靶向修飾藻基因組的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于修飾藻細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的方法，其包括使用稀切核酸內(nèi)切酶 (rare-cutting endonuclease)來革巴向特定序列。具體而言，本發(fā)明涉及用于修飾藻細(xì)胞中 遺傳物質(zhì)的方法，其中稀切核酸內(nèi)切酶（尤其是歸巢核酸內(nèi)切酶或TALE-核酸酶）表達(dá)超 過數(shù)代從而高效地修飾所述靶標(biāo)序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 盡管藻作為人類食物來源已經(jīng)使用了幾個(gè)世紀(jì)，藻特別是微藻的生物技術(shù)利益重 要性只在最近幾十年里顯現(xiàn)。藻產(chǎn)品的應(yīng)用范圍從用于食品、飼料和燃料的簡(jiǎn)單生物質(zhì)生 產(chǎn)到有價(jià)值的產(chǎn)品，如化妝品、藥品、染料、糖聚合物和食品補(bǔ)充劑。
[0003] 幾種藻的物種如拜爾代維勒杜氏藻（Dunaliella bardawi 1)、雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis)和小球藻（Chlorella vulgaris)在以往已經(jīng)被廣泛探索用于 生物技術(shù)目的，特別是作為飼料、作為染料來源如(6-胡蘿卜素或蝦青素、或者作為食品補(bǔ) 充劑（Steinbrenner 和 Sandmann 2006 ;Mogedas, Casal 等人 2009)。大多數(shù)這些生物體是 綠色的藻，與其它藻組相比其屬于與陸生植物更像的組（Palmer, Soltis等人，2004)。另一 方面，有色（Chromophytic)藻最近才進(jìn)入前沿行列，并且只是在近年才已經(jīng)研究了它們的 生物化學(xué)和遺傳學(xué)。它們包括像棕色藻、矽藻、黃藻、黃綠藻等重要的組，但也有無色的卵菌 類（oomycetes) (Tyler, Tripathy等人2006)。在若干基因組被公布之后，所述基因組包括 石夕藻偽矮海鏈藻（Thalassiosira pseudonana)(Armbrust, Berges 等人 2004)以及三角褐 指藻（Phaeodactylum tricornutum) (Bowler, Alien等人2008)的基因組，有色藻的研究得 到了強(qiáng)大的推動(dòng)。
[0004] 矽藻是這個(gè)星球上生態(tài)學(xué)上最成功的單細(xì)胞浮游植物之一，負(fù)責(zé)全球約20%的碳 固定，代表了海洋食物網(wǎng)的主要參與者。矽藻有兩個(gè)主要的潛在商業(yè)或技術(shù)應(yīng)用。首先，矽 藻能夠積聚大量的脂質(zhì)，這適用于轉(zhuǎn)化為液體燃料，以及由于它們產(chǎn)生大量脂質(zhì)的高度潛 力和良好的生長(zhǎng)效率，它們被認(rèn)為是用于生產(chǎn)可再生生物燃料的最佳藻種類之一。第二，矽 藻具有二氧化硅組成的細(xì)胞壁（二氧化硅外骨骼稱為硅藻細(xì)胞殼（frustules))，有著納米 至微米規(guī)模復(fù)雜且紋飾（ornate)的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)超出了能夠通過人造合成方法所實(shí)現(xiàn) 的多樣性和復(fù)雜性，正在開發(fā)砂藻作為主要用于納米技術(shù)應(yīng)用的材料來源（Lusic，Radonic 等人2006)。
[0005] 盡管現(xiàn)已對(duì)一些藻物種的基因組進(jìn)行了測(cè)序，目前可以獲得的探索微藻遺傳學(xué)的 遺傳工具仍然很少，這大大限制了這些生物體在各種生物技術(shù)應(yīng)用中的利用。最近歸巢核 酸內(nèi)切酶的利用促進(jìn)了在藻基因組中進(jìn)行靶向基因組操作的能力（W0 2012/017329)。然 而，由于轉(zhuǎn)化率低且轉(zhuǎn)基因的表達(dá)弱，這種方法仍難以進(jìn)行，特別是在矽藻中，因?yàn)樗鼈兲?定的二氧化硅細(xì)胞壁包含兩個(gè)獨(dú)立的瓣（valve)(或殼）。在藻中已經(jīng)報(bào)道了穩(wěn)定和瞬時(shí)的 轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，參見綜述（Hallmann 2007)，正如在大多數(shù)生物體中一樣，但在大多數(shù)情 況下，由于瞬時(shí)表達(dá)潛在的遺傳毒性而被用于表達(dá)DNA修飾酶。
