本發(fā)明涉及一株接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

二噁英是多氯二苯并二噁英和多氯代二苯并呋喃兩類物質(zhì)的合稱，包括75種多氯代二苯并二噁英和135種多氯代二苯并呋喃兩組化合物；二噁英為強(qiáng)致癌、致突變物質(zhì)，對(duì)人體及各類生物均會(huì)造成嚴(yán)重的健康威脅(蔣可，2005)。二苯并呋喃為多氯代二苯并呋喃在無(wú)氯取代情況下的母環(huán)結(jié)構(gòu)，通常作為研究二噁英類化合物生物降解時(shí)模式化合物。二噁英大部分通常以小顆粒的形式存在于大氣、土壤和水體之中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究表明，生物修復(fù)是治理二噁英污染的切實(shí)有效的方法，分離獲得高效降解菌是開展生物修復(fù)工作的核心。近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究人員報(bào)道了從污染環(huán)境中篩選分離了一些降解二噁英的微生物，包括鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)和地桿菌(Terrabacter)。其中假單胞菌及紅球菌在環(huán)境中分布較廣，假單胞菌為革蘭氏陰性菌，對(duì)各種污染環(huán)境的適應(yīng)力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，但二噁英降解能力相對(duì)較弱；而紅球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，二噁英降解能力較強(qiáng)，但生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。另一方面，也有研究表明與二噁英降解相關(guān)的代謝基因在革蘭氏陽(yáng)性菌(例如紅球菌，地桿菌)中呈現(xiàn)一定的保守性，揭示了自然界中這些微生物之間存在著代謝基因的交流(Aly et al.2008；Kasuga et al.2013；Peng et al.2013)，即通過代謝基因的水平轉(zhuǎn)移使得環(huán)境中某些細(xì)菌獲得了污染物降解能力(張瑞福，2005)。細(xì)菌間水平基因轉(zhuǎn)移主要是由可移動(dòng)基因元件引起的，其中質(zhì)粒DNA是一類重要的可移動(dòng)基因元件，既能介導(dǎo)基因水平轉(zhuǎn)移，又可在受體生物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且傳遞給子代，可以通過接合轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間交換遺傳物質(zhì)。研究表明降解二噁英的細(xì)菌含有可自主遷移的代謝質(zhì)粒，而跟二噁英降解途徑有關(guān)的降解基因位于質(zhì)粒上(Peng et al.2013)。降解質(zhì)粒在同屬或?qū)匍g的遷移及穩(wěn)定遺傳，以及功能基因的表達(dá)使得菌株能夠通過基因水平轉(zhuǎn)移使其降解性能在微生物之間得到傳播，有助于提高微生物清除污染物的效果和開發(fā)其在環(huán)境生物修復(fù)中的應(yīng)用潛力(柏耀輝，2007)。

然而，通過接合方法對(duì)已知菌株進(jìn)行改造，常常存在如下技術(shù)難點(diǎn)：

i、可自主遷移性的二噁英降解質(zhì)粒較罕見。質(zhì)粒接合遷移的發(fā)生首要條件是質(zhì)粒上存在遷移相關(guān)元件：遷移起點(diǎn)oriT、與DNA加工有關(guān)的蛋白編碼基因、與DNA運(yùn)輸有關(guān)的通道蛋白的編碼基因。目前國(guó)際上關(guān)于二噁英降解質(zhì)粒的報(bào)道較少，而可自主遷移性二噁英降解質(zhì)粒的報(bào)道則更少；

ii、革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌之間發(fā)生質(zhì)粒接合遷移有難度。國(guó)內(nèi)外的理論與實(shí)驗(yàn)研究表明，供體生物與受體菌之間系統(tǒng)發(fā)育距離越近，發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的可能性就越高。采用質(zhì)粒供體菌為革蘭氏陽(yáng)性菌—紅球菌屬(Rhodococcus)，受體菌為革蘭氏陰性菌—假單胞菌屬(Pseudomonas)，這兩個(gè)屬在系統(tǒng)發(fā)育中親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合遷移的成功率很低。至今國(guó)際上未有關(guān)于二噁英降解質(zhì)粒在革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌之間發(fā)生接合遷移的報(bào)道；

iii、篩選攜帶可穩(wěn)定遺傳的二噁英降解質(zhì)粒的受體菌有困難。質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳及降解基因的表達(dá)依賴于受體菌，即質(zhì)粒與宿主菌染色體之間存在協(xié)調(diào)性；另一方面，二噁英降解質(zhì)粒為100kb以上的大質(zhì)粒，在無(wú)選擇壓力時(shí)成為宿主菌的生長(zhǎng)“負(fù)擔(dān)”，極易丟失。因此即使接合遷移成功，也未必能獲得可穩(wěn)定遺傳的質(zhì)粒攜帶菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一株接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1，2016年8月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No.12828。

