前體(MMP-9)kDa基質(zhì)金屬蛋白酶-9]、觸珠蛋白前體、肌動蛋白抑制蛋白-l(肌動蛋白抑制蛋白I)、血清白蛋白前體、纖連蛋白前體(FN)(不溶性冷球蛋白)、腦酸性可溶蛋白質(zhì)l(brainacidsolubleproteinl)(BASPl蛋白質(zhì))、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、維生素D-結(jié)合蛋白前體(DBP)。^袞沒省X4/的早,與"/的"fy^——比較沒有IAI和有IAI的過早陣痛，顯示27個(gè)蛋白質(zhì)具有統(tǒng)計(jì)上顯著的(pO.05)豐度差異(表11)。23個(gè)蛋白質(zhì)在具有IAI的早產(chǎn)中更豐富，包括觸珠蛋白前體、肌動蛋白抑制蛋白-1(肌動蛋白抑制蛋白I)、腦酸性可溶蛋白質(zhì)l(BASP1蛋白質(zhì))、果糖-二磷酸醛縮酶A、甘油酪-3-磷酸脫氬酶、過氧化氪酶(EC1.11.1.6)、a-輔肌動蛋白4(alpha-actinin4)(非肌肉a-輔肌動蛋白4)、肌球蛋白-9(肌球蛋白重鏈、非肌肉IIa)、血清白蛋白前體、維生素D結(jié)合蛋白前體(DBP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9前體(MMP-9)kDa基質(zhì)金屬蛋白酶-9]、鉤粒蛋白C(CAGC)(CGRP)(中性粒細(xì)胞S100蛋白質(zhì))、胸腺素卩-4(T卩4)、溶菌酶C前體(EC3.2.1.17)、抑半胱氨酸酶蛋白B(肝硫醇蛋白酶抑制因子)、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(轉(zhuǎn)鐵蛋白)、a-l-酸性糖蛋白1前體(AGP1)、P-2-糖蛋白I前體(載脂蛋白H)、非分泌性核糖核酸酶前體、a-2-HS-糖蛋白前體(胎球蛋白-A)、A-1B-糖蛋白前體(A-1-B糖蛋白)、肽聚糖識別蛋白質(zhì)前體(SBBI68)(PGRP-S)、膜聯(lián)蛋白A3(膜聯(lián)蛋白III)(脂皮質(zhì)蛋白m)。S1004丐結(jié)合蛋白A2(S-100L蛋白質(zhì))(CAN19)、原肌凝蛋白a3鏈(原肌凝蛋白3)、乳運(yùn)鐵蛋白前體(乳鐵蛋白)、小的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)3(Comifin卩)、激肽釋放酶(kallikrein)13前體、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(E-FABP)、組蛋白H4、熱休克蛋白(3-l(HspBl)(熱休克27kDa蛋白質(zhì))、膜聯(lián)蛋白A1(膜聯(lián)蛋白I)(脂皮質(zhì)蛋白1)、硫氧還蛋白(源自ATL的因子)(ADF)、斑周蛋白(195kDa角化的被膜前體蛋白質(zhì))、熱休克關(guān)聯(lián)71kDa蛋白(熱休克70kDa蛋白質(zhì)8)、粘蛋白-5B前體(粘蛋白-5亞型B、氣管支氣管的)、內(nèi)4皮蛋白、成神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白質(zhì)AHNAK、纖連蛋白前體(FN)(不溶性冷球蛋白)(CIG)、膜聯(lián)蛋白A2(膜聯(lián)蛋白II)(脂皮質(zhì)蛋白I1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原l(SCCA-1)、S1004丐結(jié)合蛋白A7(牛皮癬素)在沒有IAI的早產(chǎn)中更豐富。討論正如以上所討論的，表征CVF蛋白質(zhì)組和鑒定很多在IAI中差別表達(dá)的蛋白質(zhì)對通常用于鑒定生物標(biāo)志物的敏感的蛋白質(zhì)組學(xué)方法和它們在發(fā)展IAI非侵入性測定中的潛在價(jià)值進(jìn)行了補(bǔ)充。通過分析CVF、羊水和母體血清的時(shí)間上的和定量的樣本，可以了解很多關(guān)于IAI的病理發(fā)生的內(nèi)容。我們的觀察結(jié)果與如下假設(shè)一致，即在與感染相關(guān)的早產(chǎn)中，在絨毛膜蛻膜接觸面發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)的破裂，在該接觸面產(chǎn)生的炎癥性介質(zhì)達(dá)到陰道池，也許與宮頸屏障的破環(huán)相聯(lián)系?？傊覀兝脙煞N互補(bǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，來表征宮頸陰道蛋白質(zhì)的整體表達(dá)，以及鑒定CVF中IAI的潛在生物標(biāo)志物。鑒定到有差別的免疫調(diào)節(jié)肽，其在實(shí)驗(yàn)性IAI后表達(dá)有差異。用免疫測定證實(shí)了這些肽的差異表達(dá)，并提供了機(jī)會來開發(fā)用于診斷IAI的非侵入性的可靠的測定法。實(shí)施例19在人CVF(CVF)中鑒定新的早產(chǎn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的規(guī)程^^品僅桌和》"工本研究經(jīng)俄勒岡健康和科學(xué)大學(xué)組織機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。所有的受試者都前瞻性地加以確定，并書面知情同意參與該研究。過早陣痛(pretermlabor,PTL)定義為妊娠37周之前有規(guī)律的子宮活動和宮頸擴(kuò)張的組合，早產(chǎn)定義為在37周妊娠之前發(fā)生的自發(fā)分娩。沒有患者具有IAI的臨床跡象。征收18名受試者(每一組中n-6)，平均胎齡26.9周+7.5SD(范圍15.8-35.9)。母體平均經(jīng)產(chǎn)狀況為0.8,20%的受試者有在先早產(chǎn)史。通過在無菌窺器檢查期間將2個(gè)無菌6英寸帶Dacron尖端塑料涂藥器(Solon,SkowheganME)放入后陰道官窿并旋轉(zhuǎn)15秒，收集CVF樣品。收集后，蛋白質(zhì)被提取入含有蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,Alameda,CA)的磷酸鹽緩沖鹽水。提取后離心樣品，以除去任何碎片和細(xì)胞材料，上清液存儲在-70。C。為了進(jìn)行MudPIT分析，對照、沒有早產(chǎn)的過早陣痛、和沒有感染的自發(fā)性早產(chǎn)(spontaneouspretermbirth，SPTB)的母體CVF樣品每種取五個(gè)(100)ilx5)，分別合并，用丙酮沉淀。490)ig的每一合并的樣本溶于10mMTris:pH8.5。為了進(jìn)行二維差示性凝膠內(nèi)電泳實(shí)驗(yàn)，各使用50嗎胎齡匹配的對照、過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)(GA29-34周)樣本。炎^fc二舉i^'/^凝魔力^泳(^vv。-(i,mg服'。"a/(i欣rg""a//"-gg/選擇胎齡匹配的對照/過早陣痛/自發(fā)性早產(chǎn)(29-34周)樣本對。對于每種樣本，50mg的CVF蛋白質(zhì)用CyDyeDIGEFluorminimaldye(GEHealthcareBiosciences,Piscataway,NJ)以400pm染津牛/50mg蛋白質(zhì)的;農(nóng)度才示記。Cy2、Cy3、和Cy5染料分別用來標(biāo)記對照、過早陣痛、和自發(fā)性早產(chǎn)，所有三種標(biāo)記樣本在一個(gè)凝膠中多路傳輸(multiplex)和分辨。經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過丙酮沉淀純化，溶于IEF緩沖液，在室溫下再水化到24-cmIPG條上(pH4-7)12小時(shí)。IPG條在65-70kVhrs下進(jìn)行一維電泳，然后相繼用DTT和IAA平衡緩沖液平衡15分鐘。在80-90V進(jìn)行第二維8-16%SDS-PAGE18小時(shí)。凝膠用適當(dāng)?shù)募す夂蜑V光器在Typhoon9400掃描器(AmershamBiosciences)上掃描，光電倍增管(PMT)的電壓設(shè)置在550-600。不同通路的圖像用偽彩色(pseudo-color)重疊，差異用ImageQuant軟件顯象(AmershamBiosciences)。利用Phoretix2Devolution，片反本2005(Non-LinearDynamics,Ltd.)進(jìn)行二維凝膠圖像分析以鑒定豐度有差別的蛋白質(zhì)點(diǎn)。從每個(gè)凝膠中選出一個(gè)固定區(qū)域，進(jìn)行交叉染色分析規(guī)程。利用"非點(diǎn)模式"方法進(jìn)行本底扣除，包裹(wrapp)圖像以使點(diǎn)匹配最大化。用比例測量(ratiometric)歸一化算法解釋蛋白質(zhì)標(biāo)記中可能的濃度差。在Cy5和Cy3通路中的歸一化蛋白質(zhì)點(diǎn)與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(Cy2)比較，以生成相對量的比率。蛋白質(zhì)點(diǎn)強(qiáng)度的差異的統(tǒng)計(jì)顯著性通過每組平均化凝膠中的t-測驗(yàn)確定。相對比率〉2.0和t檢驗(yàn)值O.05的蛋白質(zhì)點(diǎn)被認(rèn)為是顯著的。為了鑒定感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)，利用700昭的CVF蛋白質(zhì)進(jìn)行制備性二維電泳(2DE),凝膠用考馬斯藍(lán)R-250或銀黃染色。從凝膠上切下單獨(dú)的點(diǎn)，脫色，用胰蛋白酶在37。C進(jìn)行凝膠內(nèi)消化16-18小時(shí)。肽提取在碳酸氫銨中，然后用0.22-mmMultiScreen濾板(Millipore,Billerica,MA)過濾。濾過的〉容液全部干燥，在5%曱酸中復(fù)原以通過質(zhì)譜分析。多克隆的抗體和Western免疫印跡——免疫原性肽和/或重組蛋白質(zhì)被用來生成兔和山羊多克隆抗體(DSLLaboratories,Webster,TX)。