一種從啤酒酵母中提取的奧古蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及活性蛋白的提取，具體涉及一種從啤酒酵母中提取的奧古蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 奧古蛋白（Orgotein)是由豬、牛、羊的肝和紅細(xì)胞等組織為原料分離提取而制得 的一種水溶性蛋白質(zhì)，為一種肽鏈大分子金屬酶。在生物學(xué)領(lǐng)域，具有消炎等功效，目前，正 被越來越多地應(yīng)用到化妝品領(lǐng)域。奧古蛋白多存在于生物體中，人工合成具有很大難度，因 此，選擇適合的提取原料和相應(yīng)的提取方法，獲得奧古蛋白，從而解決奧古蛋白的來源問題 以適應(yīng)對其大量的需求，是本領(lǐng)域目前需要解決的問題。
[0003] 啤酒酵母是生產(chǎn)啤酒過程中的關(guān)鍵原料，其中含有大量的奧古蛋白成分。并且，在 啤酒的生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量廢啤酒酵母，目前有很多生產(chǎn)企業(yè)對啤酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的 廢啤酒酵母進(jìn)行再利用，將啤酒廢啤酒酵母進(jìn)行提純、復(fù)壯、擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為原料用于提 取各種活性物質(zhì)。綜上所述，啤酒酵母或廢啤酒酵母中奧古蛋白含量豐富，且具有大量的資 源，是用來提取奧古蛋白的理想原料。
[0004] 專利文獻(xiàn)CN1800377A公開了一種用釀酒酵母菌體提取純化得到銅/鋅超氧化物 歧化酶的方法。所述的用釀酒酵母菌體提取純化銅/鋅超氧化物歧化酶的生產(chǎn)工藝過程 是：將釀酒酵母菌體經(jīng)過破壁提酶，丙酮二次沉淀，DEAE-32纖維素柱層析得到純化精制的 酶。經(jīng)比較和研宄可知，現(xiàn)有技術(shù)提供的從酵母中提取奧古蛋白的工藝中，丙酮沉淀仍是其 中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，作為有機(jī)溶劑的丙酮，有著一定的毒性，不符 合目前環(huán)保趨勢，并且丙酮在一定程度上還會引起蛋白質(zhì)活性丟失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種從啤酒酵母中提取的具有優(yōu)異抗 氧化活性的奧古蛋白，所述奧古蛋白的原料來源豐富，提取工藝高效、安全、環(huán)保，應(yīng)用價值 廣泛。
[0006] 本發(fā)明提供了一種從啤酒酵母中提取的奧古蛋白，所述奧古蛋白由包括以下步驟 的方法制備而成：
[0007] 1)將啤酒酵母溶解于磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 5?6. 7， 濃度為〇. 04?0. 06mol/L;在1000?2000bar條件下高壓均質(zhì)，循環(huán)5?10次，離心，取 上清液；加入硫酸銨靜置、離心、收集沉淀；
[0008] 2)將步驟1)所得沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為 6. 5?6. 7,濃度為0. 02?0. 03mol/L，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱S印hadex G-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫 液，濃縮，得濃縮液；
[0009] 3)在步驟2)所得濃縮液加入平衡好的金屬螯合親和柱頂端，用檸檬酸緩沖液進(jìn) 行洗脫，所述檸檬酸緩沖液的pH值為4. 5?6. 0,濃度為0. 02?0. 03mol/L;收集含有蛋白 質(zhì)的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得奧古蛋白。
[0010] 本發(fā)明步驟1)中所述啤酒酵母作為提取奧古蛋白的原料，具有來源廣泛、生物安 全性高的特點(diǎn)；并且啤酒酵母中奧古蛋白含量較高，適于規(guī)模化生產(chǎn)奧古蛋白。所述啤酒酵 母可以是新鮮的啤酒酵母，也可以對啤酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢啤酒酵母進(jìn)行再利用，按照 常規(guī)方法將啤酒廢啤酒酵母進(jìn)行提純、復(fù)壯、擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為原料用于提取奧古蛋白。