上述接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1，其菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)特征為：菌落扁平，圓形，邊緣整齊，直徑2-3mm，表面光滑，產(chǎn)黃色色素；細(xì)胞呈球桿狀，革蘭氏染色為陰性菌?？纱x葡萄糖、木糖，不能利用乳糖、蔗糖。過氧化氫酶陽(yáng)性，硝酸鹽還原酶陰性，脲酶陽(yáng)性。該菌株能以二苯并呋喃為唯一碳源及能源生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)溫度為25～42℃，適宜pH為6.0～8.0，可代謝500mg/L二苯并呋喃、100mg/L氯代二苯并呋喃，如圖3、圖4、圖5所示。

上述接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)將接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1接種于活化培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，制得活化菌株；

(2)將步驟(1)制得的活化菌株轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，制得液體種子；

(3)將步驟(2)制得的液體種子轉(zhuǎn)接至擴(kuò)大培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)固液分離，制得菌體。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的活化培養(yǎng)基為含有濃度為450～550mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基，所述無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基每升組分如下：

K₂HPO₄ 2.7～15g，KH₂PO₄ 0.8～14g，Na₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 3g，微量金屬鹽溶液0.1～1mL，蒸餾水1L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

所述微量金屬鹽溶液，每毫升組分如下：

FeCl₂·4H₂O 0.1～0.5g，CoCl₂·6H₂O 0.01～0.06g，MgCl₂·4H₂O 0.01～0.05g，ZnCl₂ 0.01～0.03g，H₃BO₃ 0.01～0.03g，Na₂MO₄·H₂O 0.01～0.08g，CaCl₂·2H₂O 0.001～0.01g。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的活化培養(yǎng)溫度為28～32℃，時(shí)間為45～52小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基與步驟(3)中的擴(kuò)大培養(yǎng)基均為含有濃度為450～550mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，所述無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基每升組分如下：

K₂HPO₄ 2.7～15g，KH₂PO₄ 0.8～14g，Na₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 3g，微量金屬鹽溶液0.1～1mL，蒸餾水1L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

所述微量金屬鹽溶液，每毫升組分如下：

FeCl₂·4H₂O 0.1～0.5g，CoCl₂·6H₂O 0.01～0.06g，MgCl₂·4H₂O 0.01～0.05g，ZnCl₂ 0.01～0.03g，H₃BO₃ 0.01～0.03g，Na₂MO₄·H₂O 0.01～0.08g，CaCl₂·2H₂O 0.001～0.01g。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)為在溫度為28～32℃的條件下，振蕩培養(yǎng)24～48小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中轉(zhuǎn)接的體積百分比為5～10％。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中擴(kuò)大培養(yǎng)為在溫度為28～32℃的條件下，振蕩培養(yǎng)24～48小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中固液分離為在4～10℃條件下，4000～6000rpm離心5～15分鐘。

上述接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1在降解水體或土壤中二苯并呋喃和/或氯代二苯并呋喃中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，步驟如下：

(i)用40mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌并重懸菌體，制得濃度為3.0～4.0×10⁹cfu/ml的菌液，調(diào)整菌液濃度至10⁸cfu/ml，制得菌體懸液；

(ii)將菌體懸液與馴化污泥混合后，以間接掛膜方式接種于生物膜反應(yīng)器中對(duì)水體進(jìn)行處理；

或者，將菌體懸液與土壤混合并攪拌均勻，使菌體濃度達(dá)到10⁶CFU/g濕土，含水量為12～18％，進(jìn)行處理。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(ii)中，馴化污泥為從城市污水處理廠的二沉池中取剩余污泥，加入含二苯并呋喃的廢水，連續(xù)曝氣，溫度設(shè)為15～35℃、DO控制在1～2mg/L、pH值設(shè)為6.5～7.5；7～10天后保留污泥，換廢水重新曝氣，重復(fù)操作；2～4周后得到馴化污泥。

