一種假絲酵母生產(r)-苯并呋喃醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到近平滑假絲酵母細胞生物催化制備手 性醫(yī)藥中間體（R)-3-苯并呋喃醇的技術。
【背景技術】
[0002] 手性（R)-3-苯并呋喃醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊材料的 重要中間體。生物催化不對稱反應具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點，作為綠色高 效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化合物。生 物催化制備手性（R)-3-苯并呋喃醇具有很好的應用前景。
[0003]生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004]生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%，原子 經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現(xiàn)體內輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (R)-3_苯并呋喃醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌塊，?，F(xiàn)有 的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷，難于進行 工業(yè)化生產。本發(fā)明將采用生物細胞催化制備（R)-3_苯并呋喃醇。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明采用近平滑假絲酵母細胞催化制備（R) -3-苯并呋喃醇，反應式如下：
底物3-苯并呋喃酮（1)經近平滑假絲酵母催化反應，得到產物（R)-3-苯并呋喃醇 (2)。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用近平滑假絲酵母作 為催化劑，因為其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007]許多近平滑假絲酵母都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大， 經實驗，本發(fā)明選用近平滑假絲酵母菌株為ATCC96041，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經過大量實驗確定的輔助底物為：葡萄糖20-23g/L、木糖10-14g/L、異 丙醇8-10%V/V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH為 7. 0;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：葡萄糖37-44g/L，木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12g/L，酵母提 取物 4-5g/L，（NH4)2HPO4 12-15g/L，KH2PO4 6. 5-7. 5g/L.MgSO4 ? 7H20 0? 7-0. 8 g/L,NaCl0.08-0.1g/L;pH為 7.0。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 1酵母細胞制備。近平滑假絲酵母經斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐 加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至29_31°C，將近平滑假絲酵母種子液接種至發(fā) 酵罐，接種比例為6-6. 5%，通氣比為0. 5-1VAV分鐘），29-31°C培養(yǎng)42-48小時，用過濾式 離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0014] 生物催化轉化 底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為7. 0,加入底物3-苯并呋喃酮，使底 物濃度為80-90g/L。其他成份：麥芽浸膏22-26g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為6-8g/L， 葡萄糖20-23g/L、木糖10-14g/L、異丙醇8-10%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘； 冷卻至29-31°C時，加入濕酵母細胞使?jié)舛葹?7-71g/L，通氣比為0. 15-0. 16V/ (V分鐘）， 即每分鐘通氣量為0. 15-0. 16倍反應液體積，進行生物催化反應，反應時間為59-64小時； 反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（R)-3-苯并呋喃 醇，反應轉化率98-99 %，產品收率96-97 %，對映體過量率98. 5-99 %。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優(yōu)化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
[0016] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH為7.0; 配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖37g/L，木糖78g/L，玉米胚芽粉10g/L，酵母提取物4 g/L, (NH4)2HPO4 12g/L,KH2PO4 6.5g/L.MgSO4 . 7H20 0.7g/L,NaCl0.08g/L; pH為 7. 0。
[0018] 濕酵母細胞制備過程如下：近平滑假絲酵母ATCC96041經斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到 種子液。IL發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至29°C，將近平滑假絲酵母 種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6 %，通氣比為0. 5VAV分鐘），29 °C培養(yǎng)48小時，用過濾 式離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0019] 生物催化轉化：0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為7. 0,加入 底物3-苯并呋喃酮，使?jié)舛葹?0g/L，麥芽浸膏22g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為6g/L， 葡萄糖23g/L、木糖10g/L、異丙醇10%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至30°C 時，加入濕酵母細胞使?jié)舛葹?7g/L，通氣比為0. 15V/ (V分鐘)，進行生物催化反應，反應 時間為59小時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物 (R) -3-苯并呋喃醇，反應轉化率99 %，產品收率97 %，對映體過量率98. 5 %。
[0020] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20