然后用親合純化的抗體進(jìn)行Western印跡。50(ig的CVF蛋白質(zhì)在4-20。/。SDS-PAGE上解析，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用SeaBlock(Pierce)封閉，用lmg/ml第一抗體(IGFBP-1、鈣粒蛋白-A、鈣粒蛋白-B、膜聯(lián)蛋白V、或肌動蛋白抑制蛋白)在4。C保溫過夜。TBST洗三次后，膜用Cy染料標(biāo)記的適當(dāng)?shù)牡诙贵w在黑暗中在持續(xù)晃動下保溫l小時(shí)，隨后洗滌。利用Typhoon9400可變模式成象儀(GEHealthcare,Piscataway,NJ)顯示特定蛋白質(zhì)條帶。2D-丄c筍聯(lián)l觀c-丄c-MS/Msy她6y/r)為、浙對照、過早陣痛、和未感染的自發(fā)性早產(chǎn)CVF樣本分別加以合并，每種取490嗎，干燥，溶于100(il含有8M尿素、lMTris堿、100mM曱胺和10mMCaCl2(pH8.5)的消化緩沖液中。樣品首先在50。C在12.5jil的0.9MDTT中保溫15分鐘，然后在25jil的1.0M碘乙酰胺中在室溫下在黑暗中再保溫15分鐘，以還原和烷基化樣本。額外向溶液中添加12.5|110.9MDTT以及210ial水和lNNaOH,以調(diào)整其pH至8.5。樣本用40|11的lmg/ml胰蛋白酶(Promega)7儲備溶液37。C消化過夜。用40pl的曱酸終止消化，用C18SepPakPlus柱體脫鹽。消化物(lml)注射到聚磺酸乙基強(qiáng)陽離子交換柱(2.1-mmIDx100mm，5卞m粒度和300-A孔徑大小(TheNestGroup,Southborough,MA)上，用裝備有UV檢測器和餾分收集器的HPLC分餾。溶劑A是含有25。/。乙腈(ACN)的10mM磷酸鉀(pH3),溶劑B是10mM磷酸鉀(pH3)、含有25。/。ACN的350mMKC1。使用95分鐘梯度，以200ml/分的流速，來對肽進(jìn)行分級分離。收集總共80個(gè)級分，蒸發(fā)，再懸浮在100ml的0.1。/。TFA中，用于利用96孔VydacCl8silicaspinplate(TheNestGroup,Southborough,MA)脫鹽。級分在80%ACN/0.1%曱酸(FA)中洗脫，蒸發(fā)，再懸浮在20ml的5。/。FA中，5ml的每一級分在連接到CapLC(Waters,Inc.,Milford，MA)上的Q-Tof-2質(zhì)譜儀上分析。,潘利用NanoeaseC1875-|imIDxl5-cm熔凝珪石毛細(xì)管柱(Waters,Inc.)和95分鐘水/ACN梯度進(jìn)一步分離2D-LC級分和凝膠消化產(chǎn)物。質(zhì)譜儀用GlulFibrinopeptideB校準(zhǔn)。使用MS/MSMS測量法獲得語。掃描m/z400到1500的質(zhì)量用于MS測量，掃描m/z50到1900的質(zhì)量被用于MS/MS。從2D-LC級分總共獲得10，824個(gè)MS/MS鐠。原始MS/MS語用ProteinLynxGlobalServerv.2.1軟件(Waters,Inc.)預(yù)處理。來自每一樣本的平均3,645個(gè)MS/MS語針對組合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行4全索，該數(shù)據(jù)庫含有已知的污染物(角蛋白和白蛋白)、SwissProt人類數(shù)據(jù)庫(版本46.6)的正反向條目。利用三個(gè)獨(dú)立的搜索引擎進(jìn)行肽命中檢索TurboSequest(ThermoFinnigan,Waltham,MA)，X！Tandem(Craig,R.andBeavis,見上)和OpenSea(Wenstrom,K.D.,AmJObstetGynecol175,830-3(1996);Ghidini，A.etal.,AmJReprodImmunol37,227-31(1997)。Sequest和X！Tandem是數(shù)據(jù)庫搜索引擎，將實(shí)驗(yàn)語與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫經(jīng)假設(shè)性酶消化生成的理論譜匹配。OpenSea是基于從頭序列的搜索引擎，在不精確的從頭序列和數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)序列之間進(jìn)行容錯(cuò)匹配。峰軟件(BioinformaticsSolutions,Ontario,CA)被用來向OpenSea搜索引擎提供從頭序列。用Scaffold(版本:1.3.2,ProteomeSoftware,Portland,OR)中運(yùn)行的概率性蛋白命中算法將來自單個(gè)搜索引擎結(jié)果的肽命中合并成蛋白命中。具有至少2個(gè)獨(dú)立肽命中(概率>二0.9)的蛋白命中被認(rèn)為存在于樣品中。譜計(jì)數(shù)，即與特定蛋白質(zhì)匹配的MS/MS譜的總數(shù)，已經(jīng)被用于得到該特定蛋白質(zhì)在樣本中的相對豐度(H.，etal.,AnalChem.76,4193-201.(2004);Zybailov，B.，etal.，AnalChem.77,6218-24.(2005);Old,W.M,etal.，MolCellProteomics.4，1487-502.Epub2005Jun23.(2005))。這一方法已經(jīng)被用于不靠同位素標(biāo)記就有效檢測兩個(gè)樣本之間蛋白質(zhì)豐度差異(JulkaS.&Regnier,F.JProteomeRes3,350-63(2004))。樣品中所有帶有兩個(gè)以上可信肽命中的蛋白質(zhì)都考慮使用譜計(jì)數(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過將類似蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白、a-l-酸性糖蛋白l和2等等)的譜計(jì)數(shù)壓縮成單個(gè)條目，進(jìn)一步校正樣品的蛋白質(zhì)列表。利用f擬合良度檢驗(yàn)進(jìn)行成對比較，來評價(jià)各組(對照、過早陣痛、或自發(fā)性早產(chǎn))之間在每一蛋白質(zhì)的譜計(jì)數(shù)上是否有顯著差別。在通過假發(fā)現(xiàn)率(falsediscoveryrate,FDR)方法對多重比較進(jìn)行調(diào)整后，確定每種蛋白質(zhì)的纟充計(jì)顯著性(Benjamini,Y.&Hochberg,Y.,JournaloftheRoyalStatisticalSocietyB，289-300(1995)),顯著性水平被定在0.05(SAS版本9.1)。為了降低豐度有差異的蛋白質(zhì)的假陽性率，只有在至少一個(gè)樣品中至少兩個(gè)獨(dú)立的肽與至少四個(gè)MS/MS譜相匹配(概率>0.8)的統(tǒng)計(jì)上顯著的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是豐度真正有差別。利用計(jì)算譜計(jì)數(shù)比例的已發(fā)表的公式確定滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的倍數(shù)變化(Old,W.M.etal.,見上)。通過將廣義線性回歸模型與log關(guān)聯(lián)函數(shù)(linkfunction)和泊松分布誤差(即泊松回歸)擬合，評價(jià)從對照到過早陣痛到自發(fā)性早產(chǎn)各組的每一蛋白質(zhì)的相對豐度上的累進(jìn)差異(Agresti,A.AnIntroductiontoCategoricalDataAnalysis,(JohnWiley&Sons,Inc,,1996)。用正交多項(xiàng)式對比來才t瞼在依次受試者組之間是否有升高或降低趨勢。顯著性水平被定在0.05，并如同上述通過FDR方法對多重比較進(jìn)行調(diào)整。通過評價(jià)過早陣痛相對于對照、以及自發(fā)性早產(chǎn)相對于控制組的回歸系數(shù)(即基于模型的倍數(shù)變化)，證實(shí)顯著趨實(shí)施例20在人CVF(CVF)中鑒定新的早產(chǎn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物遵循實(shí)施例19中描述的規(guī)程，獲得以下結(jié)果。結(jié)果CYF齊^,遂——利用多個(gè)搜索引擎分析總共10,824個(gè)MS/MS譜，在CVF中鑒定出205個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)，列于所附的表6中。對這些蛋白質(zhì)的功能性注釋顯示新陳代謝(25%)、免疫應(yīng)答(23%)以及運(yùn)輸(l8。/。)是CVF中呈現(xiàn)的主要類型。比較對照和過早陣痛，顯示21種蛋白質(zhì)具有統(tǒng)計(jì)上顯著的(p〈0.05)豐度差異。這些蛋白質(zhì)之間的差異從+28倍到-18倍。8種蛋白質(zhì)，包括S100鈣結(jié)合蛋白A7、粘蛋白-5B前體、calgizzarin、組蛋白H2B、組蛋白H1.2(組蛋白Hld)、L-乳酸脫氫酶A鏈、pGDP-分解抑制物2(pGDP-dissociationinhibitor2)、以及14-3-3cj在過早陣痛中上調(diào)超過3倍。S100釣結(jié)合蛋白A7(—種發(fā)育和細(xì)胞分化蛋白質(zhì))與對照相比是在過早陣痛中最顯著過表達(dá)的蛋白質(zhì)(28倍)。三種蛋白質(zhì)，包括橋粒斑蛋白(desmoplankin)、斑周蛋白、和連接斑珠蛋白(junctionplakoglobin)(橋粒斑蛋白III)在過早陣痛中顯著下調(diào)，分別為18倍、4倍和3倍。乂六^初化亍《發(fā)嫂f,——比較對照和自發(fā)性早產(chǎn)，顯示30種蛋白質(zhì)具有統(tǒng)計(jì)上顯著的(pO.05)豐度差異。