本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)及優(yōu)良效果：

1、本發(fā)明首次將革蘭氏陽(yáng)性菌紅球菌p52與革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌結(jié)合，獲得了具有可降解二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃等化合物的銅綠假單胞菌菌株，可用于污水處理或土壤生物修復(fù)過程，生長(zhǎng)迅速，其中降解質(zhì)粒在無(wú)選擇壓力條件下連續(xù)傳代30代后仍有50％的細(xì)胞可保持，穩(wěn)定性強(qiáng)；

2、本發(fā)明所述接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1含有兩個(gè)參與氯代二苯并呋喃等化合物降解的質(zhì)粒pDF01及pDF02，這兩個(gè)質(zhì)粒來(lái)自一株可降解氯代二苯并呋喃的紅球菌p52(Rhodococcus sp.strain p52)，以該紅球菌作為供體菌，由不具備二噁英降解能力的銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa作為受體菌，通過接合遷移得到該質(zhì)粒。該銅綠假單胞菌接合菌Pseudomonas aeruginosa不但可降解二苯并呋喃，還可用于降解氯代二苯并呋喃，具有降解速率快，可代謝濃度高等優(yōu)點(diǎn)。用于生物膜反應(yīng)器、土壤生物修復(fù)處理二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃，與已有的降解技術(shù)相比，處理能力與適應(yīng)性更強(qiáng)，利于實(shí)際應(yīng)用；

3、本發(fā)明所述接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1的菌體細(xì)胞或細(xì)胞懸浮液可以方便地用于受氯代二苯并呋喃和/或二苯并呋喃污染的污水和土壤的生物修復(fù)。能夠達(dá)到使二苯并呋喃(500mg/L)完全被代謝降解，使氯代二苯并呋喃(100mg/L)的65％～90％被代謝降解。

附圖說(shuō)明

圖1為接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1與銅綠假單胞菌原受體菌在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線；

其中符號(hào)●表示接種原受體菌后的OD₆₀₀，符號(hào)■表示接種接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1后的OD₆₀₀；

圖2為接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1在LB培養(yǎng)基中的質(zhì)粒丟失狀況曲線；

圖3為接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1降解二苯并呋喃及利用其生長(zhǎng)情況曲線；

其中符號(hào)●表示不接菌空白二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)■表示接種接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1后二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)▲表示接種原受體菌CGMCC 1.1129后二苯并呋喃的濃度(mg/L)

圖4為接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1降解4-氯二苯并呋喃狀況曲線；

其中符號(hào)●表示不接菌空白4-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)■表示接種接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1后4-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)▲表示接種原受體菌后4-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)

圖5為接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1降解5-氯二苯并呋喃狀況曲線；

其中符號(hào)●表示不接菌空白5-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)■表示接種接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1后5-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)，符號(hào)▲表示接種原受體菌后5-氯二苯并呋喃的濃度(mg/L)

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1的獲得

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)：CGMCC 1.1129；

紅球菌p52購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種編號(hào)：CCTCC M2011181；

將購(gòu)買的菌種干粉在已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中活化后，接種至以二苯并呋喃(DF)為唯一碳源的無(wú)機(jī)體固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h左右，判斷其是否能利用DF進(jìn)行生長(zhǎng)。以紅球菌p52為供體菌，以不具備降解能力的銅綠假單胞菌CGMCC 1.1129為受體菌采用濾膜接合法進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，步驟如下：

(1)菌種選擇：選用紅球菌p52為質(zhì)粒供體菌，以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為受體菌；

(2)斜面培養(yǎng)：將紅球菌p52接種于含濃度為500mg/L的二苯并呋喃的固體無(wú)機(jī)鹽斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

將不具備降解能力的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)接種于LB固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)液體培養(yǎng)：將步驟(2)得到的紅球菌及銅綠假單胞菌的單菌落分別接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(其中銅綠假單胞菌培養(yǎng)基中加入20μg/mL紅霉素)，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)，使菌液濃度達(dá)到10⁸～10⁹cfu/ml；

(4)分別取1mL供體菌紅球菌p52與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)受體菌，以6000rpm轉(zhuǎn)速在4℃離心5min，棄上清，收集沉淀細(xì)胞，加入200μl LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，并將供體菌液與受體菌液混合，以移液器吹吸數(shù)次混勻；