[0006] 作為一組特別的微藻，矽藻是唯--組具有二倍體生活史的主要真核浮游植物， 其中所有的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞都是二倍體，并且減數(shù)分裂產(chǎn)生壽命短暫的單倍體配子，這意味著通 過復(fù)制（二倍體）的基因組所主導(dǎo)的對(duì)于生活史的祖先選擇。因此，為了產(chǎn)生具有新性能 的藻如矽藻，認(rèn)為有必要同時(shí)靶向幾個(gè)等位基因或同源基因以引起對(duì)表型的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服上述限制，本發(fā)明通過轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因和表達(dá)超過數(shù)代的轉(zhuǎn)基因，在矽藻中 人誘導(dǎo)雙等位基因或多拷貝敲除，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼稀切核酸內(nèi)切酶，特別是經(jīng)工程改 造的核酸內(nèi)切酶和TALE-核酸酶。這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的藻細(xì)胞的嵌合（mosaic)克隆允許分離許 多后代細(xì)胞，其中觀察到多拷貝基因或多等位基因中的靶向修飾。這種新方法及其成果，為 藻細(xì)胞中復(fù)雜基因組的遺傳工程開辟了道路。
[0008] 因此，本發(fā)明涉及一種用于靶向修飾藻細(xì)胞遺傳物質(zhì)的方法，其使用稀切核酸內(nèi) 切酶，尤其是通過表達(dá)超過數(shù)代的歸巢核酸內(nèi)切酶和TALE-核酸酶，尤其通過編碼它們的 轉(zhuǎn)基因在染色體上的穩(wěn)定整合。這種方法允許在一次實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中誘導(dǎo)幾個(gè)等位基因或同源 基因中的靶向插入（敲入）或敲除，因此促進(jìn)了基因疊加（stacking)。本發(fā)明還包括通過 本方法獲得的遺傳修飾的藻。
【附圖說明】
[0009] 除了前述特征，本發(fā)明還包括其它特征，這將在隨后的描述以及附圖中呈現(xiàn)。通過 參考下列附圖連同如下的詳細(xì)描述，將容易地獲得并且隨之更好地理解本發(fā)明更完整的理 解及其許多附帶的優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 圖1 :通過PTRI20大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0011] 圖2 :在單鏈TREX2(SCTREX2)的存在下PTRI20大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變。對(duì)來自 野生型三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)株（條件4)、以及用空載體轉(zhuǎn)化所得的 克隆（條件3)、僅PTRI20大范圍核酸酶（條件2)和PTRI20大范圍核酸酶加SCTREX2 (條 件1克隆A)的PCR產(chǎn)物的A-T7核酸內(nèi)切酶分析。
[0012] 圖3 :在SCTREX2的存在下通過PTRI20大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0013] 圖4 :在單鏈TREX2(SCTREX2)的存在下PTRI20大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變。通過 深度測(cè)序表征誘變事件的特征。源自用PTRI02大范圍核酸酶和SCTREX2轉(zhuǎn)化所得的克隆 (1-5)、獲自僅用空載體轉(zhuǎn)化所得的克隆(6-8)的集落裂解物的基因組DNA進(jìn)行了分析。圍 繞PTRI02特定靶標(biāo)進(jìn)行了 PCR，通過擴(kuò)增子的深度測(cè)序分析確定在SCTREX2存在時(shí)大范圍 核酸酶誘導(dǎo)的誘變頻率百分比。
[0014] 圖5 :在SCTREX2的存在下通過PTRI02大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0015] 圖6 :YFP_TALE-核酸酶誘導(dǎo)的誘變頻率。提取源自用TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化所得的克 隆、或者來自用空載體轉(zhuǎn)化所得的克隆的基因組DNA。圍繞YFP靶標(biāo)進(jìn)行了 PCR，通過對(duì)以 特定靶標(biāo)為中心的擴(kuò)增子進(jìn)行深度測(cè)序分析確定誘變百分比。還分析了獲自克隆n° 2的 亞克隆。
[0016] 圖7 :YFP_TALE-核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0017] 圖8 :TP07_TALE-核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0018] 圖9 :TP15_TALE-核酸酶誘導(dǎo)的誘變事件的實(shí)施例。
