氨基甲酸酯橋環(huán)呫噸酮衍生物、其制備方法和醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一類氨基甲酸酯橋環(huán)咕噸酮衍生物及其制備 方法和其在制藥中的應(yīng)用。該類衍生物是藤黃屬天然產(chǎn)物藤黃酸的結(jié)構(gòu)類似物，具有抗腫 瘤作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 藤黃是熱帶及亞熱帶地區(qū)的藤黃屬植物的樹干劃裂后分泌的膠狀樹脂，在亞洲 作為藥物使用已有數(shù)百年的歷史。其中天然產(chǎn)物藤黃酸（gambogicacid/GA)的抗腫瘤 活性最為顯著。研究表明，藤黃酸能夠選擇性的殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常造血系統(tǒng)和白細(xì) 胞無明顯影響。研究表明藤黃酸可通過是增加抑癌基因Bax與減少誘癌基因Bcl-2表 達(dá)（CancerChemother.Pharmacol.，2006, 58, 434-443.)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，藤黃酸 通過調(diào)控⑶K7(cyclin_dependentkinase7)的磷酸化功能可使細(xì)胞周期停留在G2/M 期，從而對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖產(chǎn)生抑制作用（Carcinogenesis, 2007, 28, 632-638.)。 同時(shí)藤黃酸可通過降低蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)信號(hào)通路所介導(dǎo)的基質(zhì)金 屬蛋白酶2/9(matrixmetalloproteinase2/9,MMP2/9)的表達(dá)，產(chǎn)生對(duì)人乳腺癌細(xì) 胞（MDA-MB-231，MDA-MB-435)侵染的具有濃度依賴性的抑制作用，具體表現(xiàn)為抑制細(xì) 胞黏附、轉(zhuǎn)移和侵襲（J.Mol.Med. ,2008, 86, 1367-1377.)。藤黃酸還可通過抑制整合 素PiantegrinPl)聚集和細(xì)胞膜脂相關(guān)的整合素信號(hào)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的粘附 (Biochem.Pharmacol.，2011，82, 1873-1883.)。藤黃酸及類天然藤黃屬橋環(huán)咕噸酮可通過 抑制IKK0的催化活性來抑制IkB的磷酸化過程，進(jìn)而阻滯NF-kB核轉(zhuǎn)位，從而抑制相關(guān) 抗凋亡蛋白的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡（Eur.J.Med.Chem.，2012, 51，110-123.)。同時(shí)藤黃 酸具有抗腫瘤血管生成活性，能夠降低腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的生成，從而 在體外抑制由VEGF引起的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs)的增值、轉(zhuǎn)移及微血管的形成[Cancer Lett.，258(2007)，80-89.]。藤黃酸可以作為一種有效的多種腫瘤細(xì)胞凋亡抑制劑及腫瘤 新生血管抑制劑。
[0003] 藤黃酸分子量大，呈剛性結(jié)構(gòu)，缺乏水溶性基團(tuán)，理化性質(zhì)及藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不 佳。這些缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了藤黃酸作為新藥的開發(fā)研究。藤黃酸的構(gòu)效關(guān)系研究表明，藤黃 酸中D環(huán)橋環(huán)區(qū)域和B，C環(huán)為其抗腫瘤活性的必須骨架。本課題組基于對(duì)藤黃酸骨架的 研究得到了具有抗腫瘤活性的藤黃酸簡化物1，其具有一定的抗腫瘤活性，但其成藥性仍 然較差。主要表現(xiàn)在化合物1缺乏成藥性必須的水溶性，一方面其結(jié)構(gòu)中親水性的酚羥基 形成了分子內(nèi)氫鍵，降低了水溶性，另一方面，化合物1的結(jié)構(gòu)中缺乏親水性的氮原子。 水溶性不佳嚴(yán)重影響了化合物1的體內(nèi)抗腫瘤活性（JournalofMedicinalChemistry 56(2013)276-292)。