(5)在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌鑷子將已滅菌的0.22μm濾膜置于LB平板中央(避免濾膜與培養(yǎng)基表面之間產(chǎn)生氣泡)；用移液器將(4)中所得到的400μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到0.22μm濾膜上，并用槍頭輕輕涂勻；

(6)在超凈工作臺(tái)內(nèi)靜置干燥至膜上菌液不流動(dòng)時(shí)為止，將平板倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h；

(7)從培養(yǎng)后的平板中取出濾膜置于50mL無(wú)菌離心管中，加入2mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，充分蝸旋震蕩，將濾膜上的菌體洗脫下來(lái)，將菌液轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，以10,000rpm轉(zhuǎn)速離心1min，棄上清；

(8)在收集的細(xì)胞中加入500μl無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，以移液器吹吸混勻，稀釋后取200μl菌液涂布于含有紅霉素(20μg/mL)且以二苯并呋喃(300mg/L)為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，在30℃恒溫倒置培養(yǎng)48h。挑取所得到的單菌落即為獲得遷移性降解質(zhì)粒的菌株，即接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1。

將步驟(2)培養(yǎng)的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)原受體菌(CGMCC 1.1129)直接涂布于含300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，不生長(zhǎng)。將紅球菌p52涂布于含300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，生長(zhǎng)；將紅球菌p52涂布于含紅霉素(20μg/mL)及300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，不生長(zhǎng)。

上述培養(yǎng)基的配方為：

LB固體培養(yǎng)基，每升組分如下：

胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂2g，蒸餾水定容至1L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，每升組分如下：

K₂HPO₄ 12g，KH₂PO₄ 11g，Na₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 3g，微量金屬鹽溶液1mL，蒸餾水定容至1L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

固體無(wú)機(jī)鹽斜面培養(yǎng)基，每升組分如下：

K₂HPO₄ 12g，KH₂PO₄ 11g，Na₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄NO₃ 3g，微量金屬鹽溶液1mL，瓊脂2g，蒸餾水定容至1L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

上述微量金屬鹽溶液，每毫升組分如下：

FeCl₂·4H₂O 0.3g，CoCl₂·6H₂O 0.038g，MgCl₂·4H₂O 0.02g，ZnCl₂ 0.014g，H₃BO₃0.0124g，Na₂MO₄·H₂O 0.04g，CaCl₂·2H₂O 0.0034g，溶于1L蒸餾水中。

對(duì)比例1

按照與實(shí)施例1相同的方法以紅球菌p52為供體菌，以與紅球菌親緣關(guān)系較近的同屬或不同屬微生物為受體菌，采用濾膜接合法進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，原受體菌直接涂布于含300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中作為對(duì)照，均不生長(zhǎng)。另外作為對(duì)照，將紅球菌p52涂布于含300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)；但涂布于上述抗生素(20～50μg/mL)及300mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，均不生長(zhǎng)。與實(shí)施例1不同之處在于，所使用的受體菌不同，結(jié)果如下表所示：

表1二噁英降解質(zhì)粒向不同受體菌接合遷移對(duì)比

^R為抗生素抗性。其中：Km—卡那霉素；Sm—鏈霉素；Gm—慶大霉素；EM—紅霉素；CL—氯霉素；SG—土霉素

根據(jù)上表，紅球菌p52中的質(zhì)粒pDF01和pDF01可以通過接合實(shí)驗(yàn)成功轉(zhuǎn)移到紫紅紅球菌、紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大地兩面神菌等五種受體菌中，質(zhì)粒pDF01、pDF01的接合轉(zhuǎn)移率在10^-4～10^-9。需要注意的是質(zhì)粒pDF01和pDF02從紅球菌p52向銅綠假單胞菌中接合遷移率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他四種受體菌。

實(shí)施例2降解質(zhì)粒在接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1中的穩(wěn)定性

(1)菌株選擇：接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；

(2)斜面培養(yǎng)：將接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌種接種于含濃度為500mg/L二苯并呋喃無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)得到的單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃條件下180rpm振蕩培養(yǎng)20h制得種子液；

(4)菌體培養(yǎng)：以體積百分比1％的接種量將種子液接入300mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃180rpm條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，菌體培養(yǎng)設(shè)置三組平行樣；