[0019] 圖10 :通過深度測(cè)序表征PTRI02誘導(dǎo)的同源基因靶向（HGT)事件。對(duì)轉(zhuǎn)化有 PTRI02大范圍核酸酶和DNA基質(zhì)的8個(gè)克?。?-8)、以及轉(zhuǎn)化有DNA基質(zhì)和空載體的克隆 (9-10)的基因組DNA進(jìn)行了分析。通過擴(kuò)增子的深度測(cè)序分析確定在DNA基質(zhì)的存在下大 范圍核酸酶誘導(dǎo)的HGT頻率百分比。
[0020] 圖11 :通過深度測(cè)序表征PTRI20誘導(dǎo)的同源基因靶向（HGT)事件。對(duì)轉(zhuǎn)化有 PTRI20大范圍核酸酶和DNA基質(zhì)的克?。?-3)、以及轉(zhuǎn)化有DNA基質(zhì)和空載體的克?。?-5) 的基因組DNA進(jìn)行了分析。通過擴(kuò)增子的深度測(cè)序分析確定在DNA基質(zhì)的存在下大范圍核 酸酶誘導(dǎo)的HGT頻率百分比。
[0021] 圖12 :用靶向UGP酶基因的TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化三角褐指藻（Pt)株所得到的克隆 的分子表征。
[0022] 圖13 :用靶向UGP酶基因的TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化三角褐指藻（Pt)株所得到的克隆 的分子表征（實(shí)驗(yàn)1)。
[0023] 圖14 :用靶向UGP酶基因的TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化三角褐指藻（Pt)株所得到的克隆 的分子表征（實(shí)驗(yàn)2)。
[0024] 圖15 :靶向UDP葡萄糖焦磷酸化酶基因的TALE-核酸酶所誘導(dǎo)的誘變事件實(shí)施 例。
[0025] 圖16 :轉(zhuǎn)化有靶向UGP酶基因的TALE-核酸酶的三角褐指藻（Pt)株的表型表征。 克隆37-7A1 :UGP酶基因100%突變，用脂質(zhì)探針（Bodipy，Molecular Probe)標(biāo)記來自用 空載體轉(zhuǎn)化所得的克隆37-3B1以及Pt野生型株。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量熒光強(qiáng)度。圖表示 3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度相對(duì)于細(xì)胞數(shù)目的函數(shù)。
[0026] 圖17 :祀向推定的延長(zhǎng)酶基因的TALE-核酸酶誘導(dǎo)的誘變。左圖：來自用空載體 和推定的延長(zhǎng)酶TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化所得的克隆裂解物上所實(shí)施的PCR得以進(jìn)行。右圖：在 用推定的延長(zhǎng)酶TALE-核酸酶轉(zhuǎn)化所得的4個(gè)克隆上、以及用空載體轉(zhuǎn)化所得的3個(gè)克隆 上進(jìn)行T7分析評(píng)價(jià)。克隆2是T7分析陽性。
[0027] 圖18 :祀向推定的延長(zhǎng)酶基因的TALE-核酸酶所誘導(dǎo)的誘變事件實(shí)施例。
[0028] 表1 :PTRI20大范圍核酸酶誘導(dǎo)的誘變。
[0029] 表2 :轉(zhuǎn)化后獲得的克隆數(shù)目，已整合PTRI020大范圍核酸酶和SCTREX2DNA序列 的克隆數(shù)目，以及T7分析和深度測(cè)序分析中測(cè)試的克隆數(shù)目。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 除非此處另有指明，否則所有所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語和基因療法、生物化學(xué)、遺傳 學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的具有相同的含義。
[0031] 采用此處所述合適的方法和材料，與此處所描述的那些相似或等價(jià)的所有方法和 材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和此處提及的其它參考文獻(xiàn)都 通過參考整體并入此處。在沖突的情況下，以本說明書（包括定義）為準(zhǔn)。此外，除非另有 指明，材料、方法和實(shí)施例僅是說明性的，并不意圖進(jìn)行限制。
