人類ptx3重組蛋白的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人類重組蛋白的制備方法，具體涉及到人類PTX3重組蛋白的制 備方法及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 五聚素3 (PTX3)是五聚素蛋白家族成員之一，屬于長(zhǎng)鏈五聚體蛋白。PTX3是急性 期反應(yīng)蛋白的一種。研究表明，PTX3是一種可溶性病原模式識(shí)別受體（PRR)，可迅速選擇性 識(shí)別入侵的外源病原體并與之結(jié)合，這是激發(fā)機(jī)體先天性免疫和繼發(fā)性免疫應(yīng)答，從而清 除入侵病原體的關(guān)鍵的第一步。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型已證實(shí)，PTX3可以選擇性地高親 和力地與某些病原體，包括巨細(xì)胞病毒（CMV)，流感病毒（Influenza)，鼠肝炎病毒（MHV)， 鼠傷寒沙門菌和銅綠假單胞菌以及煙曲霉菌等結(jié)合，引起初次和二次免疫應(yīng)答，刺激炎性 細(xì)胞因子表達(dá)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，刺激炎性細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而導(dǎo)致入侵病原體的限制與清 除，減輕病原體對(duì)身體的損傷。因此，PTX3被認(rèn)為具有十分巨大臨床治療藥用價(jià)值。
[0003] 2003年，始于中國(guó)的病毒感染引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（SARS)導(dǎo)致了全球性 的恐慌。此后，幾次禽流感/豬流感大流行依然是全球公共健康最嚴(yán)重的威脅之一。其后， 中國(guó)出現(xiàn)的新型H7N9禽流感病毒，以及最近在中東與東亞流行的MERS，均有潛力成為大流 行病毒。這些病毒可從動(dòng)物傳染到人類，具有極高的死亡率。雖然已投入巨資，特異性抗病 毒藥物的研制卻并沒有取得顯著的進(jìn)展。應(yīng)用小鼠感染MHV1病毒可誘發(fā)如SARS樣的急性 肺損傷模型。我們的研究證明重組表達(dá)的PTX3可直接與MHV病毒結(jié)合并顯著性地抑制病 毒復(fù)制。內(nèi)源性PTX3或給予重組表達(dá)的PTX3可以增強(qiáng)被感染的動(dòng)物的病毒清除，并保護(hù) 他們免受嚴(yán)重的肺部損傷。其他的研究也表明內(nèi)源性PTX3表達(dá)或給予外源性重組PTX3具 有抗真菌和抗細(xì)菌作用。PTX3基因敲除導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)肺病毒與真菌感染的易感性增 高，給予重組表達(dá)的PTX3則恢復(fù)其對(duì)病毒與真菌感染抵抗力。提高PTX3表達(dá)水平（基因 敲入）已證明可提高動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素血癥和敗血癥的存活率。
[0004] 利用重組DNA來表達(dá)多種生物活性的蛋白質(zhì)，是一種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)， 它被廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究。而保證重組蛋白質(zhì)具有充分的生物活性與功能的關(guān) 鍵則完全依賴于其合成后正確的折疊（Folding)和翻譯后修飾（Posttranslational modification)例如磷酸化、二硫鍵的形成以及人類特異的糖基化。
[0005] 目前PTX3主要靠原核蛋白重組表達(dá)獲得，雖然利用原核細(xì)胞表達(dá)重組PTX3有較 高的得率，但其因缺乏真核細(xì)胞的后期折疊修飾機(jī)制，因此其生物活性有限。而由哺乳動(dòng)物 細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白則能很好地彌補(bǔ)這些缺陷，使其所表達(dá)的重組蛋白具有類似于天然蛋 白的生物活性。為了表達(dá)結(jié)構(gòu)修飾完善，具有高生物活性的PTX3,我們選擇中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì) 胞（CH0)作為表達(dá)靶細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行了基因改造使之成為可長(zhǎng)時(shí)間高密度持續(xù)培養(yǎng)的抗 凋亡細(xì)胞。我們還構(gòu)建了含抗新霉素基因的可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)人類PTX3重組 蛋白的DNA載體，建立了可穩(wěn)定表達(dá)重組人類PTX3蛋白的哺乳動(dòng)物（CH0-K1)細(xì)胞株。初 步提純后經(jīng)細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，重組人類PTX3蛋白具有很高的生物功能活性，對(duì)治 療呼吸道SARS樣病毒感染具有藥理治療價(jià)值。
