含有嗎啉-2，5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物及制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因載體材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到含有嗎啉-2, 5-二酮衍生物共聚 物的靶向性三嵌段共聚物及制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工血管一般是由高分子聚合物制備而成，與天然血管相比，人工血管最大的區(qū) 別在于其內(nèi)表面缺乏功能化的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs)層。同時(shí)，由高分子聚合物形成的人工血管 內(nèi)表面還存在親水性差或無(wú)細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，這些差異往往導(dǎo)致人工血管術(shù)后再狹窄，這是 臨床上導(dǎo)致患者死亡的主要原因。
[0003] 內(nèi)皮細(xì)胞層位于天然血管的最內(nèi)層，它提供了一個(gè)無(wú)血栓形成內(nèi)表面，同時(shí)還在 防止血栓形成和血管堵塞發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用。在人工血管表面實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化，從 而形成內(nèi)皮層，這是提高人工血管長(zhǎng)期通暢率，防止血栓形成的重要方法之一。迄今為止， 科研工作者們開(kāi)發(fā)了很多具有應(yīng)用前景的方法，來(lái)實(shí)現(xiàn)人工血管植入物原位內(nèi)皮化。為了 制備具有ECs捕獲和（或）ECs綁定能力的生物活性表面，人們通常利用Arg-Gly-Asp (R⑶） 和Arg-Glu-Asp-Val (REDV)多肽作為配體，將這些多肽連接到人工血管表面，從而實(shí)現(xiàn)人 工血管內(nèi)表面對(duì)ECs的粘附，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化。然而，研究發(fā)現(xiàn)，在眾多的細(xì)胞識(shí)別配 體中，只有REDV多肽序列能夠特異性地被ECs表面的（14^整合素受體識(shí)別。因此，連接 有REDV多肽的人工血管表面，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)ECs的特異性識(shí)別和吸附。將REDV多肽固定在 人工血管的表面，可以促進(jìn)人工血管特異性地選擇吸附內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其內(nèi)皮化。
[0004] 雖然，利用REDV多肽修飾人工血管已經(jīng)取得了一些成果。但是，目前利用REDV多 肽制備ECs-靶向基因載體，攜帶目的基因（ZNF580基因）進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì) 胞快速增殖，抑制平滑肌增殖，最終實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化，這樣的研究至今還未見(jiàn)報(bào)道。
[0005] 聚嗎啉_2, 5-二酮衍生物是α -氨基酸和α -羥基酸交替共聚物，是一種無(wú)毒并 且在體內(nèi)外均可生物降解的聚合物。嗎啉-2, 5-二酮衍生物的均聚物是一類(lèi)有價(jià)值的生物 可降解醫(yī)用材料。聚嗎啉-2, 5-二酮衍生物，例如聚3 (S)-甲基-嗎啉-2, 5-二酮，降解產(chǎn) 物L(fēng)-丙氨酸能夠通過(guò)生物代謝途徑而被人體利用。丙交酯和乙交酯共聚物是經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的可用于人體醫(yī)學(xué)替代品的高分子聚合物，它具有良好的生物相容性和可降解性。嗎 啉-2, 5-二酮衍生物可以和其他共聚單體聚合生成共聚物，例如和L-丙交酯、D-丙交酯、 D，L-丙交酯、乙交酯、ε-己內(nèi)酯、對(duì)二氧環(huán)己酮、三亞甲基環(huán)碳酸酯共聚得到優(yōu)良性能的 嗎啉-2,5-二酮衍生物的共聚物。通過(guò)控制共聚單體化學(xué)結(jié)構(gòu)和它們的比例，可以很好地 控制共聚物的物理化學(xué)性能，尤其是親水性能、生物降解性能等。
[0006] 目前，亟需一種細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高且具有內(nèi)皮細(xì)胞靶向性功能的含有嗎啉-2， 5_二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高且具有內(nèi) 皮細(xì)胞靶向性功能的含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三 嵌段共聚物的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目提提供一種含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌 段共聚物的用途。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0011] -種含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物，是由嗎啉-2， 5_二酮衍生物的共聚物、聚乙烯亞胺和CREDVW構(gòu)成的分子量為3600-98000的共聚物；
[0012] 所述嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物為嗎啉-2, 5-二酮衍生物單體和環(huán)狀單體的共 聚物，所述環(huán)狀單體為L(zhǎng)-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε -己內(nèi)酯、對(duì)二氧環(huán)己 酮或三亞甲基環(huán)碳酸酯；
[0013] 所述嗎啉-2, 5-二酮衍生物單體的結(jié)構(gòu)為式⑴所示：
[0015] 其中 R! :-Η 或 _CH3 ;