[0032] 除非另有指明，本發(fā)明的實(shí)施將采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因 生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù) 在文獻(xiàn)中有充分的解釋。參見，例如 Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) !Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第三版（Sambrook 等人 2001, Cold Spring Harbor, New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press) !Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. , 1984)； Mullis 等人 U.S. Pat. No. 4, 683, 195 ;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S. J. Higgins 編 1984) !Transcription And Translation(B. D. Hames&S. J.Higgins 編 1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. , 1987) !Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);系列叢書 Methods In ENZYM0L0GY(J. Abelson 和 M. Simon 主編，Academic Press, Inc.，New York)，尤其是 Vols. 154和 155 (Wu等人編）和 Vol. 185, 〃Gene Expression Technology"（D. Goeddel 編）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller 和 M. P. Calos 編,1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer 和 Walker 編 Academic Press, London, 1987)； Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir 和 C. C. Blackwell 編，1986)；以及 Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1986)。
[0033] 本發(fā)明涉及使用稀切核酸內(nèi)切酶以允許對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行高效的靶向基因組工程改 造。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于靶向修飾藻細(xì)胞遺傳物質(zhì)的方法，其包括下 列步驟中的一個(gè)或更多：
[0034] a)在藻細(xì)胞的基因組中選擇核酸靶標(biāo)序列；
[0035] b)設(shè)計(jì)編碼稀切核酸內(nèi)切酶的基因來靶向該序列；
[0036] c)用載體轉(zhuǎn)染所述藻細(xì)胞，其中所述載體包含編碼所述稀切核酸內(nèi)切酶的所述基 因，從而獲得所述稀切核酸內(nèi)切酶在所述細(xì)胞中超過數(shù)代的表達(dá)；
[0037] d)選擇具有修飾的靶標(biāo)序列的所述藻細(xì)胞的細(xì)胞后代。
[0038] NHEJ事件或同源重組可以產(chǎn)生所述修飾的靶標(biāo)序列。所述稀切核酸內(nèi)切酶造成的 雙鏈斷裂通常通過同源重組或非同源末端連接（NHEJ)的不同機(jī)制進(jìn)行修復(fù)。盡管同源重 組通常使用受損DNA的姐妹染色單體作為供體基質(zhì)，從而進(jìn)行遺傳損傷的完美修復(fù)，NHEJ 是一個(gè)有缺陷的修復(fù)過程，往往在雙鏈斷裂的位點(diǎn)導(dǎo)致DNA序列的變化。通過直接的重新 連接（Critchlow和Jackson 1998)或通過所謂的微同源（microhomology)介導(dǎo)的末端連 接（Ma，Kim等人2003)，多種機(jī)制參與兩個(gè)DNA末端剩下部分的重新連接。通過非同源末端 連接（NHEJ)進(jìn)行的修復(fù)經(jīng)常導(dǎo)致小的插入或缺失，并且可以用于產(chǎn)生特定的基因敲除。本 實(shí)施方式的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于靶向修飾藻細(xì)胞遺傳物質(zhì)的方法，所述方法通過在 藻細(xì)胞中表達(dá)稀切核酸內(nèi)切酶來誘導(dǎo)同源重組或NHEJ事件。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明所述稀切核酸內(nèi)切酶是指，能夠催化DNA或RNA分子優(yōu)選DNA分 子內(nèi)核酸之間鍵的水解（切割）的任何野生型或變體酶。在過去的15年間，已經(jīng)有明 確的記載利用歸巢核酸內(nèi)切酶成功地誘導(dǎo)基因靶向，從涉及野生型I-SceI的簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn) 開始，直到涉及完全重新工程改造的酶更加細(xì)致的工作（Stoddard, Monnat等人2007 ; Marcaida, Prieto 等人 2008 ;Galetto, Duchateau 等人 2009 ;Arnould, Delenda 等人 2011 以及W02011/064736)。根據(jù)本發(fā)明的核酸內(nèi)切酶在特定的多核苷酸序列位置識(shí)別并切割核 酸，還稱為"核酸靶標(biāo)序列"。