[0004] 藤黃酸及其結(jié)構(gòu)簡化物1的結(jié)構(gòu)如下：
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明對(duì)先導(dǎo)化合物1進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，通過一步酰化反應(yīng)或加成反應(yīng)得到一系 列具有氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)的化合物（I)，其具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長抑 制活性均在微摩爾及亞微摩爾水平。此外，化合物（I)的水溶性及細(xì)胞膜透過性均得到了 提高，明顯優(yōu)于先導(dǎo)化合物1及天然產(chǎn)物藤黃酸。化合物要轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?，生物活性及成藥?兩者缺一不可，因此本發(fā)明化合物（I)綜合抗腫瘤活性及成藥性，明顯優(yōu)于先導(dǎo)化合物1， 有望開發(fā)成抗腫瘤藥物。
[0007] 本發(fā)明的化合物的結(jié)構(gòu)通式如下：
[0008]
[0009] 其中R1、R2各自獨(dú)立代表氫、c烷基、C「(^羥烷基、C「CJ安烷基、5~7員含氮 雜環(huán)取代的烷基或5~7員含氮雜環(huán)取代C^(^烷?；?；或者R\R2連接形成5-7員 含氮雜環(huán)；
[0010] R3代表氫或甲基；
[0011] 且Ri、R2、R3不同時(shí)代表氫。
[0012] R1、R2優(yōu)選各自獨(dú)立代表氫、甲基、乙基或丙基。
[0013] R\R2優(yōu)選連接形成四氫吡咯基、咪唑基、哌啶基、4-哌啶基哌啶基、4-甲基哌嗪基 哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、嗎啡啉基或N-甲基哌嗪基。
[0014] 本發(fā)明還公開了通式I化合物的制備方法，包括以下步驟：
[0015]
[0016] 其中Ri、R2、R3定義同權(quán)利要求1。
[0017] 化合物la、lb與不同的氨基甲酰氯反應(yīng)得通式I化合物，反應(yīng)溶劑可選甲醇、 乙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃、異丙醇、正丁醇、乙醚、異丙醚、正丁醚、四氫呋喃、二氯甲烷、 N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)中的一種或任意組合。反應(yīng)中還應(yīng)加入催化劑DMAP、無 機(jī)堿或有機(jī)堿如碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銫、三乙胺、吡啶、DBU、DIPEA等。
[0018] 本發(fā)明所述的化合物可以添加藥學(xué)上可接受的載體制成常見藥用制劑，如片劑、 膠囊、粉劑、糖衆(zhòng)、液劑、懸浮劑、針劑，可加入香料、甜味劑、液體或固體填料、或稀釋劑等常 用藥物輔料。
[0019] 通式I化合物可以采用常見的分離方法進(jìn)行純化，如重結(jié)晶、柱層析等。
[0020] 本發(fā)明也包括通式I化合物的水合物、立體異構(gòu)體、溶劑化物和藥學(xué)上可接受的 鹽等。通式I化合物藥學(xué)上可接受的鹽可以通過將化合物I溶于一定溶劑如乙醇、乙酸乙 酯、甲醇、叔丁醇、四氫呋喃、二氯甲烷等，加入相應(yīng)的有機(jī)酸如鹽酸、馬來酸、酒石酸、枸櫞 酸等制備得到。
[0021] 本發(fā)明所述的化合物在臨床上的給藥方式可以采用口服、注射等方式。
[0022] 本發(fā)明所述化合物臨床所用劑量為0.Olmg-lOOOmg/天，也可根據(jù)病情輕重及劑 型不同而偏離此范圍。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于無需使用天然產(chǎn)物藤黃酸作為原料進(jìn)行修飾，可以通過合成得 至IJ;同時(shí)所得結(jié)構(gòu)新穎并較藤黃酸簡單，同時(shí)其抗腫瘤活性同藤黃酸相當(dāng)，在1位C或8-位 雙鍵上引入含氮、氧雜原子取代側(cè)鏈，具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制 活性均在微摩爾及亞微摩爾水平，同時(shí)本發(fā)明化合物的成藥性如水溶性、透膜性等，明顯優(yōu) 于先導(dǎo)化合物1及天然產(chǎn)物藤黃酸?；衔镆D(zhuǎn)變?yōu)樗幬铮锘钚约俺伤幮詢烧呷币徊?可，因此本發(fā)明化合物（I)綜合抗腫瘤活性及成藥性，明顯優(yōu)于先導(dǎo)化合物1，有望開發(fā)成 抗腫瘤藥物。