(5)生長(zhǎng)曲線繪制：以1h為間隔，從6個(gè)錐形瓶中定時(shí)取樣3mL，以LB培養(yǎng)基為空白參比，在波長(zhǎng)為600nm處，進(jìn)行吸光度測(cè)定；將OD₆₀₀＝0.01的時(shí)間點(diǎn)作為0時(shí)刻，以O(shè)D₆₀₀和時(shí)間t為坐標(biāo)軸，繪制菌體生長(zhǎng)曲線。

(6)代時(shí)計(jì)算：根據(jù)步驟(5)中所得菌體生長(zhǎng)曲線指數(shù)期計(jì)算銅綠假單胞菌接合菌的代時(shí)；

(7)利用(6)中計(jì)算所得的代時(shí)，將接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1在接種于新鮮LB培養(yǎng)基后基本處于指數(shù)生長(zhǎng)期的前8h作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，每次轉(zhuǎn)接傳代后培養(yǎng)期的考察處于指數(shù)生長(zhǎng)期的前8h，進(jìn)行質(zhì)粒丟失實(shí)驗(yàn)，具體操作如下：

(i)菌體培養(yǎng)：以體積百分比1％的接種量將步驟(3)制得的種子液接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，此時(shí)記為0時(shí)刻。此后每8h進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)：取體積百分比1～5％菌體接入50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)取該時(shí)刻的菌液在平板上進(jìn)行涂布；

(ii)平板涂布：將(i)中所得菌液離心收集菌體，并用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌菌體2次后重懸，稀釋一定濃度后，分別在LB固體培養(yǎng)基和二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布。以有選擇壓力的二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(DF平板)為實(shí)驗(yàn)組，以無(wú)選擇壓力的LB固體培養(yǎng)基(LB平板)為對(duì)照組，每組均設(shè)置三組平行。

(iii)將涂布所得平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將對(duì)照組(LB平板)培養(yǎng)24h后取出觀察計(jì)數(shù)，將實(shí)驗(yàn)組(DF平板)培養(yǎng)48h后取出觀察計(jì)數(shù)，根據(jù)以下公式計(jì)算質(zhì)粒丟失率。

上述培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，其配方及配制方法均與實(shí)施例1相同。

根據(jù)圖1可知，接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1與原受體菌生長(zhǎng)速度相當(dāng)，質(zhì)粒的存在并未影響銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)速度。其代時(shí)約為1h，生長(zhǎng)速度較快。

根據(jù)圖2可知，接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1在無(wú)選擇壓力的條件下連續(xù)傳代30代，質(zhì)粒丟失率約為50％，表明質(zhì)粒在接合菌株中可穩(wěn)定遺傳。

對(duì)比例2

按照實(shí)施例2所述的方法進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，不同之處在于，受試菌株采用對(duì)比例1中所述的結(jié)合成功的其他四株接合菌—紫紅紅球菌、紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和大地兩面神菌：

(1)菌株選擇：對(duì)比例1所得到的接合有二噁英降解質(zhì)粒的紫紅紅球菌、紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和大地兩面神菌；

(2)菌體培養(yǎng)：將對(duì)比例1中得到的有二噁英降解質(zhì)粒的紫紅紅球菌、紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和大地兩面神菌取單菌落在二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線；

(3)將涂布所得平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后取出觀察是否有菌落長(zhǎng)出；

(4)若有菌落長(zhǎng)出則重復(fù)(2)、(3)取單菌落進(jìn)行連續(xù)劃線傳代培養(yǎng)，直到在二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基無(wú)菌落長(zhǎng)出為止，計(jì)數(shù)所傳代數(shù)，考察兩個(gè)質(zhì)粒pDF01和pDF02在接合菌中的丟失率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：在二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，將紫紅紅球菌接合菌、紅串紅球菌接合菌、蠟樣芽孢桿菌接合菌和大地兩面神菌接合菌經(jīng)過1到2次傳代培養(yǎng)后均無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明降解質(zhì)粒均丟失。由此可知，對(duì)于紫紅紅球菌、紅串紅球菌、蠟樣芽孢桿菌和大地兩面神菌，二噁英降解質(zhì)粒即使在有環(huán)境選擇壓力(二苯并呋喃)的條件下，連續(xù)傳代2代后質(zhì)粒丟失率為100％，表明質(zhì)粒在這四種受體菌中不能穩(wěn)定遺傳。