七種蛋白質(zhì)，包括a-l-抗胰蛋白酶前體、鈣粒蛋白C、膜聯(lián)蛋白A5(膜聯(lián)蛋白V)、pGDP分解抑制物2、維生素D結(jié)合蛋白前體(DBP)、a-l-酸性糖蛋白l前體和L-絲束蛋白(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白質(zhì)l(lymphocytecytosolicproteinl))在自發(fā)性早產(chǎn)中上調(diào)超過3倍。a-l-抗胰蛋白酶，一種蛋白酶抑制物，是自發(fā)性早產(chǎn)中最顯著過表達(dá)的蛋白質(zhì)(16倍)，其次是鈣粒蛋白C(16倍)和膜聯(lián)蛋白A5(8.5倍)。六種蛋白質(zhì)，包括橋粒斑蛋白(DP)、肽酰脯氨酰順式反式異構(gòu)酶A、連4妻斑J朱蛋白(橋粒斑蛋白ni)、熱休克蛋白質(zhì)(3-l、斑周蛋白和表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白在自發(fā)性早產(chǎn)中下調(diào)超過3倍。比較沒有分娩的過早陣痛與自發(fā)性早產(chǎn)——比較過早陣痛與PTB，顯示25種蛋白質(zhì)具有統(tǒng)計(jì)上顯著的(p〈0.05)豐度差異。四種蛋白質(zhì)，在早產(chǎn)的CVF中上調(diào)超過3倍，分別為a-l-抗胰蛋白酶前體8.5倍、輛粒蛋白C6.2倍、膜聯(lián)蛋白A5(膜聯(lián)蛋白V)4.9倍和緩激肽原(kinninogen)4.5倍。8種蛋(13倍)、14-3-3cj(10.1倍)、組蛋白H2B(9.2倍)、肽酰脯氨酰順式反式異構(gòu)酶A(8.3倍)、L-乳酸脫氬酶A鏈(7.4倍)、組蛋白H1.2(4.6倍)、胱抑蛋白B(4.2倍)、和組蛋白H4(4.1倍)。趟,為、^f為了評價(jià)在對照、過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的常見蛋白質(zhì)相對豐度的趨勢和直線性，通過擬合廣義線性回歸模型和log關(guān)聯(lián)函數(shù)和泊松分布誤差(即泊松回歸)來使用GENMOD線性回歸模型(SAS版本9.1)。顯著性水平被定在0.05，并通過FDR方法來對多重比較進(jìn)行調(diào)整。發(fā)現(xiàn)十六種蛋白質(zhì)在所有三種樣本中都有差異(p0.003)(表8)。十三種蛋白質(zhì)持續(xù)顯示在自發(fā)性早產(chǎn)中比沒有分娩的過早陣痛具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性地增加，而在沒有分娩的過早陣痛中比對照中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性地增加。只有三種蛋白質(zhì)，即表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白、熱休克蛋白質(zhì)P-1和橋粒斑蛋白顯示在自發(fā)性早產(chǎn)中比在沒有分娩的過早陣痛中降低，在沒有分娩的過早陣痛中比對照降低?！?3011^A裙、i2^f萍^/口產(chǎn)的CKF的2DD/G五為Vf二維凝膠電泳已經(jīng)被廣泛用于表征血清蛋白質(zhì)組(Chromy,B.A.etal.,JournalofProteomeResearch3，1120-7(2004))，以鑒定癌癥及其他疾病的生物標(biāo)志物。為了提高敏感性、可重復(fù)性和在寬動態(tài)范圍內(nèi)檢測，我們利用多路蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法用熒光花菁染料標(biāo)記蛋白質(zhì)。三個(gè)胎齡匹配的對照、過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)CVF(胎齡29-34周)分別用Cy3、Cy5和Cy2標(biāo)記。每一標(biāo)記的胎齡匹配的樣品對在同一凝膠上解析。綠顏色或紅顏色的強(qiáng)度顯示豐度有差異的蛋白水平，黃色代表相對類似的豐度。對對照/過早陣痛/自發(fā)性早產(chǎn)凝膠圖譜的偽彩色顯象(ImageQuant;GEHealthcare)顯示在過早陣痛/自發(fā)性早產(chǎn)中蛋白質(zhì)上調(diào)的獨(dú)特模式(圖26A、26B、和26C)。利用Phoretix2Devolution軟件對通過2DDIGE解析的CVF蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量分析。將內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(Cy2)用作第三通路通過為點(diǎn)歸一化和匹配提供參考提高了分析的質(zhì)量。點(diǎn)定量規(guī)程在成對比較中平均匹配了590個(gè)點(diǎn)。17種蛋白質(zhì)在沒有分娩的過早陣痛中和在自發(fā)性早產(chǎn)CVF樣本中的差異超過兩倍。當(dāng)與沒有分娩的過早陣痛比較時(shí)，在自發(fā)性早產(chǎn)中有1l種蛋白質(zhì)被上調(diào)，6種蛋白質(zhì)被下調(diào)。從凝膠點(diǎn)中進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定顯示，14-3-3或分層蛋白(stratifm)顯示最高的過表達(dá)(ll倍)，其次是膜聯(lián)蛋白A2(7.M咅)、胱抑蛋白A(5.7倍)、鉤粒蛋白B(4倍)和細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2(3.9倍)。在自發(fā)性早產(chǎn)樣本中，內(nèi)披蛋白高度下調(diào)(15倍)，其次是表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(6.3倍)和細(xì)胞質(zhì)月幾動蛋白2(cytoplasmicactin2)(2.9倍)。MudPIT實(shí)驗(yàn)以高置信度(>90%)顯示了許多豐度上有差異的自發(fā)性早產(chǎn)生物標(biāo)志物，他們中有些與2DDIGE實(shí)驗(yàn)互補(bǔ)。在2DDIGE和MudPIT中都有豐度差異的蛋白質(zhì)是14-3-3cj、鈣粒蛋白B、S100鈣結(jié)合蛋白A7、a-l-抗胰蛋白酶和胱抑蛋白A。MudPIT又鑒定出許多較小的、難以用二維凝膠條件分離和顯象的有豐度差異的蛋白質(zhì)。此外，作為全液體分級分離的結(jié)果，對于許多鑒定到的蛋白質(zhì)而言，在MudPIT中相比于2D凝膠實(shí)驗(yàn)獲得更好的序列覆蓋。用鈣粒蛋白、膜聯(lián)蛋白V、和肌動蛋白抑制蛋白l的特異抗體進(jìn)行的免疫印跡證實(shí)了與MudPIT分析中觀察到的趨勢相一致的趨勢(圖27)。IGFBP-1顯示在自發(fā)性早產(chǎn)中獨(dú)特的蛋白水解模式和更高的表達(dá)水平。所檢測到的IGFBP-1中的大多數(shù)相當(dāng)于先前描述為IAI的羊水生物標(biāo)志物的低分子重、11kDa蛋白水解片段(Gravett,M.G.etal.Jama292，462-9(2004))。討論自發(fā)性早產(chǎn)(SPTB)是世界范圍內(nèi)圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的主要問題，是非先天畸形導(dǎo)致的圍產(chǎn)期死亡的首要原因。估計(jì)每年發(fā)生8百萬例圍產(chǎn)期死亡，主要是由于早產(chǎn)和新生兒敗血癥(Lawn，J.,McCarthy,B.&Ross,s.TheHealthyNewborn:aReferenceManualforProgramManagers,(ed.CentersforDiseaseControl,C.)(Atlanta,2001);WHO.2001Estimatesin:SavingNewbornLives.StateoftheWorld'sNewborns.1-49(WorldHealthOrganization/SavetheChildrenFederation-US,Washington,DC,2001)。在過去的三十年中，盡管健康保健有所改善，自發(fā)性早產(chǎn)率沒有降低(Smith，R.,etal.,RegulPept108,159-64(2002)),在美國，自發(fā)性早產(chǎn)率在過去的25年中連續(xù)上升，到2004年達(dá)到12.5%(NationalVitalStatistics2004)。大量研究都試圖鑒定STPB標(biāo)記物。也已經(jīng)分析了流行病學(xué)危險(xiǎn)因素、宮頸長度、宮頸陰道胎兒纖連蛋白(fFN)單核香酸多態(tài)性、母體醫(yī)學(xué)狀況、陰道感染和羊水及其他生物液體中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物之間的相互關(guān)聯(lián)，希望開發(fā)對自發(fā)性早產(chǎn)的陽性預(yù)測有用的模型。然而，迄今為止，還沒有堅(jiān)耐用的標(biāo)記物被證實(shí)能用于一般性臨床應(yīng)用。若干種生物液體，包括CVF、唾液和/或血漿，都曾被用作檢測自發(fā)性早產(chǎn)標(biāo)記物的來源。然而，這些標(biāo)記物中沒有一個(gè)被認(rèn)為能很好地預(yù)測早產(chǎn)。唾液中各種激素都被評價(jià)為自發(fā)性早產(chǎn)的潛在生物標(biāo)志物。在這些當(dāng)中，只有唾液雌三醇被顯示是自發(fā)性早產(chǎn)的標(biāo)記物，通常在妊娠32周之后(Ramsey,P.S.&Andrews,ClinPerinatol30,701-33(2003》McGregor,J.A.etal.AmJObstetGynecol173,1337-42(1995);Heine,R.P.etal.ObstetGynecol96,490-7(2000))。由于妊娠超過32周分娩的嬰兒，與較早胎齡分娩的嬰兒相比其新生兒發(fā)病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)低，這一標(biāo)記物的臨床用途有限。已經(jīng)廣泛評價(jià)了血清或血漿組分中的自發(fā)性早產(chǎn)標(biāo)記物。Goldenbergetal.(Goldenberg，R丄.etal.