[0016] R2 :-H，-CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH (CH3) 2, -CH2C (CH3) 2 或-CH (CH3) -CH2-CH3 ;
[0017] 所述嗎啉-2, 5-二酮衍生物的共聚物的分子量為1600-80000 ;
[0018] 所述聚乙烯亞胺分子量為200-5000。
[0019] 上述一種含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物的制備方法， 包括如下步驟：
[0020] (1)按摩爾比為（10-25) :(90-75)的比例稱(chēng)取嗎啉-2,5-二酮衍生物單體和 環(huán)狀單體，加入引發(fā)劑和含錫催化劑，在隔離空氣的條件下，140-155°C反應(yīng)0. 5-2h，再在 100-130°C反應(yīng)12-72h，得到混合物；所述含錫催化劑的加入量為嗎啉-2, 5-二酮衍生物單 體和環(huán)狀單體質(zhì)量之和的〇. 001% -5 % ;所述引發(fā)劑的加入量為嗎啉-2, 5-二酮衍生物單 體和環(huán)狀單體質(zhì)量之和的0. 16% -8%，所述引發(fā)劑為CnH⑶+2)02，其中10彡η彡8 ;所述嗎 啉-2, 5-二酮衍生物單體的結(jié)構(gòu)為式（I):
[0022]其中 & :-Η 或-CH3 ;
[0023] R2 :-H，-CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, -CH (CH3) 2, -CH2C (CH3) 2 或-CH (CH3) -CH2-CH3 ;
[0024] 所述環(huán)狀單體為L(zhǎng)-丙交酯、D-丙交酯、D，L-丙交酯、乙交酯、ε -己內(nèi)酯、對(duì)二氧 環(huán)己酮和三亞甲基環(huán)碳酸酯；
[0025] (2)將步驟（1)獲得的混合物分離，提純得到分子量為1600-80000的嗎啉-2， 5_二酮衍生物共聚物；
[0026] (3)按比例將0. 125mmo 1所述嗎啉-2，5-二酮衍生物共聚物溶于3-8mL極性 有機(jī)溶劑中得到溶液；滴加到5-10mL的濃度為0. 25mM異佛爾酮二異氰酸酯的甲苯溶液 中，加入含錫催化劑，所述含錫催化劑的加入量為嗎啉-2,5-二酮衍生物共聚物質(zhì)量的 0· 001% -5%，25°C反應(yīng) 12-48h ;
[0027] (4)在隔離空氣的條件下，將步驟（3)獲得的溶液滴加到8_18mL的濃度為0. 25mM 聚乙烯亞胺的甲苯溶液中，50-60°C反應(yīng)12-72h ;降至室溫后，加入10-100mL正己烷進(jìn)行沉 淀，過(guò)濾，得到白色含有嗎啉-2, 5-二酮衍生物共聚物的兩親性三嵌段共聚物；所述聚乙烯 亞胺分子量為200-5000 ;
[0028] (5)取含有嗎啉-2, 5-二酮衍生物共聚物的兩親性三嵌段共聚物0. 5_2g，溶于 5-10mL N，N-二甲基甲酰胺，加入39-390 μ L三乙胺，在-5~0°C條件下，滴入5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為1. 0%-10%的二烯丙基氨基甲酰氯的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，1-2h滴加完畢，室溫下 反應(yīng)12-24小時(shí)，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入5-10mg2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和2-5mL濃度為 0. 15M CREDVW的N，N-二甲基甲酰胺溶液；在紫外燈的波長(zhǎng)為365nm條件下照射10-20min ; 加入正己烷進(jìn)行沉淀，得到含有嗎啉-2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物。
[0029] 含錫催化劑優(yōu)選為辛酸亞錫、辛酸錫、二丁基氧化錫或二月桂酸二丁基錫。
[0030] 極性有機(jī)溶劑優(yōu)選為三氯甲烷，二氯甲烷，二甲基亞砜或N，N_二甲基甲酰胺。
[0031] 含有嗎啉-2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制備納米粒的用途，包 括如下步驟：按比例將l〇-l〇〇mg含有嗎啉-2,5-二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物 溶于Ι-lOmL第二種極性有機(jī)溶劑中制成聚合物溶液，在滴速為0. 01-0. 10mL/min滴入攪拌 速率為400-2000rpm的10-100mL超純水中，再在400-2000rpm攪拌24-48h，蒸發(fā)第二種極 性有機(jī)溶劑，得到含有粒徑為55-81nm的納米粒的液體；
[0032] 第二種極性有機(jī)溶劑優(yōu)選為四氫呋喃或體積比是（1-3) : 1的四氫呋喃與N，N-二 甲基甲酰胺的混合液。
[0033] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的含有嗎啉_2, 5-二酮衍生物共聚物的靶向性三 嵌段共聚物細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染率高且具有內(nèi)皮細(xì)胞靶向性功能。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，無(wú)污染， 用本發(fā)明的含有嗎啉-2,5_二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物制備的納米粒具有 良好的生物相容性，能有效攜載基因進(jìn)入細(xì)胞且具有血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性。含有嗎啉-2， 5_二酮衍生物共聚物的靶向性三嵌段共聚物以嗎啉_2, 5-二酮衍生物的共聚物作為疏水 性納米粒的核心，疏水鏈段之間的氫鍵作用提高了疏水核心的穩(wěn)定性。納米粒表面鏈接大 量的低分子量的PEI和適量的CREDVW多肽，提高了納米粒的轉(zhuǎn)染效率，降低了其細(xì)胞毒性， 同時(shí)還賦予了納米粒血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向選擇功能。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為一種含有嗎啉_2, 5-二酮