[0024]以下是本發(fā)明部分化合物的活性測(cè)試結(jié)果：
[0025] 試驗(yàn)方法：采用經(jīng)典的MTT染色法（CancerResearch47 (1987) 936-942)，培養(yǎng)時(shí) 間為48小時(shí)。用酶標(biāo)儀，在波長570nm條件下檢測(cè)光密度值（0D)。以溶劑對(duì)照處理的腫瘤 細(xì)胞為對(duì)照組，用下面公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，用SigmaPlot軟件計(jì)算IC5。值， 見表2。抑制率=[(對(duì)照組平均0D值-給藥組平均0D值）/對(duì)照組平均0D值]*100%
[0026] 表1本發(fā)明部分化合物抑制腫瘤細(xì)胞增值活性IC5。
[0027]
[0028] 注：IfepG2:人肝癌細(xì)胞HCT116:人結(jié)腸癌細(xì)胞A549:人肺癌細(xì)胞
[0029]由表1可見，本發(fā)明的化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，其活性與天然產(chǎn) 物藤黃酸和先導(dǎo)物1相當(dāng)。
[0030] 以下是本發(fā)明部分化合物的膜透過率實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0031] 實(shí)驗(yàn)方法：（一）藥物配制：精密的稱取待測(cè)化合物，加入適量的輔料無水乙醇 溶液，配制成10mm〇l/L濃度，超聲至完全溶解，并渦旋lmin使其分布均勻，置于4°C保存； (二）系統(tǒng)溶液配制二）系統(tǒng)溶液配制：將50mL系統(tǒng)溶液儲(chǔ)備液用超純水稀釋至2L，混 勻后用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4,并通過0. 22yM濾膜過濾，置于4°C保存。（三）測(cè)定方法：嚴(yán) 格按照PI0N提供的PAMPAExplorerTM說明書執(zhí)行。①建立Excel表格：建立化合物信息 表格，并導(dǎo)入PAMPAExplorerTM軟件，設(shè)置pH和3份平行樣品數(shù)；②制備空白板和參比板： 空白板，移液槍移取150yL系統(tǒng)溶液至UVPlate各孔，蓋上板蓋待測(cè)；參比板：取系統(tǒng)溶 液至De印WellPlate孔，每孔2mL，分別加入各試藥溶液4yL，混勻后各移取150yL至 UVPlate孔，蓋上板蓋待測(cè)；③建立轉(zhuǎn)運(yùn)模型：去除STIRWELLTMPAMPAsandwith，從De印 WellPlate中移取200yL含藥系統(tǒng)溶液于DonorPlate中，加蓋。向AcceptorPlate各 孔的膜上依次加入5yLABS緩沖液（Acc印torSinkBuffer)及200yLGIT脂溶液（GIT lipidsolution)。將Donor和Acceptor組裝好后，置于37°C50rpm振蕩器中，半小時(shí)后 取出，每板各孔取150yL至UVPlate待測(cè)；④測(cè)定：分別將空白板、參比板，以及Donor和 Acceptor的UVPlate，放入酶標(biāo)儀中按照軟件提示進(jìn)行掃描測(cè)定，波長范圍200~500nm; (四）數(shù)據(jù)處理：按照PAMPAExplorerTM自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)生成得到Pe值，去除 異常值后，具體透過率見表3。
[0032] 表2本發(fā)明部分化合物的在生理pH條件下的膜透過率
[0033]
[0034] 注：酮洛芬（Ketoprofen)及普萘洛爾（Propranolol)分別是膜透過率測(cè)定中的陰 性對(duì)照及陽性對(duì)照
[0035] 由表2可見，本發(fā)明的化合物具有良好的透膜性，提示其具有良好的胃腸道吸收， 且明顯優(yōu)于天然產(chǎn)物藤黃酸及先導(dǎo)化合物1。
[0036] 以下是本發(fā)明部分化合物的水溶性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0037] 實(shí)驗(yàn)方法：采用pION公司基于經(jīng)典的Avdeef-Bucher電位滴定法的Gemini測(cè)定 儀測(cè)得，具體操作嚴(yán)格按照Gemini測(cè)定儀的說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GeminipD軟件采集， 結(jié)果采用GeminipS軟件進(jìn)行擬合優(yōu)化。結(jié)果見表3。