，AmJObstetGynecol185,643-51(2001);Goldenberg,R丄.etal"AmJObstetGynecol182，625-30(2000))顯示，血清粒細(xì)胞集落-刺激因子(G-CSF)水平超過75個(gè)百分點(diǎn)、血清鐵蛋白水平超過90個(gè)百分點(diǎn)都非常強(qiáng)烈地預(yù)示自發(fā)性早產(chǎn)。高曱胎蛋白、？喊性磷酸酶和高水平促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素也是自發(fā)性早產(chǎn)的潛在血清標(biāo)記物(Moawad，A.H.etal.,AmJObstetGynecol186,990-6(2002);McLean,M.etal"AmJObstetGynecol181,207-15(1999))。先前CVF中幾種物質(zhì)已經(jīng)被評價(jià)為自發(fā)性早產(chǎn)可能的生物標(biāo)志物。在迄今為止所有標(biāo)記物當(dāng)中，只有宮頸或陰道fFN被顯示是具有早產(chǎn)過早陣痛癥狀婦女在妊娠大約24至26周時(shí)自發(fā)性早產(chǎn)的可靠的陰性預(yù)測物(Goldenberg,R丄.etal.ObstetGynecol87,643-8(1996》。然而，在其它胎齡，特別在24周之前，fFN對自發(fā)性早產(chǎn)具有低靈敏度(〈20。/。)Honest,H.，etal.,Bmj325,301(2002》。本研究中所使用的多種蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了與具有自發(fā)性過早陣痛(SPTL)的足月分娩的婦女相比在早產(chǎn)婦女的CVF中有豐度差異的獨(dú)特的蛋白質(zhì)組(表9和表10)。成對比較無癥狀對照和過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)首次顯示存在不同于自發(fā)性早產(chǎn)的、獨(dú)特的過早陣痛標(biāo)記物組(表9)。很可能進(jìn)一步研究這些潛在的過早陣痛標(biāo)記物能幫助更好地了解過早陣痛機(jī)制，和提供新的治療途徑。漸進(jìn)性分析(趨勢分析)揭示出展現(xiàn)從無癥狀對照到自發(fā)性早產(chǎn)逐步升高的標(biāo)記物的可能列表。這些標(biāo)記物可通過系列測量而有益于監(jiān)視自發(fā)性早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。趨勢分析鑒定出作為一組顯示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的分子的S100蛋白質(zhì)。S100蛋白質(zhì)4丐粒蛋白A、B和C先前被描述為在具有自發(fā)性早產(chǎn)的婦女的母體血清和羊水中有差異地存在，在感染和炎癥情況下通常上調(diào)(Gravett,M.G.etal.Jama292,462-9(2004))。S100蛋白質(zhì)被認(rèn)為通過結(jié)合釣調(diào)節(jié)生物活性(Ikura,M.,TrendsBiochemSci21,14-7(1996))，在新生兒腦脊液、血和尿中S100蛋白質(zhì)水平升高與新生兒腦損傷有關(guān)(Blennow,M.，etal.,ActaPaediatr90，1171-5(2001);Sellman,M.etal.ScandJThoracCardiovascSurg26:39-45(1992))。在我們的研究中S100蛋白質(zhì)的豐度差異可能反映了與足月分娩的婦女相比由過早陣痛所導(dǎo)致的自發(fā)性早產(chǎn)的婦女中亞臨床IAI和炎癥發(fā)病率的升高。雖然我們的患者中沒有人具有IAI的臨床跡象，沒有常規(guī)進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)來排除這一可能性。類似地，趨勢分析也顯示自發(fā)性早產(chǎn)陰性預(yù)測物的存在，包括表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白、熱休克蛋白P-l和橋粒斑蛋白(表9)。也許評估上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)的免疫測定會給自發(fā)性早產(chǎn)診斷帶來更好的敏感性和特異性。在我們的成對比較和趨勢分析中，重要急性期反應(yīng)物顯示豐度升高(表8和9)。這些包括a-l-酸性糖蛋白(AlAG)、a-1-抗胰蛋白酶前體和膜聯(lián)蛋白A3(膜聯(lián)蛋白III)和A5(膜聯(lián)蛋白V)。先前已經(jīng)報(bào)告在恒河猴分娩之前AlAG水平升高(Golub,M.S.&Kaaekuahiwi，M.A.ClinChimActa262,29-37(1997))，雖然a-l-抗胰蛋白酶(一種響應(yīng)炎癥刺激而由白細(xì)胞釋放的糖蛋白蛋白酶抑制物)似乎在子宮表面的維持和胎盤附著中起重要作用(Geisert，R.D.,etal.，Reproductionl26,621-7(20(B))。已經(jīng)顯示人滋養(yǎng)層組織產(chǎn)生a-l-抗胰蛋白酶(Bergman,D.etal.Synthesisofa1-antichymotrypsinanda1-antitrypsinbyhumantrophoblast.PediatrRes34,312-7(1993))。膜聯(lián)蛋白III的生理作用沒有充分確定；然而，提出它作為胞內(nèi)鈣信號傳導(dǎo)和跨膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)的功能、以及它在胎盤和中性粒細(xì)胞中的存在(LeCabec,V.,etal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications189，1471-1476(1992))支持這一蛋白質(zhì)在自發(fā)性早產(chǎn)病理生理學(xué)中可能的作用。膜聯(lián)蛋白V被認(rèn)為與流產(chǎn)(Rand，J.,Eerden,etal.,ThrombRes115Suppl,77-81(2005))、先兆子癇和子宮內(nèi)生長受限有關(guān)(Bretelle，F(xiàn).etal.ThrombHaemost89,486-92(2003)),提示膜聯(lián)蛋白5在蛻膜梗塞/胎盤介導(dǎo)的過早陣痛中可能的決定作用。幾種在過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)中豐度有差別的CVF蛋白質(zhì)對于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、排列和運(yùn)動性是必要的。肌動蛋白抑制蛋白-1、pGDI2和胸腺素P-4全部涉及肌動蛋白細(xì)胞骨架的組織和生物發(fā)生，在自發(fā)性早產(chǎn)中上調(diào)。肌動蛋白抑制蛋白-1、pGDI2和胸腺素涉及肌動蛋白聚合的抑制或肌動蛋白細(xì)胞骨架的破裂(Honore,B.，F(xiàn)EBSLett330,151-5(1993))。肌動蛋白抑制蛋白l也已知結(jié)合多聚-L-脯氨酸基序(Witke，W.TrendsCellBiol14,461-9(2004))，并參與寄主病原體相互作用。李斯特氏菌屬和志賀氏菌屬細(xì)菌產(chǎn)生肌動蛋白抑制蛋白-l-結(jié)合蛋白，其能夠使得它們利用寄主細(xì)胞細(xì)胞骨架來侵入鄰近細(xì)胞(Witke,見上)。內(nèi)披蛋白是上皮結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是上皮細(xì)胞早期分化的標(biāo)記物。它已經(jīng)在宮頸化學(xué)預(yù)防試驗(yàn)中用作早期分化的生物標(biāo)志物(Mitchell,M.F.etal"JCellBiochemSuppl23,104-12(1995))。本研究提供了迄今為止對無癥狀對照受試者與過早陣痛但足月分娩、以及與具有自發(fā)性早產(chǎn)的受試者相比CVF中有差異的蛋白譜。MudPIT和2DDIGE都顯示了若干在過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)樣本中豐度有顯著差異的蛋白質(zhì)。然而，本研究的發(fā)現(xiàn)僅基于有限數(shù)量的樣本，必須在更大的群體中力口以證實(shí)。此外，盡管我們的幾個(gè)觀察具有生物學(xué)合理性，仍然可能我們的有些發(fā)現(xiàn)是由于隨機(jī)的生物學(xué)變化。為了使這一可能性減到最小，我們只考慮那些譜計(jì)數(shù)和倍數(shù)變化產(chǎn)生p值〈001的蛋白質(zhì)，并在對照、過早陣痛和自發(fā)性早產(chǎn)組中進(jìn)行成對比較，以及進(jìn)行趨勢分析來鑒定對照<過早陣痛<自發(fā)性早產(chǎn)的差異表達(dá)。如果這些蛋白質(zhì)中一或多種能被模擬用于臨床利用，本研究的發(fā)現(xiàn)對于產(chǎn)科學(xué)臨床實(shí)踐具有潛在的意義。目前最廣泛被利用的自發(fā)性早產(chǎn)宮頸陰道標(biāo)記物是fFN，一種具有良好特異性但是敏感性差的生物標(biāo)志物。與fFN相比，我們鑒定了若干種當(dāng)將無癥狀組和過早陣痛組與自發(fā)性早產(chǎn)組比較時(shí)比fFN具有更大差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。這些當(dāng)中有幾個(gè)上面討論到的蛋白質(zhì)，包括《丐粒蛋白C、a-l-S臾性糖蛋白、a-l-抗胰蛋白酶前體和膜聯(lián)蛋白V。鑒定新的自發(fā)性早產(chǎn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物代表了促進(jìn)我們對導(dǎo)致早產(chǎn)的生理的千擾的了解中向前邁出的重要一步。我們承認(rèn)，在更大群體中得到證實(shí)之前，我們的發(fā)現(xiàn)應(yīng)該被認(rèn)為是初步的，而且為了具有臨床上的顯著性，這些標(biāo)記物在實(shí)際上的效用必須比現(xiàn)有的試-瞼好。