[0006] 在過去的幾十年里，人類對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究開發(fā)，取得了 很大進(jìn)展，但是利用CH0-K1細(xì)胞表達(dá)外源基因的技術(shù)水平尚不能滿足生物藥品的開發(fā)和 生產(chǎn)的要求，目前上游工作中主要存在以下問題：
[0007] ①構(gòu)建的重組CH0-K1細(xì)胞生產(chǎn)效率低，產(chǎn)物濃度亦低；
[0008] ②某些糖基化表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化；
[0009] ③重組CH0-K1細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)在上游構(gòu)建時(shí)著重 考慮它的高效表達(dá)，而對(duì)高效表達(dá)的產(chǎn)物是否能有效地提取出來，即分離純化過程考慮較 少；
[0010] ④重組細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)用昂貴，自動(dòng)化水平低下。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了一種人類PTX3重組蛋白的制備方法，提高了人類PTX3重組蛋白的 產(chǎn)出率。
[0012] 本發(fā)明提供了一種從人類的原代上皮細(xì)胞中提取攜帶人類PTX3蛋白信息mRNA進(jìn) 而制備PTX3重組蛋白的方法。人類的原代上皮細(xì)胞類型單一極其接近自然狀態(tài)，RNA酶活 性低，提取的RNA產(chǎn)量高，純度高，無降解，保證了核苷酸序列的完整性，使反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 的成功率大大提高。
[0013] 本發(fā)明通過重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，氨芐青霉素選擇培育擴(kuò)增陽性轉(zhuǎn)化菌落提 取所構(gòu)建的PTX3表達(dá)質(zhì)粒，并以特異性內(nèi)切酶消化與核苷酸測(cè)序相結(jié)合的方法確定所構(gòu) 建的正確性。
[0014] 本發(fā)明提供了一種對(duì)CH0-K1細(xì)胞的內(nèi)源性基因進(jìn)行特異性改造，敲除其促凋亡 因子bax和bak基因的方法。建立了具有抗凋亡特性的重組CH0-K1細(xì)胞，提高了重組蛋白 表達(dá)細(xì)胞持續(xù)存活時(shí)間與細(xì)胞培養(yǎng)密度，有利于重組蛋白的積累，進(jìn)而提高了重組蛋白產(chǎn) 出率。
[0015] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種人類PTX3重組蛋白的 制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0016]S1、從人類的原代上皮細(xì)胞中提取攜帶PTX3蛋白翻譯信息的mRNA，設(shè)計(jì)特異性引 物，以所述mRNA為模板，合成cDNA，并在所述cDNA的兩端分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamHI 和BglII;
[0017]S2、用內(nèi)切酶暴露出真核細(xì)胞表達(dá)載體pSG5上的BamHI和BglII粘性末端，將 上述帶有BamHI和BglII末端的所述cDNA克隆到所述表達(dá)載體上構(gòu)建pSG5/PTX3載體， 在所述PSG5/PTX3載體中插入新霉素抗性基因，構(gòu)建重組載體pSG5/neo/PTX3 ;
[0018]S3、將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，用氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出陽性菌 落，擴(kuò)增陽性轉(zhuǎn)化菌落，提取所述重組載體進(jìn)行測(cè)序鑒定；
[0019]S4、敲除CH0-K1細(xì)胞中Bax和Bak基因，得到具有抗凋亡特性的目標(biāo)細(xì)胞并冷藏；
[0020] S5、以純化并測(cè)序鑒定后的所述重組載體轉(zhuǎn)染所述目標(biāo)細(xì)胞中以得到表達(dá)細(xì)胞， 培育并篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的PTX3重組蛋白表達(dá)細(xì)胞株，從所述表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)液中富集并純 化人類PTX3重組蛋白。