[0038] 表3本發(fā)明部分化合物的水溶性
[0039]
[0040] 由表3可知，本發(fā)明的化合物的水溶性好于先導(dǎo)物1，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于藤黃酸，此外，本 發(fā)明化合物以鹽酸鹽形式存在時(shí)，水溶性大幅度提升。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 8-N，N-二甲氨基甲酰氧基-3, 3-二甲基-1- (3-甲基丁 -2-烯-1-基）-3, 3a，4, 5 -四氫-1，5-甲基橋-1H，7H-呋喃[3, 4-d]并咕噸-7, 13-二酮（1-1)的合成
[0043]
[0044] 將化合物la(80mg，0.2mmol)溶于丙酮中，依次加入N，N_二甲氨基甲酰氯 (34. 24mg, 0? 32mmol)、碳酸鉀（43mg，0. 32mmol)、DMAP(28mg，0. 24mmol)，N2保護(hù)，室溫反應(yīng) 過夜。
[0045] 將反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑，向殘留物中CH2C12溶解，飽和氯化銨水溶液洗 滌（20ml) 1次，水洗（20ml)，飽和食鹽水洗滌（20mL)，無水NaS04干燥，抽濾，濾液濃縮 得固體粗品，用硅膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯體系洗脫）分離純化，即得淺黃色目 標(biāo)產(chǎn)物I_175mg，產(chǎn)率 76. 53 %。m.p. 133. 2-135. 7。(：NMR(300MHz，CDC13) :S1. 05 (s，3H，C14-H)，1. 27-1. 34 (m，4H，C15-H，C16-Ha)，1. 48 (s，3H，C19-H)，1. 72 (s，3H，C2〇-H)，2. 29(dd,Ji= 13. 5Hz,J2= 4. 5Hz, 1H,C16-Hb), 2. 34 (d,J= 9. 6, 1H,C17-H), 2. 52 (d,J= 4. 6Hz, 2H,Cn-H), 3. 05(s，3H，N-CH3), 3. 18(s，3H，N-CH3), 3. 45(dd,Ji=4. 3Hz,J2=4. 5Hz, 1 H，C7-H)，4. 42-4. 47 (m, 1H,C12-H)，6. 77 (dd, 1= 8. 1Hz,J2 = 0? 9Hz, 1H,C2-H)，6. 96 (dd, 1 = 8. 1Hz,J2= 0. 9Hz, 1H,C4-H), 7. 28 (t,J= 10. 88Hz, 1H,C3-H), 7. 41 (d,J= 9. 6Hz, 1H,C8-H) EI-MSm/z:451[M]+. ；HRMS(ESI) ：calcd.forC26H29N06[M+Na+]474. 1887,found494.1892.
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 8-N，N-二乙氨基甲酰氧基-3, 3-二甲基-1-(3-甲基丁 -2-烯-1-基）-3, 3a，4, 5 -四氫-1，5-甲基橋-1H，7H-呋喃[3, 4-d]并咕噸-7, 13-二酮（1-2)的合成
[0048]
[0049] 將化合物la(80mg，0.2mmol)溶于丙酮中，依次加入N，N_二乙氨基甲酰氯 (43. 24mg, 0? 32mmol)、三乙胺（0? 044mL，0. 32mmol)、DMAP(28mg，0. 24mmol)，隊(duì)保護(hù)，室溫 反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液減壓蒸餾除去溶劑，向殘留物中CH2C12溶解，飽和氯化銨水溶液洗 滌（20ml) 1次，水洗（20ml)，飽和食鹽水洗滌（20mL)，無水NaS04干燥，抽濾，濾液濃縮得 固體粗品，用硅膠柱層析（石油醚/乙酸乙酯體系洗脫）分離純化，即得淺黃色目標(biāo)產(chǎn)物 I-279mg，產(chǎn)率 75. 89%。111.p. 144. 6-146.fCVHNMR(300MHz,CDC13) :S〇? 95(s, 3H,C14-H)，1 .18-1. 25 (m, 4H,C15-H,C16-Ha), 1. 30 (s, 3H,C19-H), 1. 32-1. 56 (m, 6H,N(CH,CH〇 2) 1. 61 (s, 3H, C20-H), 2. 26 (dd,Ji= 13. 5Hz,J2= 4. 5Hz, 1H,C16-Hb), 2. 37 (d,J= 9. 6, 1H,C17-H), 2. 54 (d,J =7. 8Hz, 2H,Cn-H), 3. 44 (dd,Ji= 6