然而，為了扭轉(zhuǎn)最近25年來美國自發(fā)性早產(chǎn)率平穩(wěn)上升的趨勢，必須發(fā)展基于對早產(chǎn)高風(fēng)險(xiǎn)婦女的可靠鑒定的創(chuàng)新性治療策略。在前述說明書中，本發(fā)明參考某些具體實(shí)施方式而加以討i侖，但是本發(fā)明絕不限于此。當(dāng)然，除了那些在本文中顯示和描述的之外，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，從上述說明書中，本發(fā)明的各種修飾是顯而易見的，落入隨附的權(quán)利要求的范圍。本說明書所引用的所有參考文獻(xiàn)，和其中所引用的參考文獻(xiàn)，在此通過參考全文明確地合并于此。表1A研究群體的特征組特征組1PMD,有IUI(n=ll)組2PMD,無IUI(n=n)組3PML,隨后足月分娩01=11)組3比組p值母親年齡24.5±5.426.6±9.025.6±6.0NS白種人6(55%)4(36%)6(55%)NS經(jīng)產(chǎn)1.9±1.61.9±1.53.0±2.5NS未經(jīng)產(chǎn)3(27%)1(9%)1(9%)NS加入研究時(shí)的胎齡(周)26.9±1.128.6±1.130.3±1.10.10分娩時(shí)的胎齡(周)27.3±0.929.8±1.037.0±0.9<0細(xì)1從加入到分娩的期間(天)2.1±5.68.4±6.346.9±5.6<0.0001在7天內(nèi)分4免10(91%)6(55%)0<0週表1B篩選結(jié)果組組1組2組3組3比組PMD,有IU1PMD,無IUIPML,隨后足特征_(n=ll)_(n=ll)_月分娩(n-ll)_p值細(xì)菌培養(yǎng)陽性4/110/110/11p<0.011L-6陽性7/110/110/11p<0.01診斷性蛋白譜11/112/11*0/11p<0.01表1C.篩選試驗(yàn)的結(jié)果的Fisher's檢驗(yàn)顯著性評定值<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>X04412GELSHUMAN凝溶膠蛋白前體，血漿X53961TRFLHUMAN乳鐵傳遞蛋白前體(乳鐵蛋白)酶和其它分子V00572PGK1HUMAN磷酸甘油酸激酶1J04173PMG1HUMAN磷酸甘油酸變位酶1X67688TKTHUMAN轉(zhuǎn)酮醇酶(Transketolase)免疫沖企測中也顯示區(qū)別表達(dá)的蛋白質(zhì)。#表示這些蛋白質(zhì)的肽在感染羊水中更為豐富，或僅在感染羊水中檢測到。表3先前已知存在于羊水中、用從頭測序來鑒定的蛋白質(zhì)與多肽GenBank登錄號.蛋白ID蛋白質(zhì)名稱K02765C03HUMAN補(bǔ)體C3前體*J00241KACHUMANIgkaapa鏈C區(qū)J00253LACHUMANIglambda鏈C區(qū)J00228GC1HUMANIggamma-1鏈C區(qū)X57127H2BFHUMAN組蛋白H2B.f*X00038H4HUMAN組蛋白H4*J00153HBAHUMAN血紅蛋白a鏈U01317HBBHUMAN血紅蛋白P鏈U01317HBDHUMAN血紅蛋白S鏈M91036HBGHUMAN血紅蛋白y-A和Y-G鏈Z83742H2ACHUMAN組蛋白H2AM22919MLENHUMAN肌球蛋白輕鏈，堿性、非肌肉同種型J05070MM09HUMANIV型膠原酶前體*V00496A1ATHUMANa-l-抗胰蛋白酶前體*K01500AACTHUMANa-l-抗胰凝乳蛋白酶前體*M12530TRFEHUMAN血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體M11714TTHYHUMAN運(yùn)曱狀腺蛋白(Transthyretin)前體(前白蛋白)M13699CERUHUMAN血漿銅藍(lán)蛋白前體*X02544A1AHHUMANa-l-酸性糖蛋白2前體*X06675A1AGHUMANa-l-酸性糖蛋白1前體*M12523ALBUHUMAN血清白蛋白前體J00098APA1HUMAN載脂蛋白A-1前體(Apo-AI)*感染相關(guān)事件的已知標(biāo)志物表4Swissprot號a蛋白描述PIDMW'功能'歸一化的AF/血謙計(jì)數(shù)e清f18.8410.358.6A，SA，SA6.35.825.334.283.973.792.821.781.41.091.081.041.0310.970.940.840.820.81A，SA，SAA,SA，SA,SAAAA，SAA，SA，SA，S0.760.760.730.730.720.650.47A,SAA，SAA0.440.440.43A,S0.410.380.360.340.30.30.270.240.220.210.210.2A'SA，SA，SAA.SAA,SSP02768j6l清白蛋白M體5.4339.30P01857,IgY-1鏈C區(qū)域，8.46，36.08，P01859,Ig"2鏈C區(qū)域，7.66,35.9,P01861Igy-4鏈C區(qū)域7.1835.9Q9UBC9小的富含脯氨酸的蛋白38.8618.10P29508,鱗狀細(xì)胞癌抗原1,6.35，44.5,P48594鱗狀細(xì)胞癌抗原25.8644.8P06702鈣粒蛋白B5.9085.60P07355膜聯(lián)蛋白A24.6955.30P04083膜聯(lián)蛋白Al6.9611.10Q01469表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)6.8215.00P01834Igk鏈C區(qū)5.5811.60P02787血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體5.2251.20P05109鈣粒蛋白A5.9822.80(39HC84粘蛋白-5B前體6.24587,60P04080胱抑蛋白B8.3939.30P07476內(nèi)披蛋白7.5638.40P01040胱抑蛋白A5.3811.00P35321角質(zhì)蛋白A8.859.90Q09666成神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHNAK6.29312.30P01842IgX鏈C區(qū)6.9111.20P30740白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑5.9042.70P05164髓過氧化物酶前體6.5110.80P02788乳轉(zhuǎn)鐵蛋白前體6.7075.10P80188中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋9.0220.50白前體P01009a-l-抗胰蛋白酶前體5.3744.30P61626溶菌酶c前體9.2814.70P01876,lga-1鏈c區(qū)域，6.08,37.6,P0877Iga-2鏈c區(qū)域5.7136.5P04792熱休克蛋白卩-l8.5835.90PI0599硫氧還蛋白5.4423.20P62988泛蛋白6.568.60P01833聚免疫球蛋白受體前體(polymeric-5.5983.30imimmoglobulinreceptorprecursor)PI2429膜聯(lián)蛋白A35.3770.90Q8TDL5長腭，肺和鼻上皮蛋白l(Longpalate,6.6950.20lungandnasalepitheliumprotein])P00450血漿銅藍(lán)蛋白前體5.41120.00P35326,小的富含脯氨酸的蛋白2A8.81,8,P35325,小的富含脯氨酸的蛋白2B，8.81,7.97，P22532小的富含脯氨酸的蛋白2D8.777.9P60709肌動蛋白，細(xì)胞質(zhì)的15.2941.60POl()lla-卜抗胰凝乳蛋白酶前體5.3347.60P22528角質(zhì)蛋白B8.859.卯P00738觸i朱蛋白前體6.1345.20P62328胸腺素p-45.024.卯P18510白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑蛋白前體5.51123.60P01024補(bǔ)體C3前體6.02187.00P07737肌動蛋白抑制蛋白-4.6268.40P02790血紅素結(jié)合蛋白前體8.5078.10PI4780基質(zhì)金屬蛋白酶-9前體5.189.00P04406甘油醛-3—碌酸脫氬酶，肝9.3052.10d定答化謝答化答謝答答物化物化化答物答答答謝答謝謝謝導(dǎo)物指化織答化謝織答答織謝謝應(yīng)分代應(yīng)分應(yīng)代應(yīng)應(yīng)節(jié)分節(jié)分分應(yīng)節(jié)應(yīng)應(yīng)應(yīng)代應(yīng)代代代轉(zhuǎn)節(jié)未分組應(yīng)分代組應(yīng)應(yīng)組代代運(yùn)疫胞陳疫胞疫陳疫運(yùn)疫運(yùn)調(diào)胞調(diào)胞胞疫調(diào)疫疫運(yùn)疫陳疫陳陳陳號調(diào)能運(yùn)胞胞疫胞陳胞疫疫胞運(yùn)陳陳轉(zhuǎn)t細(xì)新免細(xì)t新t轉(zhuǎn)免轉(zhuǎn)酶細(xì)酶細(xì)細(xì)免酶免免轉(zhuǎn)免新免新新新信酶功轉(zhuǎn)細(xì)細(xì)免細(xì)新細(xì)免免細(xì)轉(zhuǎn)新新PI5924橋粒斑蛋白5.9569.20P08107熱休克70kDa蛋白14.9484.50Q9即8絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal5型前體8.50120.70PI2724嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白前體(eosinophilcationicproteinprecursor)5.6336.20P04279精膠蛋白-1前體6,6438.60060437斑周蛋白5.44204.50P09211谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P5.0653.50P02749P-2-糖蛋白l前體8.3736.20P07108?