[0040] 例如，根據(jù)本發(fā)明的稀切核酸內(nèi)切酶可以是歸巢核酸內(nèi)切酶，也被稱為大范圍 核酸酶（Paques和Duchateau 2007)。這種歸巢核酸內(nèi)切酶是本領(lǐng)域公知的（參見例如 (Stoddard, Monnat等人2007))。歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別核酸革巴標(biāo)序列并產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷 裂。
[0041] 歸巢核酸內(nèi)切酶是高度特異性的，其識(shí)別長(zhǎng)度范圍從12至45個(gè)堿基對(duì)（bp)，通 常長(zhǎng)度范圍從14至40bp的DNA靶標(biāo)位點(diǎn)。例如，根據(jù)本發(fā)明的歸巢核酸內(nèi)切酶可以對(duì)應(yīng) 著LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶、HNH核酸內(nèi)切酶、或者GH-YIG核酸內(nèi)切酶。這種核酸內(nèi)切酶的 實(shí)例包括 I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、 I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、 PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、 PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I 或 I-MsoI0
[0042] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的歸巢核酸內(nèi)切酶是LAGLIDADG核酸內(nèi) 切酶，如I-Sce I、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI和I-DmoI。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述 LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶是I-CreK野生型I-CreI是同二聚體歸巢核酸內(nèi)切酶，其能夠切割 22至24bp的雙鏈靶標(biāo)序列。
[0043] 在本申請(qǐng)中，I-CreI變體可以是同二聚體（包含兩個(gè)相同單體的大范圍核酸酶） 或異二聚體（包含兩個(gè)不同單體的大范圍核酸酶）。可以理解本發(fā)明的范圍也包括I-CreI 變體本身，其包括作為非限制性實(shí)例的異二聚體（W02006097854)、專性（obligate)異二聚 體（W02008093249)和單鏈大范圍核酸酶（W003078619和W02009095793)，其能夠切割藻 基因組中的序列靶標(biāo)之一。本發(fā)明還包括來自不同來源的兩個(gè)單體組成的雜交變體本身 (W003078619) 〇
[0044] 本發(fā)明既包括野生型也包括變體核酸內(nèi)切酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本 發(fā)明的核酸內(nèi)切酶是一種"變體"核酸內(nèi)切酶，即并非天然存在于自然中并且通過遺傳工程 改造或通過隨機(jī)誘變獲得的核酸內(nèi)切酶。例如，可以通過將野生型核酸內(nèi)切酶氨基酸序列 中的至少一個(gè)殘基取代為不同的氨基酸而獲得根據(jù)本發(fā)明的變體核酸內(nèi)切酶。例如可以通 過定點(diǎn)誘變和/或隨機(jī)誘變引入這種取代。在本發(fā)明的框架中，這樣的變體核酸內(nèi)切酶保 留其功能，也就是說它們保留識(shí)別和特異性切割靶標(biāo)序列的能力。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方 式中，本發(fā)明中所用的編碼歸巢核酸內(nèi)切酶的核酸包括選自SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :12 的核酸序列的部分。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的變體核酸內(nèi)切酶切割不同于對(duì)應(yīng)的野生型核酸內(nèi)切酶的靶標(biāo)序列 的靶標(biāo)序列。用于獲得這種具有新型特異性的變體核酸內(nèi)切酶的方法是本領(lǐng)域公知的。
[0046] 本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，這種具有新型特異性的變體核酸內(nèi)切酶可以用于允許 高效的靶向修飾藻細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，從而大大增加了這些生物體用于各種生物技術(shù)應(yīng)用的 可用性。