[0011] 本發(fā)明所述步驟1)中：所述高壓均質(zhì)的壓力為1000?2000bar，優(yōu)選為1500bar， 高壓均質(zhì)應(yīng)循環(huán)進(jìn)行多次，以保證提取率，循環(huán)次數(shù)為5?10次，優(yōu)選為8次；所述磷酸鹽 緩沖液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液，該緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇5mol/L，pH值優(yōu)選為 6. 6 ;啤酒酵母與磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量體積比為1 :2?8,優(yōu)選為1 :4,此處啤酒酵母的質(zhì)量 單位為g，磷酸鹽緩沖液的體積單位為ml;所述離心的溫度為2?4°C，優(yōu)選為3°C，離心速 度為1000?5000rpm，優(yōu)選為3000rpm，離心時間為5?15min，優(yōu)選為lOmin。
[0012] 該步驟獲得上清液后，加入硫酸銨后對蛋白進(jìn)行沉淀；具體采用兩次分級硫酸銨 沉淀，步驟為：將硫酸銨以質(zhì)量體積比0. 3?0. 5:1溶解于上清液中，靜置30?60min，在 2?4°C、8000?9000rpm條件下離心15?30min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸按以質(zhì)量 體積比0. 7?0. 9:1加入所得上清液中，靜置15?45min，在2?4°C、8000?9000條件下 離心15?30min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并；此處硫酸按的質(zhì)量單位為g，粗 提液的體積單位為ml。
[0013] 本發(fā)明所述步驟2)采用凝膠層析法除去硫酸銨，能快速獲得不含硫酸銨的蛋白 溶液，避免了常規(guī)透析除鹽方法的繁冗過程和可能造成的目標(biāo)產(chǎn)物損失。具體的，所述磷酸 鹽緩沖液為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液；緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇25mol/L，pH值優(yōu)選 為6. 6 ;步驟3)所得沉淀以質(zhì)量體積比1:1?5溶解于磷酸鹽緩沖液中，此處沉淀的質(zhì)量 單位為g，磷酸鹽緩沖液體積的單位為ml;葡聚糖凝膠柱選用SephadexG-25,凝膠柱的平 衡和流動相的洗脫均為常規(guī)操作；所述濃縮優(yōu)選為聚乙二醇濃縮法，所述聚乙二醇優(yōu)選為 PEG4000，濃縮步驟為常規(guī)操作。
[0014] 本發(fā)明所述步驟2)采用奈氏試劑比色法鑒定洗脫液中的硫酸銨；該方法具體為： 取1滴洗脫液，滴在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棕黃色沉淀則表明洗 脫液中含有硫酸銨。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，步驟2)收集的目標(biāo)洗脫液進(jìn)行該檢測后，不應(yīng)出現(xiàn)棕 黃色沉淀。
[0015] 本發(fā)明所述步驟2)和步驟3)中，采用磺基水楊酸比色法鑒定洗脫液中的蛋白質(zhì)； 該方法具體為：取1滴洗脫液，滴在黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸混合，若出 現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液中含有蛋白質(zhì)。按照上述標(biāo)準(zhǔn)，步驟2)收集的目標(biāo)洗脫液進(jìn) 行該檢測后，應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
[0016] 本發(fā)明所述步驟3)通過金屬親和層析法進(jìn)行蛋白純化，能夠快速獲得純化后的 奧古蛋白，能夠避免奧古蛋白的活性損失，且安全性更尚，更環(huán)保；具體而目，為了提尚純化 效率，在步驟2)所得濃縮液中，加入0. 5?0. 8mol/LNaCl，再加入平衡好的金屬螯合親和 柱頂端；本步驟中金屬螯合親和柱所螯合的金屬離子選自銅、鋅、鐵、鎳離子等金屬螯合親 和層析中常用的螯合用金屬離子；檸檬酸緩沖液的濃度優(yōu)選為〇. 〇25mol/L，pH值優(yōu)選為 5. 2 ;所述濃縮優(yōu)選為聚乙二醇濃縮法，所述聚乙二醇優(yōu)選為PEG4000,濃縮步驟為常規(guī)操 作。
[0017] 作為本發(fā)明的最優(yōu)選方案，所述奧古蛋白由包括以下步驟的方法制備而成：
[0018] 1)將啤酒酵母以質(zhì)量體積比1:4溶解于磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH 值為6. 6,濃度為0. 05mol/L;在1500bar條件下高壓均質(zhì)，循環(huán)8次，在3°C、3000rpm條件下 離心lOmin，取上清液；將硫酸銨以質(zhì)量體積比0. 4:1溶解于上清液中，靜置45min，在3°C、 8500rpm條件下離心20min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸按以質(zhì)量體積比0. 8:1加入所得 上清液中，靜置30min，在3°C、8500條件下離心20min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合 并；