；o酶A結(jié)合蛋白6.9947.00P59665嗜中性白細(xì)胞防衛(wèi)素1前體6,5410.20060235跨膜蛋白酶，絲氨酸IID前體8.6946.20P03973抗白細(xì)胞蛋白酶1前體6.4349.30P0術(shù)5果糖二磷酸醛縮酶A6.9559.60PI4923連接斑珠蛋白5.6978.40P62805組蛋白H411.3611.20P62937肽酰-脯氨酰順式-反式異構(gòu)酶A7.8217.90Q02383精膠蛋白-2前體9.0462.卯P02774維生素D結(jié)合蛋白前體5.6766.40P07858組織蛋白酶B前體8.4714.卯P24158成髓細(xì)胞蛋白酶前體7.7924.20P00441超氧化物歧化酶5.7015.80P02763a-l-酸性的糖蛋白1前體5.0021.50P02765a-2-HS-糖蛋白前體5.0021.50P04040過氧化氫酶5.5554.30P13796L-絲束蛋白6.4295.10P54108富含半胱氨酸的分泌蛋白-3前體8.1125.50043707a-輔肌動蛋白45.27104.80P06733a蜂醇酶5.7113.20PI1142熱激關(guān)聯(lián)71kDa蛋白5.0170.40pi8206粘著斑蛋白6.44331.60p26038膜突蛋白6.0967.60P27482鈣調(diào)節(jié)蛋白關(guān)聯(lián)蛋白nb-14.3016.70P32926橋粒芯糖蛋白-3前體4.76101.70P67936原肌球蛋白a4鏈4.6728.40Q02487橋粒膠蛋白-2前體4.8084.70N1CE-1蛋白9.139.70P00558磷酸甘油酸激酶18.3044.50P01625IgK鏈V-IV區(qū)域Len7.9212.63P0〗871lgli鏈C區(qū)域6.3549.50PI6402組蛋白HI.311.0222.20P6310414-3-3蛋白zeta/delta4.7327.70P02679纖維蛋白原Y鏈前體5.2448.50P08311組織蛋白酶G前體9.8925.50p60174磷酸丙糖異構(gòu)酶6.5126.50P80723腦酸性可溶蛋白14.6422.50P01617IgK鏈V-II區(qū)域TEW5.6912.30p01620igK鏈v-m區(qū)域sie8.7011.80P0538760S酸性核糖體蛋白P24.261].50P1102178kDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體4.8211.60P29373視黃酸結(jié)合酸蛋白II,細(xì)胞的5.4315.60075223蛋白質(zhì)C7orf245.0721.00P07900熱休克蛋白HSP90-a5.8837.80P13987CD59糖蛋白前體5.2070.20P31151S1004丐結(jié)合蛋白A76.2611.31P3194714-3-3蛋白sigma4.6827.80P37837轉(zhuǎn)醛酶6.3637.50P47929半乳凝素-77.0014.9090ssA，sAss，AsAs，s，s，AAsAsA，AsAA，sAsAoooo化謝答謝分代應(yīng)代胞陳疫陳細(xì)，附，牽99999999oooooooooooooooooooooooo7777666665555555oooooooooooooooo定定定定定定化指謝答答謝物織謝化謝謝化答導(dǎo)謝指答織謝謝織答指指謝答答織謝殖謝謝指答答謝謝謝指導(dǎo)化殖謝分未代應(yīng)應(yīng)代節(jié)節(jié)組代分代代分應(yīng)轉(zhuǎn)代未應(yīng)組代代組應(yīng)未未代應(yīng)應(yīng)組代增代代未應(yīng)應(yīng)代代代未轉(zhuǎn)分增代胞能陳疫運(yùn)疫陳調(diào)調(diào)運(yùn)胞陳胞運(yùn)陳陳胞疫號陳能疫胞陳陳運(yùn)胞疫運(yùn)能運(yùn)能陳疫疫胞陳胞陳陳能疫疫陳陳陳能運(yùn)號胞胞陳運(yùn)細(xì)功新t轉(zhuǎn)t新酶酶轉(zhuǎn)細(xì)新細(xì)轉(zhuǎn)新新細(xì)t信新功免細(xì)新新轉(zhuǎn)細(xì)免轉(zhuǎn)功轉(zhuǎn)功新免免細(xì)新細(xì)新新功免免新新新功轉(zhuǎn)信細(xì)細(xì)新轉(zhuǎn)Q16610細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1前體6.1958.80Q99880組蛋白H2B.c10,3213.81095171Sciellin9,3875,30P01028補(bǔ)體C4前體6.66192.70P01042激肽原前體6.3471,90P04004玻連蛋白前體9.1111,70P07237蛋白質(zhì)二石危化物異構(gòu)酶前體6.119.卯P08603補(bǔ)體因子H前體11,3726.70P14618丙酮酸激酶，同工酶M1/M27.9557.70P20670組蛋白H2A.010.9013.95P20810鈣蛋白酶抑制蛋白4.9976.50P22735蛋白-谷氨酰胺Y-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶K5.6889.70Q06830過氧化物氧還蛋白18.2722.10Q13835親斑蛋白19.2982.80P00747纖溶酶原前體7.0490.50P0538660S酸性核糖體蛋白Pl9.1983.80P08670波形蛋白6,14136.90P28799顆粒體蛋白前體6.4363.50P30086褲脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白7.4320.卯P35237胎盤凝血酶抑制劑5.1842.60P01591免疫球蛋白J鏈4.6215.60P02647載脂蛋白A-I前體5.5630.80P02675纖維蛋白原p鏈前體8.5455.90P13639延伸因子210.7215.60PI8669磷酸甘油酸變位酶15.4617.10G9UBX7激肽釋放酶11前體9.2331.03Q9UKR3激肽釋放酶13前體8.7928.卯s,s，s，s，s，s,s,s，ASAAASASASAAA554444444444443333332222222ooooooooooooooooooooooooooo定導(dǎo)織化答答答謝答謝謝化導(dǎo)謝謝指殖物答謝殖謝謝謝謝轉(zhuǎn)組分應(yīng)應(yīng)應(yīng)代應(yīng)代織節(jié)代分轉(zhuǎn)代代未增節(jié)節(jié)應(yīng)代增代代代代號胞胞疫疫疫陳疫陳組調(diào)陳胞號陳陳能胞調(diào)調(diào)疫陳胞陳陳陳陳信細(xì)細(xì)m新t新細(xì)酶新細(xì)信新新功細(xì)酶酶t新細(xì)新新新新Swissprot登錄號？蛋白質(zhì)的描述pibMWCP68104延伸因子l-a19.150.11P02671纖維蛋白原a/a-E鏈前體5.794,91P01597IgK鏈V-I區(qū)域DEE9.4311.65P01703IgX鏈V-I區(qū)域NEWM9.3910.9P01008抗凝血酶-III前體6.3252.57P06731癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞粘連分子5前體5.4376.75Q92817外被斑蛋白6.56231.48P16401組蛋白H1.510.9122.44P05204非組蛋白染色體蛋白質(zhì)HMG-17109.26P30101蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A3前體5.9856.75Q91X52跨膜蛋白酶，絲氨酸11E前體8.8547.67P0538860S酸性核糖體蛋白PO5.7234.25Q05524a烯醇酶，肺特異的5.7849.45P23528肌動蛋白絲切蛋白-18.2618.36P27816微管關(guān)聯(lián)蛋白45,32120.94060504Vinexin9.4875.28組合的譜計(jì)數(shù)eAF/血清f84A,S4S32A，S222222定謝殖答答謝指育織織謝謝謝謝織謝謝d代增應(yīng)應(yīng)代未發(fā)組組代代代代組代代能陳胞疫疫陳能胞胞胞陳陳陳陳胞陳陳功新細(xì)免免新功細(xì)細(xì)細(xì)新新新新細(xì)新.新<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><,>7|{1\二谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A5P04楊甘油醛-3-磷酸脫氬酶熱休克27kDa蛋白1熱休克70kDa蛋白8l'"、)i"i熱休克90kDa蛋白1,a1)22626核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1P164U3組蛋白1,Hlc1)28001組蛋白1,H2abP62807組蛋白1,H2boh、S4;l組蛋白1，H3a組蛋白H4兩1()7HSP70-l/HSP70-2白細(xì)胞三烯B412-羥基脫氪酶P14174P4()925l巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)(苯丙酮酸互變異構(gòu)^蘋果酸脫氫酶1,NAD(可ii^F的)促分裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶過氧4匕物氧還蛋白(Peroxiredoxin)6P52209疇酸葡萄糖酸脫氫酶P00558磷酸甘油酸激酶1磷酸甘油酸變位酶l(腦)磷酸化酶，糖原；肝(Hers病，VI型糖原貯積病)P07237前膠原-脯氨酸，2-酮戊二酸4-雙加氧酶(脯氨酸4-輕化酶)，[3多肽Q9GLW7Prx-VP14618丙酮酸激酶，肌肉P31949S1004丐結(jié)合蛋白All(calgizzarin)P15426TIMQ12931TNF受體相關(guān)蛋白1P37837轉(zhuǎn)醛酶1P60174磷酸丙糖異構(gòu)酶1P31946P63104酪氨酸3-*加氧酶/色氨酸5-斧加氧酶活化蛋白，(3多肽酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白，i;多Ii^在蛋白綴合酶E2NP61088遍在蛋白綴合酶E2NP30085UMP-CMP激酶淋巴樣酪氨酸激酶:CAP,腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