一種提高M(jìn)iDGAT1在啤酒酵母中的三酰甘油合成能力的多肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及缺刻緣綠藻二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶 1 (MiDGATI)中的 Pleckstrin 同源性（Pleckstrin Homology，PH)結(jié)構(gòu)域（domain)序列及 功能鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今世界，隨著人類對(duì)各種礦產(chǎn)資源，如煤、石油、天然氣等利用的不斷耗盡，人類 急于尋找新的能源來源，特別是可再生資源。生物柴油，特別是微藻生物柴油，是一種可再 生資源，是人類急于尋找和探索的新能源之一，也是近年科學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)的 生物柴油的原料相比，例如植物油脂和動(dòng)物脂肪，微藻具有生長快、生物量豐富、含油量高 和不占用土地等非常多的優(yōu)勢(shì)。缺刻緣綠藻（Myrmecia incisa Reisigl H4301)是一種淡 水單細(xì)胞微藻，隸屬綠藻門（Chlorophyta)。該藻在氮饑餓脅迫下能大量積累花生四烯酸 (ArA)，且在細(xì)胞中是以三酰甘油（TAG)的形式儲(chǔ)存在油滴中。因此，該藻是潛在的生產(chǎn)微 藻生物柴油藻種。
[0003] 微藻生物柴油主要來自于存儲(chǔ)脂類，其中最重要的一類就是TAG。TAG是一類中性 脂質(zhì)，代表了真核細(xì)胞中最重要的能量存儲(chǔ)形式。在許多植物中，TAG常積聚在種子中，但 花瓣、花粉和果實(shí)也能存儲(chǔ)TAG。TAG是人類消費(fèi)的主要可再生資源，除了食用，它們也被用 來生產(chǎn)油漆、洗滌劑、潤滑劑、生物燃料和尼龍等方面。
[0004] TAG的合成主要是通過各種酶沿著肯尼迪途徑（Kennedy pathway)來完成的，這 些酶依次把?；o酶A的?；溵D(zhuǎn)移到甘油骨架的sn-l、sn-2和sn-3位置。?；o酶A : 二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT，EC 2. 3. 1. 20)是一種具有催化活性的跨膜蛋白，作用于TAG 生物合成的最后步驟。它以?；o酶A為底物，催化并使sn-l，2-二?；视停―AG)的sn-3 位?；?，從而形成TAG。因此，DGAT被認(rèn)為是TAG生物合成的關(guān)鍵酶，它有可能被用來增加 含油植物的含油量。目前，研究發(fā)現(xiàn)了 3種類型的DGAT，即DGATUDGAT2和DGAT3,且表明， DGAT1和DGAT2是負(fù)責(zé)TAG合成的，而DGAT3被證明是參與了角質(zhì)的生物合成。在很多高等 植物中雖然已經(jīng)證明了 DGAT1具有TAG的合成功能，但是對(duì)微藻DGAT1合成TAG的功能研 究還是比較少的，目前只在三角褐脂藻（Phaeodactylum tricornutum)中有報(bào)道，但有關(guān)藻 類DGAT1中PH結(jié)構(gòu)域的功能研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種多肽。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種分離的核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組表達(dá)載體。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種基因工程化的宿主細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供上述多肽、核苷酸序列、重組表達(dá)載體或宿主細(xì)胞的 用途。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] -種多肽，所述多肽的氨基酸序列選自：
[0012] a) SEQIDN0:26的第47-153位置所示的氨基酸序列；或
[0013] b)SEQIDN0:26所示的氨基酸序列。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0015] -種分離的核苷酸序列，所述的核苷酸序列選自下列中的任一種：
[0016] a) SEQIDN0:14的第408-728位置所示的核苷酸序列；
[0017] b)SEQIDN0. 14所示的核苷酸序列；
[0018] c)SEQIDN0. 25所示的核苷酸序列。
[0019] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0020] -種重組表達(dá)載體，所述的重組表達(dá)載體是由如上所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿?毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
[0021] 優(yōu)選地，所述的質(zhì)粒是pYES2質(zhì)粒。
[0022] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0023] -種基因工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞選自于下列中的一種：
[0024] a)用如上所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞；
[0025] b)用如上任一所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
[0026] 優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿 主細(xì)胞的后代。
[0027] 更優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