[0019] 2)將步驟1)所得沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為6.6， 濃度為〇. 〇25mol/L，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱S印hadexG-25頂端，用本步 驟所述磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，濃縮，得濃縮液；
[0020] 3)在步驟2)所得濃縮液中加入0. 6mol/LNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的 金屬螯合親和柱頂端，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，所述檸檬酸緩沖液的pH值為5. 2,濃度為 0. 025mol/L;收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，用PEG4000濃縮，冷凍干燥，即得奧古蛋白。
[0021] 本發(fā)明所述磷酸鹽緩沖液均為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。
[0022] 為了保證制備得到的奧古蛋白的活性，本發(fā)明各個步驟的操作溫度均優(yōu)選為0? 4V。
[0023] 本發(fā)明提供的奧古蛋白呈藍(lán)色或藍(lán)綠色。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述從啤酒酵母中提取的奧古蛋白在制備化妝品中的應(yīng)用。由 于本發(fā)明提供的奧古蛋白具有優(yōu)異的抗氧化活性，因此可以作為制備化妝品的理想原料。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，發(fā)明提供的奧古蛋白產(chǎn)率高、純度高、活性好，可以用于制備化 妝品，具有良好的應(yīng)用前景。且該奧古蛋白的制備工藝安全、環(huán)保，原料來源豐富，適于工業(yè) 化大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0027] 本發(fā)明各實(shí)施例中，洗脫液中硫酸銨的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在白色 比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棕黃色沉淀則表明洗脫液中含有硫酸銨；洗脫 液中蛋白質(zhì)的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水 楊酸混合，若出現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液中含有蛋白質(zhì)。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 奧古蛋白由以下步驟制備而成：
[0030] 1)將100g啤酒酵母溶解于400ml磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值為 6. 6,濃度為0. 05mol/L;在1500bar條件下高壓均質(zhì)，循環(huán)8次，在3°C、3000rpm條件下離心 lOmin，取上清液；在上清液中加入187. 6g硫酸按，靜置45min，在3°C、8500rpm條件下離心 20min，分離上清液，收集沉淀；在上清液中加入300g硫酸銨，靜置30min，在3°C、8500條件 下離心20min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并，得沉淀5. 17g;
[0031] 2)將步驟1)所得沉淀溶解于15ml磷酸鹽緩沖液中，所述磷酸鹽緩沖液的pH值 為6. 6,濃度為0. 025mol/L，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱S印hadexG-25頂端， 用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，濃縮，得濃 縮液17ml;
[0032] 3)在步驟2)所得濃縮液中加入0.6mol/LNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的 金屬螯合親和柱頂端，用檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，所述檸檬酸緩沖液的pH值為5. 2,濃度 為0. 025mol/L;收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，用PEG4000濃縮，冷凍干燥，即得藍(lán)綠色粉末 18. 62mg〇
[0033] 經(jīng)蛋白凝膠電泳SDS-PAGE檢測，所得產(chǎn)品分子量與市售的奧古蛋白標(biāo)準(zhǔn)品相同。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] 奧古蛋白由以下步驟制備而成：