專利名稱：一種藻類來源的植酸酶phyg及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種藻類來源的植酸酶PHYGP及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植酸酶是一類能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。單胃畜禽和淡水魚類飼料中都需要使用植酸酶，但它們對植酸酶的性質(zhì)有不同的要求。對單胃畜禽而言，植酸酶的主要作用場所是單胃動物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性條件下要有較高的酶活性，即酶反應(yīng)的最適PH值為酸性的植酸酶。對于淡水養(yǎng)殖的主要魚類一鯉科魚類，因?yàn)樗鼈儫o胃，只有PH值呈中性(pH6.5 8.0)的腸道，因而在魚類飼料中必需使用在中性PH值條件下有高活性的植酸酶。目前商品化生產(chǎn)的用于單胃畜禽的植酸酶在中性pH值環(huán)境下基本沒有酶活性，因而不能用于鯉科魚類飼料。植酸酶廣泛存在于微生物中，如枯草芽孢桿菌、假單孢桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、酵母及曲霉等。藻類生物數(shù)量龐大，且其生物特性呈現(xiàn)多樣化，利用藻類可以生產(chǎn)許多稀有的天然活性物質(zhì)，如色素、抗生素、抗病毒和真菌類藥物、抗癌藥物，以及微藻脂肪酸、多糖、維生素和留醇等，因此利用藻類獲得新型植酸酶也將是其開發(fā)應(yīng)用的重要領(lǐng)域之一。據(jù)了解，到目前為止，還沒有來源于藻類的植酸酶基因的表達(dá)及性質(zhì)研究的報(bào)道。從整個(gè)植酸磷的循環(huán)模式來看，植酸磷可從陸地環(huán)境轉(zhuǎn)移進(jìn)入水體環(huán)境中，特別是在養(yǎng)殖業(yè)密集的區(qū)域，由于大量植物性日糧中的植酸，在單胃動物消化道中沒有被水解，而隨著糞便被排泄到體外，這些高 植酸含量的糞便直接進(jìn)入農(nóng)田，但大部分植物并不能直接利用植酸，這些植酸會隨著雨水流入附近的水域，而水域中的藻類可以利用植酸磷作為磷源，迅速生長造成赤潮和水體富營養(yǎng)化。所以，我們推測養(yǎng)殖業(yè)密集的區(qū)域的水體環(huán)境發(fā)生赤潮和富營養(yǎng)化，與藻類能直接利用植酸有一定的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種藻類來源的植酸酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述藻類來源的植酸酶的基因。本發(fā)明的再一目的是提供包括上述植酸酶基因的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供上述植酸酶基因的重組菌株。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.1，其保藏編號為CGMCC N0.3496。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.2，其保藏編號為CGMCC N0.3494。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQIDN0.3，其保藏編號為CGMCC N0.3495。本發(fā)明的再一目的是提供制備上述植酸酶的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述植酸酶的用途。根據(jù)本發(fā)明的藻類來源的植酸酶，為中性、其結(jié)構(gòu)域?yàn)椤?折疊桶狀。根據(jù)本發(fā)明的藻類來源的植酸酶，其中，所述藻類藍(lán)藻，優(yōu)選所述藍(lán)藻為點(diǎn)狀念珠藻、無類囊體藍(lán)藻、或念珠藻。根據(jù)本發(fā)明的藻類來源的植酸酶，其中，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、或 SEQ ID N0.3 所示。本發(fā)明提供了編碼上述藻類來源的植酸酶的基因，其中，所述植酸酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、或 SEQ ID N0.6 所示。本發(fā)明還提供了包含上述植酸酶基因的重組載體。本發(fā)明還提供了包含上述植酸酶基因的重組菌株。
·
根據(jù)本發(fā)明的制備上述植酸酶的方法包括以下步驟:I)構(gòu)建上述包含植酸酶基因的重組載體；2)轉(zhuǎn)化宿主菌，并表達(dá)；3)分離純化得到所述植酸酶。根據(jù)本發(fā)明的藻類來源的植酸酶可以用于魚類飼料。本發(fā)明首次對藻類來源的植酸酶基因進(jìn)行了表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究，并證明了來源于藻類(如點(diǎn)狀念珠藻N.punctiforme和無類囊體藍(lán)藻G.violaceus)的植酸酶基因都能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。表達(dá)得到的重組蛋白都能對植酸具有較好的水解作用，說明本發(fā)明獲得的藻類來源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。酶學(xué)性質(zhì)的分析，表明該植酸酶結(jié)構(gòu)域具有典型的BPP (beta-折疊桶狀植酸酶)植酸酶的特性，在中性條件下具有較高的催化活性，Ca2+對其的活性和熱穩(wěn)定性都具有重要影響，最適反應(yīng)Ca2+濃度為1.5mM，最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為45° C。從以上結(jié)果，我們可以推測出藻類來源的植酸酶為中性植酸酶，可以用于水產(chǎn)動物的飼養(yǎng)。