[0047] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述稀切核酸內(nèi)切酶可以是"TALE-核酸 酶"（TALE-Nuclease)，它是源自轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè) 能夠切割DNA靶標(biāo)序列的核酸酶結(jié)構(gòu)域融合所得。TALE-核酸酶S被用來刺激基因靶向和 基因修飾（Boch, Scholze 等人 2009 ;Moscou 和 Bogdanove 2009 !Christian, Cermak 等人 2010、W0 2011/146121)
[0048] 所述轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE)對(duì)應(yīng)于一種包含多個(gè)TALE重復(fù)序列的經(jīng)工程 改造的TALE，每個(gè)重復(fù)包含特異于TALE識(shí)別位點(diǎn)中每個(gè)核苷酸堿基的RVD。在本發(fā)明中， 所述TALE的每個(gè)TALE重復(fù)序列由30至42個(gè)，更優(yōu)選33或34個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中位于位 置12和13的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸（即所謂的重復(fù)可變二肽，RVD)介導(dǎo)所述TALE結(jié)合位點(diǎn)序 列中一個(gè)核苷酸的識(shí)別；等價(jià)的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸可位于12和13以外的位置，尤其是在超過 33或34個(gè)氨基酸長(zhǎng)的TALE重復(fù)序列中。優(yōu)選，和識(shí)別不同核苷酸相關(guān)的RVD是識(shí)別C的 HD，識(shí)別T的NG，識(shí)別A的NI，識(shí)別G或A的NN，識(shí)別A、C、G或T的NS，識(shí)別T的HG，識(shí)別 T的IG，識(shí)別G的NK，識(shí)別C的HA，識(shí)別C的ND，識(shí)別C的HI，識(shí)別G的HN，識(shí)別G的NA，識(shí) 別G或A的SN以及識(shí)別T的YG，識(shí)別A的TL，識(shí)別A或G的VT以及識(shí)別A的SW。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，關(guān)鍵的氨基酸12和13可以突變成其它氨基酸殘基以調(diào)節(jié)其對(duì)核苷酸A、T、 C和G的特異性，尤其是增強(qiáng)這種特異性。對(duì)于其它氨基酸殘基，意圖可以是任何20種天然 氨基酸殘基或非天然氨基酸衍生物。
[0049] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述TALE包含8至30個(gè)TALE重復(fù)序列。更優(yōu)選， 本發(fā)明的所述TALE包含8至20個(gè)TALE重復(fù)序列；再更優(yōu)選15個(gè)TALE重復(fù)序列。
[0050] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述TALE包含額外的單截尾（truncated)TALE重復(fù)序列， 其由位于所述一組TALE重復(fù)序列C端的20個(gè)氨基酸構(gòu)成，即額外的C端半個(gè)TALE重復(fù)序 列。在這種情況下，本發(fā)明的所述TALE包含8. 5至30. 5個(gè)TALE重復(fù)序列，".5"指的是前 面提到的半個(gè)TALE重復(fù)序列（或末端RVD，或半個(gè)重復(fù)）。更優(yōu)選，本發(fā)明的所述TALE包 含8. 5至20. 5個(gè)TALE重復(fù)序列，再更優(yōu)選，15. 5個(gè)TALE重復(fù)序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 所述半個(gè)TALE重復(fù)序列在TALE的背景（context)之內(nèi)，其允許缺失所述半個(gè)TALE重復(fù)序 列對(duì)核苷酸A、C、G、T的特異性。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，缺失所述半個(gè)TALE重復(fù)序 列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述TALE包含不同來源的TALE樣重復(fù)序列。在優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述TALE包含源自不同天然存在