通過接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌與其他接合有二噁英降解質(zhì)粒的接合菌的降解質(zhì)粒丟失率對(duì)比可知，二噁英降解質(zhì)粒的存在并未影響銅綠假單胞菌的正常生長(zhǎng)繁殖，且在無(wú)選擇壓力的條件下仍可在銅綠假單胞菌中穩(wěn)定遺傳，使得接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌更具有應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)施例3利用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1處理二苯并呋喃的方法，其中二苯并呋喃的濃度為500mg/L：

(1)菌株選擇：接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1；

(2)斜面培養(yǎng)：將菌種接種于含濃度為500mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無(wú)菌條件下接種2環(huán)至50mL二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)36小時(shí)制得種子液；

(4)擴(kuò)大培養(yǎng)：以體積百分比5％的接種量將種子液接入50mL含500mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；

(5)收集細(xì)胞：將步驟(4)的培養(yǎng)液在4～10℃以5000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集細(xì)胞；

(6)洗滌細(xì)胞：用40mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，重復(fù)2次，相同條件下離心，收集細(xì)胞，用40mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度使之達(dá)到10⁸cfu/ml；

(7)二苯并呋喃降解：步驟(6)所制得的細(xì)胞懸浮液中加入二苯并呋喃，終濃度達(dá)500mg/L，30℃條件以180rpm轉(zhuǎn)速恒溫振蕩培養(yǎng)，處理期間不同時(shí)間取樣，用氣相色譜法檢測(cè)二苯并呋喃的降解狀況，當(dāng)混合液中的二苯并呋喃完全檢測(cè)不到時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)后終止處理。

上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。

上述步驟(7)氣相色譜法采用Agilent 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)，氦氣作為載氣，F(xiàn)ID檢測(cè)器，儀器分析條件為：進(jìn)樣器、檢測(cè)器溫度為280℃，柱溫170℃。

上述步驟(7)所述處理期間所取樣品按以下方法處理后利用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定二苯并呋喃。將不同時(shí)間所取樣品(1ml)分別以8000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液加入1ml乙酸乙酯萃取，收集上層有機(jī)相，并以無(wú)水硫酸鈉干燥后裝入色譜分析瓶待測(cè)。

結(jié)果如圖3所示，經(jīng)過80h，銅綠假單胞菌接合菌株可將500mg/L的二苯并呋喃徹底降解。

實(shí)施例4利用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1處理4-氯二苯并呋喃、5-氯二苯并呋喃的方法，其中兩種物質(zhì)的濃度均為100mg/L：

(1)菌株選擇：選用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1；

(2)斜面培養(yǎng)：將菌株接種于含濃度為500mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無(wú)菌條件下接種2環(huán)至50mL含二苯并呋喃(500mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)36小時(shí)制得種子液；

(4)擴(kuò)大培養(yǎng)：以體積百分比5％的接種量將種子液接種于500mL含二苯并呋喃(500mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃條件下轉(zhuǎn)速為180rpm振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；

(5)收集細(xì)胞：將步驟(4)的培養(yǎng)液在4～10℃以5000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞；

(6)洗滌細(xì)胞：用40mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，重復(fù)2次，相同條件下離心，收集細(xì)胞，然后用40mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸浮液濃度使之達(dá)到10⁸cfu/ml；

(7)4-氯二苯并呋喃降解：在步驟(6)所制得的細(xì)胞懸浮液中加入4-氯二苯并呋喃，終濃度達(dá)100mg/L，30℃條件以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，處理期間不同時(shí)間取樣，用氣相色譜法檢測(cè)4-氯二苯并呋喃的降解情況，當(dāng)混合液中的4-氯二苯并呋喃濃度不發(fā)生變化，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)后終止處理；

(8)5-氯二苯并呋喃降解：在步驟(6)所制得的細(xì)胞懸浮液中加入5-氯二苯并呋喃，步驟同(7)。

上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。

上述步驟(7)、(8)氣相色譜法采用Agilent 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)，氦氣作為載氣，F(xiàn)ID檢測(cè)器，儀器分析條件為：進(jìn)樣器、檢測(cè)器溫度為280℃，柱溫為170℃。

上述步驟(7)、(8)所述處理期間所取樣品按以下方法處理后利用氣相色譜法測(cè)定氯代二苯并呋喃。將不同時(shí)間的所取樣品1ml以8000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液加入1ml乙酸乙酯萃取，收集上層有機(jī)相，并加入無(wú)水硫酸鈉干燥后裝入色譜分析瓶待測(cè)。