白l(酵母)l肌動蛋白絲切蛋白l(非肌肉的)富含半胱氨酸的分泌蛋白2內(nèi)皮細(xì)胞生長因子l(血小板來源的)細(xì)絲蛋白A,a(肌動蛋白結(jié)合蛋白280)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，58kDa聚合免疫球蛋白受體Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物2(p家族，小的GTP結(jié)合蛋白Rac2)pGDP解離抑制劑(GDI)aS10(H丐結(jié)合蛋白P分層蛋白(stratifin)TRK融合基因含纈酪肽蛋白96表7對感染的非人靈長類CVF進(jìn)行MudPIT和從頭測序分析檢測到的差別表達(dá)的蛋白質(zhì)/肽對照謹(jǐn)感染譜蛋白ID說明計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)2X改變倍數(shù)(TO4083)膜聯(lián)蛋白Al225323.543.1(P05109)鈣粒蛋白A(遷移抑制因子相關(guān)蛋白8)8311518.731.9(P08833)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白01417.5616.2(P31949)Calgizzarin(SlOO4丐結(jié)合蛋白All)11617.2310.2(Q9UBC9)小的富含脯氨酸的蛋白3(角質(zhì)蛋白卩;)11617.2310.2(P60709)肌動蛋白，胞漿型1234716.72.7(P07355)膜聯(lián)蛋白A2143516.173.2(Q01469)表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(E-FABP)123013.853.1(P06702)鈣粒蛋白B(移動抑制因子相關(guān)蛋白14)17018713.321.5(P35322)角質(zhì)蛋白(小的富含脯氨酸的蛋白I)(SPR-l)41812.844.9(Q862Z5)胱抑蛋白B102410.543(PI4780)基質(zhì)金屬蛋白酶-9前體(MMP-9)25409.122.1(P04217)a-1B-糖蛋白前體1308.91-8.7(P04196)富含組氨酸的糖蛋白前體1308.91-8.7(Q4R5C0)肌動蛋白絲切蛋白-l(肌動蛋白絲切蛋白，非肌肉同種型)067.017.7(PI3796)L-絲束蛋白(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白1)26365.731.8(P0S133)膜聯(lián)蛋白A68165.462.5(P03973)抗白細(xì)胞蛋白酶1前體2685.33-2.2(Q28514)谷胱tf肽S-轉(zhuǎn)移酶P9175.292.4(Q9GLV5〕抗微生物肽前體.24324.551.7(P29034)S100鉤結(jié)合蛋白A2054.496.6(Q09666)成神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHNAK043.225.6(P08246)白細(xì)胞彈性蛋白酶前體043.225.6(PI6401)組蛋白H.5(組蛋白Hla)043.225,6(P02545)核纖層蛋白A/C(70kDaa核纖層蛋白)043.225.6(P25815)S-00P蛋白043.225.6表8CVF蛋白質(zhì)在對照、PTL和PTB樣品的配對比較中都具有顯著變化_謙計(jì)數(shù)_倍數(shù)改變_/7值PTBPTBPTL相PTB相相對PTLPTB相對SwissProt對于對于對于相對于相對于于登錄號蛋白質(zhì)名稱對照PTLPTB對照照PTL對照對照PTLP31151S100鈣結(jié)合蛋白A7*162428.32.1-13.7O細(xì)0.1650.000Q9HC84粘蛋白-5B前體2185393.91.6-2.4O細(xì)0.0190.000GO1469表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白*20911658-1.9-4.3-2.3o細(xì)O細(xì)o細(xì)PI5924橋粒斑蛋白(DP)2100-18.2-20.30.000O細(xì)Q9UBC9小的富含脯氨酸的蛋白3222146209-1.6-1.21.30.0000.5310.001P80188中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白1743352.41.8-1.40.0010.0120.365P62328胸腺素(3-4(Tp4)1031352.82.910.0010.0000.622P31949Calgizzarin*521143.52.2-1.60.0010.0350.235P04792熱休克蛋白卩-1*30114-2.6-6.8-2.60.002O細(xì)0.065P62807組蛋白H2B0908.1-9.20.0030.003060437斑周蛋白1222-4.2-4.6-1.10.0050.0051.000P01040胱抑蛋白A(StefinA)*341518-2.2-2.11.10.0060.0250.601PI6403組蛋白H1.2(組蛋白Hid)0817.31.6-4.60.0070.5600.028P04406甘油醛-3-磷酸脫氬酶1635392.12.1-l0.0070.0020.642P13796L-絲束蛋白(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白1)822302.531.20.0090.0000.266P05109鈣粒蛋白A*961341721.41.61.20.0120.0000.030P00338L-乳酸脫氫酶A鏈0706.5-7.40.0130.013PI4923連接斑珠蛋白(橋粒斑蛋白III)1330-3.4-13-3.80.0150.0000.165P52566pGDP-角軍離氺卩制劑217123.65.21.40.0240.0010.249P3194714-3-3蛋白a*21003.4-2.9-10.10.0270.3060.0021)04080胱抑蛋白B(肝疏醇蛋白酶抑制劑)5073191.4-2.9-4.20.0380.0000.000PI2429膜聯(lián)蛋白A3(膜聯(lián)蛋白III)*肌動蛋白抑制蛋白-1(肌動蛋白抑制蛋白1425482.91.70.076o扁0.007P07737I)2234491.51.91.30.107o細(xì)0.099P62805組蛋白114101841.7-2.4-4.10.1280.1030.002P06702鈣粒蛋白B*2402724261.11.71.50.1570.000O扁P62937肽酰-脯氨酸基順式-反式異構(gòu)酶A1480-1.7-13.9-8.30.2180.0000.007P02763a-l-酸性糖'蛋白1前體712381.64.22.70.249o細(xì)0.000P01009a-l-抗胰蛋白酶前體25571.916.18.50.249o細(xì)0.000P8051I鈣粒蛋白C02212.615.86.20.306o扁0.000P0I042激肽酶前體110-1.92.34.50.306o馬o扁P02774維生素D結(jié)合蛋白前體(DBP)36221.74.92.90.313o細(xì)0.002P61626溶菌酶C前體363057-1.21.41.70.4600.0290.004P08758膜聯(lián)蛋白A5(膜聯(lián)蛋白V)01111.88.74.90.560O扁0.005P08833*胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白10141.83.72.10.5600.0800.250043707a-輔月'L動蛋白4911241.22.21.90.654o遍0.026P29508鱗狀細(xì)胞癌抗原18083351-2.6-2.60.814o細(xì)0.0001)02787血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(鐵傳遞蛋白)8989194-1220.9700.0000.000P00738觸珠蛋白前體161640-l2.12.21.000o扁0.001P02751#纖連蛋白前體(FN)0043.73.70.0800.080#顯示出顯著倍數(shù)變化、但因譜計(jì)數(shù)數(shù)量小沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)上顯著性的蛋白。*在2D-D1GE分析中也顯示差別表達(dá)的蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>權(quán)利要求1.在懷孕雌性哺乳動物受試者中確定子宮內(nèi)感染的存在的方法，包含(a)檢測兩種或更多種選自下組的蛋白質(zhì)在來自該受試者的CVF樣品中的豐度相對于正常宮頸液體中或已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體中的豐度觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738)、α-1-酸性糖蛋白(Swiss-Prot登錄號P02763)、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833)；和(b)當(dāng)受試者CVF樣品中的豐度與所述正常宮頸液體中的豐度相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者與所述已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則得出存在子宮內(nèi)感染的結(jié)論。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。3.權(quán)利要求2的方法，包括檢測至少三種所述蛋白質(zhì)的豐度。4.權(quán)利要求2的方法，包括檢測所有四種所述蛋白質(zhì)的豐度。5.