[0021] 優(yōu)選地，對(duì)所述CH0-K1細(xì)胞進(jìn)行基因敲除的步驟具體包括：
[0022] S41、合成編碼Bak鋅指蛋白的第一基因和編碼Bax鋅指蛋白的第二基因，并分別 與非特異性核酸內(nèi)切酶基因FokI雜合；
[0023]S42、將所述第一基因、第二基因以及所融合的非特異性核酸內(nèi)切酶FokI基因片 段一并插入帶有抗卡那霉素基因的PVAX1載體中，構(gòu)建特異性內(nèi)源性基因敲除載體；
[0024]S43、將所述特異性內(nèi)源性基因敲除載體轉(zhuǎn)入所述CH0-K1細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)染的 CH0-K1細(xì)胞表達(dá)的所述帶有非特異性核酸內(nèi)切酶FokI的Bak鋅指蛋白和Bax鋅指蛋白， 分別特異性的錨定到所述CH0-K1細(xì)胞自身的Bak和Bax基因，進(jìn)而敲除所述促凋亡因子， 得到所述目標(biāo)細(xì)胞。
[0025] 優(yōu)選地，所述步驟S4中所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染所述重組載體之前還包括以下步驟：
[0026]S44、在轉(zhuǎn)染前7天，將所述目標(biāo)細(xì)胞用添加有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)于24孔板中；
[0027]S45、在轉(zhuǎn)染前6天至轉(zhuǎn)染前1天的期間，每天更換培養(yǎng)液的同時(shí)丟棄一半數(shù)目的 所述目標(biāo)細(xì)胞，使用由CD-CH0無血清培養(yǎng)液和含有體積分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血清的F12培養(yǎng) 液組成的混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中所述混合培養(yǎng)液中的胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)每天遞減2 %，直 至為〇，在轉(zhuǎn)染前1天將所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，每孔裝有2mL的所述目標(biāo)細(xì)胞 懸浮液。
[0028]優(yōu)選地，所述F12 培養(yǎng)液中添加 4. 76g/L的HEPES和 125mg/LL-glutamine。
[0029] 優(yōu)選地，所述6孔板中每孔細(xì)胞數(shù)為2. 7 X 105個(gè)。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟S5中所述目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染所述重組載體之后，表達(dá)細(xì)胞的篩選培 育具體步驟如下：
[0031]S51、將所述重組載體轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)液中添加 700yg/mL的G418;
[0032] S52、待表達(dá)細(xì)胞在含有700yg/mLG418的培養(yǎng)液中擴(kuò)增至培養(yǎng)瓶底面積的80% 時(shí)，將一瓶中的所述表達(dá)細(xì)胞均分至3瓶培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液中G418的濃度減少至200yg/ mL；
[0033]S53、待表達(dá)細(xì)胞繁殖融合至培養(yǎng)瓶底面積的50%時(shí)，將這3瓶中的細(xì)胞匯總并記 錄細(xì)胞的總數(shù)。
[0034] 優(yōu)選地，所述步驟S5中篩選表達(dá)細(xì)胞具體包括以下步驟：
[0035]S54、取步驟S53中的經(jīng)G418選擇培養(yǎng)的陽性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行序列稀釋后培養(yǎng)于3 塊96孔培養(yǎng)板上，每個(gè)孔加200yL細(xì)胞懸液約含5個(gè)表達(dá)細(xì)胞；待細(xì)胞繁殖融合至底面積 1/3時(shí)，取上清做PTX3Dot-Blot檢測(cè)，選擇PTX3強(qiáng)陽性孔的細(xì)胞集落進(jìn)行再次亞克隆篩 選；
[0036]S55、待亞克隆細(xì)胞融合度達(dá)底面積1/3時(shí)，取細(xì)胞上清液重復(fù)PTX3Dot-Blot檢 測(cè)，挑選強(qiáng)陽性的細(xì)胞克隆做進(jìn)一步篩選擴(kuò)增，如此反復(fù)進(jìn)行多次篩選，直至所有細(xì)胞克隆 孔的上清培養(yǎng)液PTX3Dot-Blot檢測(cè)均達(dá)強(qiáng)陽性后，再次從亞克隆培養(yǎng)板中以Dot-Blot的 陽性強(qiáng)度挑選數(shù)株陽性強(qiáng)度最高的