結(jié)果如圖4、圖5所示，銅綠假單胞菌接合菌株可在100h內(nèi)將初始濃度為100mg/L的4-氯二苯并呋喃、5-氯二苯并呋喃分別去除67％及92％。

實(shí)施例5接種接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1在生物膜反應(yīng)器中降解二苯并呋喃，其中二苯并呋喃的濃度為300mg/L：

(1)菌株選擇：選用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1；

(2)斜面培養(yǎng)：將菌株接種于含濃度為500mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無(wú)菌條件下接種2環(huán)至100mL二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)36小時(shí)后制得種子液；

(4)擴(kuò)大培養(yǎng)：將種子液以體積百分比5％的接種量接種于1000mL含二苯并呋喃(500mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；

(5)收集細(xì)胞：將步驟(4)的培養(yǎng)液在4～10℃以5000rpm離心10分鐘，收集擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞；

(6)取以200mg/L二苯并呋喃馴化后的活性污泥，與步驟(4)收集的銅綠假單胞菌接合菌細(xì)胞混合后放入循環(huán)池內(nèi)，泵入生物膜反應(yīng)器中，循環(huán)運(yùn)行直至形成生物膜后，通水運(yùn)行，廢水中含300mg/L二苯并呋喃，以氣相色譜檢測(cè)出水中二苯并呋喃的濃度。

上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。

上述步驟(6)氣相色譜法采用Agilent 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP—5毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)，氦氣作為載氣，F(xiàn)ID檢測(cè)器，儀器分析條件為：進(jìn)樣器、檢測(cè)器溫度為280℃，柱溫為170℃。

上述步驟(6)所述處理期間所取樣品按以下方法處理后利用氣相色譜法測(cè)定二苯并呋喃。將不同時(shí)間所取樣品1ml以8000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液加入1ml乙酸乙酯萃取，收集上層有機(jī)相，并加無(wú)水硫酸鈉干燥后裝入色譜分析瓶待測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果顯示，運(yùn)行7天后出水中二苯并呋喃下降到0.2mg/L，降解率達(dá)到99.9％。

實(shí)施例6利用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1降解土壤中的二苯并呋喃，其中二苯并呋喃的濃度為100mg/L：

(1)菌株選擇：選用接合有二噁英降解質(zhì)粒的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ-1；

(2)斜面培養(yǎng)：將菌株接種于含濃度為500mg/L二苯并呋喃的無(wú)機(jī)鹽固體斜面培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)；

(3)種子培養(yǎng)：將步驟(2)培養(yǎng)的菌株在無(wú)菌條件下接種2環(huán)至100mL二苯并呋喃(500mg/L)無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)36小時(shí)后制得種子液；

(4)擴(kuò)大培養(yǎng)：將種子液以體積百分比5％的接種量接種于1000mL含二苯并呋喃(500mg/L)的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30℃條件下以180rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；

(5)收集細(xì)胞：將步驟(4)的培養(yǎng)液在4～10℃以5000rpm離心10分鐘，收集擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞；

(6)將收集的細(xì)胞與含100mg/L二苯并呋喃的土壤樣品充分?jǐn)嚢杌旌?，使?xì)胞濃度約為10⁶CFU/g濕土，含水量為15％，在30℃靜置培養(yǎng)，每天翻攪土樣1次，適當(dāng)補(bǔ)水，持續(xù)處理2周，不同時(shí)間取樣萃取以氣相色譜檢測(cè)出樣品中二苯并呋喃的濃度。

上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例1。

上述步驟(6)氣相色譜法采用Agilent 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP—5毛細(xì)管柱(30m×250μm×0.25μm)，氦氣作為載氣，F(xiàn)ID檢測(cè)器，儀器分析條件為：進(jìn)樣器、檢測(cè)器溫度為280℃，柱溫為170℃。

上述步驟(6)所述處理期間所取樣品按以下方法處理后利用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定二苯并呋喃。將不同時(shí)間的土壤樣品0.5g加入1mL乙酸乙酯，密閉瓶口，置于超聲波浴槽中，500瓦、10s超聲處理，重復(fù)3次，以2000rpm轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集上清液，重復(fù)上述萃取步驟1次，合并萃取有機(jī)相，加無(wú)水硫酸鈉干燥后裝入色譜分析瓶待測(cè)。

檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)處理8天后土壤中100mg/L的二苯并呋喃減少了88％。