權(quán)利要求2的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自肌動蛋白抑制蛋白(Swiss-Prot登錄號P07737)、血清白蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P2768)、4丐粒蛋白B(Swiss-Prot登錄號P06702)和鱗狀細(xì)胞癌抗原l(Swiss-Prot登錄號P29508)。6.權(quán)利要求2或5的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自a-l-抗胰蛋白酶前體(Swiss-Prot登錄號P01009)、纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)、膜聯(lián)蛋白A2(Swiss-Prot編號P07355)、維生素-D結(jié)合蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02774)。7.權(quán)利要求1或5的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040)、粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot登錄號Q9HC84)、小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9)、溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。8.權(quán)利要求6的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040)、粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot登錄號Q9HC84)、小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9)、溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。9.權(quán)利要求2的方法，其中所述豐度通過免疫分析確定。10.權(quán)利要求2的方法，其中所述豐度通過質(zhì)譜確定。11.權(quán)利要求2的方法，其中所述豐度用蛋白質(zhì)陣列確定。12.確定具有過早陣痛癥狀的懷孕雌性哺乳動物受試者中早產(chǎn)可能性的方法，包含(a)檢測兩種或更多種選自下組的蛋白質(zhì)在來自該受試者的CVF樣品中的豐度相對于正常宮頸液體中或已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體中的豐度觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738)、a-l-酸性糖蛋白l(Swiss-Prot登錄號P02763)、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)、和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833);和(b)當(dāng)受試者CVF樣品中的豐度與所述正常宮頸液體中的豐度相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，或者與所述已知指示子宮內(nèi)感染的宮頸液體的豐度相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。14.權(quán)利要求13的方法，包含檢測至少三種所述蛋白質(zhì)的豐度。15.權(quán)利要求13的方法，包含檢測所有四種所述蛋白質(zhì)的豐度。16.權(quán)利要求13的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自肌動蛋白抑制蛋白(Swiss-Prot登錄號P07737)、血清白蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P2768)、4丐粒蛋白B(Swiss-Prot登錄號P06702)和鱗狀細(xì)胞癌抗原1(Swiss-Prot登錄號P29508)。17.權(quán)利要求13或16的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自a-l-抗胰蛋白酶前體(Swiss-Prot登錄號P01009)、纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)、膜聯(lián)蛋白A2(Swiss-Prot登錄號P07355)、維生素-D結(jié)合蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02774)。18.權(quán)利要求13或16的方法，還包括檢測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040)、粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot登錄號Q9HC84)、小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9)、溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。19.權(quán)利要求17的方法，還包括^^測一或多種額外蛋白質(zhì)的豐度，所述額外蛋白質(zhì)選自胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040)、粘蛋白-5B前體(Swiss-Prot編號Q9HC194)、小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9)、溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。20.權(quán)利要求13的方法，其中所述豐度通過免疫分析確定。21.權(quán)利要求13的方法，其中所述豐度通過質(zhì)譜確定。22.權(quán)利要求13的方法，其中所述豐度用蛋白質(zhì)陣列確定。23.權(quán)利要求13的方法，其中當(dāng)不能基于所述4全驗(yàn)預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生時(shí)，再檢測受試者中纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)的豐度，當(dāng)該豐度與所述正常宮頸液體中的豐度相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，則預(yù)測早產(chǎn)的發(fā)生。24.權(quán)利要求13的方法，其中在所述步驟(a)之前確定纖連蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02751)的豐度。25.免疫分析試劑盒，包含用于檢測兩種或更多種選自下組的蛋白的抗體和試劑觸珠蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P00738)、a-l-酸性糖蛋白(SwissProt編號P02763)、表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號Q01469)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Swiss-Prot登錄號P08833)。26.權(quán)利要求25的免疫分析試劑盒，還包含用于檢測至少一種選自下組的蛋白的抗體和試劑肌動蛋白抑制蛋白-l(Swiss-Prot登錄號P07737);血清白蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P2768);鈣粒蛋白B(Swiss-Prot登錄號P06702);鱗狀細(xì)胞癌抗原1(Swiss-Prot登錄號P29508);a-l-抗胰蛋白酶前體(Swiss-Prot登錄號P01009);纖連蛋白前體(SwissProt編號P02751);膜聯(lián)蛋白A2(Swiss-Prot登錄號P07355);維生素-D結(jié)合蛋白前體(Swiss-Prot登錄號P02774);胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040);粘蛋白-58前體(8評135-Prot登錄號Q9HC84);小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9);溶菌酶C前體(Swiss-Prot編號P61626);和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787);胱抑蛋白A(Swiss-Prot登錄號P01040);粘蛋白-5B前體(Swiss-ProtAcc.No.Q9HC84);小的富含脯氨酸的蛋白3(Swiss-Prot登錄號Q9UBC9)、溶菌酶C前體(Swiss-Prot登錄號P61626)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白前體(P02787)。全文摘要本發(fā)明涉及鑒定生物液體的蛋白質(zhì)組以及其在確定母體/胎兒病癥狀態(tài)，包括來自胎兒的母體病癥、染色體非整倍性、以及與胎兒生長和成熟有關(guān)的胎兒疾病中的用途。特別地，本發(fā)明涉及對人羊水(AF)和CVF(CVF)的全面的蛋白質(zhì)組分析，以及將正常蛋白質(zhì)組的特征性變化與各種病理性母體/胎兒狀況相關(guān)，例如IAI、過早陣痛、和/或染色體缺陷。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定能被用于非侵入性診斷各種妊娠相關(guān)病癥的生物標(biāo)志物以及生物標(biāo)志物的組，以及利用這樣的生物標(biāo)志物進(jìn)行的診斷測定。文檔編號G01N33/68GK101611319SQ200780049548公開日2009年12月23日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2006年11月9日發(fā)明者斯里尼瓦薩·納加拉,羅恩·羅森菲爾德,邁克·格雷維特申請人:普羅特奧格尼克斯公司