圖1 植酸酶結(jié)構(gòu)域 PhyNl-pd(圖 l_a)、植酸酶 PhyNl(圖 l_b)、PhyG(圖 l_c)、PhyN2(圖1-d)在大腸桿菌中表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1:PhyNl-pd ；2:PhyNl ；2:PhyG ;3:PhyN2。圖2重組植酸酶的最適Ca2+濃度，圖2a:PhyNl-pd ；圖2b =PhyNl ；圖2c =PhyG ；圖2d:PhyN20圖3 重組植酸酶的最適 pH，圖 3a:PhyNl-pd ；圖 3b =PhyNl ；圖 3c =PhyG ;圖 3d:PhyN20圖4重組植酸酶的最適反應(yīng)溫度，圖4a:PhyNl-pd ；圖4b =PhyNl ；圖4c =PhyG ；圖4d:PhyN20圖5重組植酸酶的熱穩(wěn)定性，圖5a:PhyNl-pd ；圖5b =PhyNl ；圖5c =PhyG ;圖5d:PhyN2。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyNl(Escherichiacoli phyNl),所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1,其保藏編號為CGMCCN0.3496，保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏日期2009年12月3日。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyG(Escherichiacoli phyG)，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2，其保藏編號為CGMCCN0.3494。根據(jù)本發(fā)明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyN2(Escherichiacoli phyN2)，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3，其保藏編號為CGMCCN0.3495。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)條件:1、菌株及載體:點(diǎn)狀念珠藻Nostoc punctiforme美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所ATCC29133,無類囊體藍(lán)藻Gloeobacter violaceus美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所ATCC 29082,及念珠藻Nostoc sp.美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所ATCC 27893為公知菌株。大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)、表達(dá)載體pET-22b (+)(購自 Novagen 公司)。2、酶類及其他生化試劑:內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。PNPGal、植酸鈉等底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑。3.培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來進(jìn)行，包括:Sambrook等人，Molecul ar Cloning, A Laboratory Manual (第 3版 2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和 Current ProtocolsinMolecular Biology (Au sub el 等人編，1994)。實(shí)施例1點(diǎn)狀念珠藻Nostoc punctiiforme ATCC 29133的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取用250mL三角瓶裝IOOmL BGl I培養(yǎng)基(IOOmL中含有NaN03150mg, KH2P044mg, MgSO4 7H20 7.5mg, CaCl23.6mg,梓檬酸 0.6mg,梓檬酸鐵銨 0.6mg,EDTA0.lmg, Na2C032mg, H3B03286ng, MnCl2 4H20 181ng, ZnSO4 7H20 22.2ng, CuSO4 5H20