[0028] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0029] 如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上任一所述的重組表達(dá)載體、或如上 任一所述的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)三酰甘油中的用途。
[0030]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0031] 本申請(qǐng)發(fā)明人克隆獲得一種新的DGAT基因，命名為MiDGATl，其編碼的蛋白與這 2 種藻(Auxenochlorella protothecoides， GenBank ID：KFM28983 ；Tetraselmis sp.，GenBank ID:JAC66181)的DGAT1氨基酸相似性均達(dá)40%。同時(shí)，新奇地發(fā)現(xiàn)MiDGATl編碼 的蛋白含有一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由107個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，且與藻類Auxenochlorella protothecoides(GenBank ID :KFM28983)的PH結(jié)構(gòu)域（由97個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成）氨基酸 相似性為42%。據(jù)此，發(fā)明人在已報(bào)道的藻類DGAT研究中搜索，還沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于藻類DGAT1 中PH結(jié)構(gòu)域的功能性研究報(bào)道。進(jìn)而，發(fā)明人探討了該P(yáng)H結(jié)構(gòu)域序列在MiDGATl合成 TAG過程中的作用。通過將編碼PH結(jié)構(gòu)域的cDNA片段從MiDGATl基因中切除，將剩余部 分（命名為MiDGATl- A PH)和MiDGATl分別轉(zhuǎn)入到TAG合成缺陷啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株H1246中表達(dá)，即進(jìn)行基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MiDGATl和MiDGATl- A PH 編碼的蛋白都具有合成TAG的能力，但通過半定量薄層色譜方法發(fā)現(xiàn)MiDGATl酵母合成的 TAG含量要比MiDGATl- A PH酵母高得多，從而證明了 PH結(jié)構(gòu)域序列能增強(qiáng)MiDGATl在酵母 中合成TAG的能力。據(jù)此可將含有該P(yáng)H結(jié)構(gòu)域的MiDGATl在油料等作物中表達(dá)以顯著增 加三酰甘油的產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0032] 圖1.缺刻緣綠藻MiDGATl基因結(jié)構(gòu)示意圖?；疑€是非翻譯區(qū)，黑色線為內(nèi)含子， 黑色框?yàn)橥怙@子。
[0033]圖2?酵母細(xì)胞的Bodipy染色圖片。其中MiDGAT2A(ZL201210477507. 7)、 MiDGAT2B(ZL201310668330. 3)是本實(shí)驗(yàn)室已申請(qǐng)的2件發(fā)明專利涉及的DGAT，在此作為參 照。
[0034] 圖3.酵母油脂的TLC圖譜。從左道到右道依次為MiDGATl- A PH、TAG標(biāo)準(zhǔn)品（英 國Nu-Chek公司）、MiDGATl、MiDGAT2A、MiDGAT2B、野生型酵母Scy62、缺陷株H1246、攜帶 PYES2的缺陷株。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0036] 本發(fā)明的主要技術(shù)路線為：
[0037] (1)將缺刻緣綠藻接種于BG-11培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，置于溫度為25°C、光照強(qiáng) 度為115 ymol photons ? m 2 ? s \光照周期為光照：黑暗/12h: 12h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天 定期搖晃數(shù)次。收集藻體細(xì)胞，并提取基因組總RNA和DNA。
[0038] (2)基于缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組庫，通過同源性搜索和基因注釋，得到了 2條分別長 378bp (編號(hào)為 fu-G624HK004JT9FD)和 226bp (編號(hào)為 fu-G624HK004J09X9)的短片段。用 PCR擴(kuò)增這2條片段，并將產(chǎn)物序列進(jìn)行拼接，得到了 一條長641bp的cDNA片段?；谠?片段序列，我們利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE)技術(shù)克隆到該基因的全長cDNA序列，命名 為MiDGATl。然后，利用缺刻緣綠藻總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證 MiDGATl的cDNA全長序列。在此基礎(chǔ)上，同時(shí)利用缺刻緣綠藻DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到MiDGATl的DNA全長序列。
[0039] (3)首先將PH結(jié)構(gòu)域序列從MiDGATl基因中切除，剩余部分的片段命名為 MiDGATl-APH。然后根據(jù)MiDGATl和MiDGATl-APH的cDNA序列設(shè)計(jì)特