7.4ng, MoO3L 5ng),接種0.1g濕藻泥，40001ux連續(xù)光照，溫度為24°C，反復(fù)式搖床培養(yǎng)20天，紗布過濾，并用濾紙吸干多余水分用作DNA提取的材料。培養(yǎng)獲得藻泥重懸于Iml 0.25mol/l的EDTA緩沖液中(pH8.0)，37°C溫育30min，加入0.1ml 10%的N-十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)溶液，繼續(xù)溫育15min，離心收集細(xì)胞沉淀，重懸于0.4ml重蒸水中，加入0.1ml溶菌酶(10mg/ml)，37°C溫育2小時(shí)，再加入
0.lmllO%SDS溶液并輕輕晃動至樣品澄清，加入等體積的苯酚抽提，再用苯酚/氯仿混合液抽提，最后用氯仿抽提2次。加入2倍體積的預(yù)冷乙醇沉淀DNA，離心后溶于TE緩沖液，用于基因的克隆。實(shí)施例2點(diǎn)狀念珠藻Nostoc punctiiforme ATCC 29133植酸酶編碼基因的克隆使用Pfam 蛋白質(zhì)家族網(wǎng)站(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)的 折疊桶植酸酶家族的所有植酸酶序列進(jìn)行比對分析，可以發(fā)現(xiàn)在BPP植酸酶中存在兩個(gè)相對比較保守的區(qū)域:D-A-[A/T/E]-D-D-P-A-[I/L/V]-W 和 N_N-[V/I]-D_[I/L/V] -R- [Y/D/Q]。在BBP植酸酶中，前一個(gè)保守區(qū)域是鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)，后一個(gè)保守區(qū)域在BBP植酸酶序列是催化活性中心，這兩個(gè)區(qū)域在BPP植酸酶中非常保守。利用CODEHAPprimer設(shè)計(jì)的基本原理，根據(jù)這兩個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一組簡并引物。在保證特異性擴(kuò)增植酸酶基因的前提下，為了使引物能夠與潛在的更多植酸酶基因配對結(jié)合，將設(shè)計(jì)的簡并引物利用 Harvard Medica School 的 MS-BLAST(http://genetics, bwh.harvard, edu/msblast/)進(jìn)行BLAST比對分析，然后根據(jù)比對結(jié)果優(yōu)化引物序列使之能與更多的植酸酶基因配對結(jié)合。最終設(shè)計(jì)確定了 BPP植酸酶的簡并引物BPP-F，5’ -GACGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3’ 和 BPP-R, 5’-CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3'。(Y 代表 C 或 T ;R 代表 A 或 G ;S 代表C或G ;N代表A，C，G或T ; I代表A，C，G或T)。以念珠藻基因組DNA為模板，利用降落PCR的方法來擴(kuò)增目標(biāo)植酸酶基因片段對
引物的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)體系包括:
權(quán)利要求
1.一種藻類來源的植酸酶PHYG，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.2。
2.一種藻類來源的植酸酶基因phyG，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的植酸酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植酸酶基因phyG，其特征在于，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。
4.一種含藻類來源植酸酶的重組菌株，其特征在于，所述植酸酶的氨基酸序列如SEQID N0.2，其保藏編號為 CGMCC N0.3494。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述植酸酶PHYG用于水解植酸的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種藻類來源的植酸酶及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的藻類來源的植酸酶，其中，所述藻類藍(lán)藻，優(yōu)選所述藍(lán)藻為點(diǎn)狀念珠藻、無類囊體藍(lán)藻、或念珠藻。本發(fā)明首次對藻類來源的植酸酶基因進(jìn)行了表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究，并證明了來源于藻類的植酸酶基因都能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。表達(dá)得到的重組蛋白都能對植酸具有較好的水解作用，說明本發(fā)明獲得的藻類來源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。
文檔編號C12N15/55GK103114080SQ20121043834
公開日2013年5月22日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者姚斌, 黃火清, 楊培龍, 羅會穎, 石鵬君, 袁鐵錚, 王亞茹, 柏映國, 孟昆, 史秀云 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所