姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TY1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取自姚蛇唾液腺的天然抗炎癥多肽cecropin-??Ι及其在抗炎癥中的新應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著傳統(tǒng)抗生素的濫用，微生物對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來越強的耐受性，微生物感染已成為嚴重威脅人類健康的難題。這些微生物中特別是革蘭氏陰性細菌感染時能釋放脂多糖(LPS)，會引發(fā)膿毒血癥和內(nèi)毒素休克。一直以來對微生物感染引發(fā)的膿毒血癥的主要治療方法為輸液、改善機體供氧、抗感染治療和免疫治療等。同時這些治療方法又存在著諸多不足，比如抗感染治療會導(dǎo)致大量細菌被殺死而釋放出大量內(nèi)毒素，加劇膿毒血癥。因此，這就需要持續(xù)開發(fā)新的治療膿毒血癥的制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TYl 及其應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0005]Cecropin抗菌肽是一類具有抗菌功能的一種小分子多肽，其中一部分cecropin抗菌肽還具有抗炎的功能，而且能中和內(nèi)毒素，即在抗菌的同時能中和細菌感染是所釋放的內(nèi)毒素，并發(fā)揮抗炎功能。根據(jù)報道，有研究者基于宿主-體外寄生蟲相互作用的關(guān)系，對吸血昆蟲姚蛇(Tabanus yao)成功吸血機制進行研究，從姚蛇唾液腺中發(fā)現(xiàn)了 cecropin類多肽 cecropin-TYl。
[0006]本發(fā)明所述的姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TYl，提取自姚虻唾液腺，由39個氨基酸組成，碳末端酰胺化，分子量為3970.22道爾頓，等電點為11.17，其氨基酸序列為SEQID: 1，即 GlylTry2Leu3Lys4Lys5Ile6Gly7Lys8Lys9Ilei0GlullArgi2Vali3Glyi4Gln15Asn16Val17Arg18Asni9Ala2oAla2iIle22Ser23Thr24Ile25Pro26Ile27Ala28Gln29Gly3oAla3iAla32Gly33Val34Ala35Gly36Ala37Leu3SAsn39-NH2，且其中所有氨基酸均為L-型。
[0007]本發(fā)明所述的姚蛇天然抗炎癥多肽cecropin-??Ι在制備抗炎藥物、細菌感染引起的膿毒血癥和內(nèi)毒素休克藥物、獸藥、動物飼料及化妝品中的應(yīng)用。
[0008]其具體的為:
[0009]本發(fā)明所述的姚蛇天然抗炎癥多肽cecropin-TYl在抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨■細胞產(chǎn)生一氧化氮中應(yīng)用；在抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子中的應(yīng)用；在抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥信號通路中的應(yīng)用，包括在抑制脂多糖誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活中的應(yīng)用，和在抑制脂多糖誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ的激活中的應(yīng)用；在中和內(nèi)毒素功能中的應(yīng)用。
[0010]借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點:本發(fā)明中所述提取自姚虻唾液腺中的天然抗炎癥多肽cecropin-TYl具有分子量小、合成簡單、抗炎效果明顯、細胞毒性低的特點，在醫(yī)藥、化妝品和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0011]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明Cecropin-TYl抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的轉(zhuǎn)錄結(jié)果圖；
[0013]圖2是本發(fā)明Cecropin-TYl抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生的結(jié)果圖；
[0014]圖3是本發(fā)明Cecropin-TYl抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生的結(jié)果圖；
[0015]圖4是本發(fā)明Cecropin-TYl抑制MAPKs的激活的結(jié)果圖；
[0016]圖5是本發(fā)明cecropin-TYl抑制NF- κ B的激活的結(jié)果圖；
[0017]圖6是本發(fā)明cecropin-TYl對小鼠巨噬細胞的毒性；
[0018]圖7是本發(fā)明cecropin-TYl的內(nèi)毒素中和活性；
[0019]圖8是本發(fā)明cecropin-TYl在不同溶液中的圓二色譜圖；
[0020]圖9是本發(fā)明cecropin-??Ι的溶液結(jié)構(gòu)模擬示意圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述，以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022]—、姚虻唾液免抗炎癥多肽cecropin-TYl對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細胞一氧化氮(NO)產(chǎn)生的影響。
[0023](I)、抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的轉(zhuǎn)錄:
[0024]誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是一氧化氮(NO)產(chǎn)生所必須的合成酶，首先檢測cecropin-TYl對一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄水平的影響。C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中(2.5 X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養(yǎng)基(購買自美國Gbico公司)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，如圖1標(biāo)注所示，在細胞中加入100ng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia coli 0111:B4,購買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-??Ι，并分別設(shè)置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育6小時后，收集細胞，用Trizol (購買自Takara)裂解細胞，提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購買自Takara)合成cDNA，并用熒光定量PCR檢測不同處理的細胞中iNOS的轉(zhuǎn)錄水平。
[0025]由圖1可見，cecropin-TY以劑量依賴的方式抑制了 iNOS的轉(zhuǎn)錄。只加LPS處理的細胞的iNOS的轉(zhuǎn)錄水平設(shè)定為100%，而加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl處理后，iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平分別只有 41.2%、31.3%和 15.8%, cecropin-TYl 減少了 58.8%、68.7%和84.2%的iNOS的轉(zhuǎn)錄。
[0026](2)、抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生:
[0027]細胞培養(yǎng)基中亞硝酸鹽(nitrite)的累積水平可以間接反映NO的產(chǎn)生，接著檢測了 cecropin-TYl對亞硝酸鹽產(chǎn)生的影響。將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中(2.5 X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養(yǎng)基(購買自美國Gbico公司)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，如圖2標(biāo)注所示，在細胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia coli 0111:B4，貝勾買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分別設(shè)置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育24小時后，收集培養(yǎng)上清，用格里斯試劑(購買自碧云天)檢測不同處理的細胞后細胞培養(yǎng)上清亞硝酸鹽的累積水平。
[0028]由圖2可見，cecropin-TY以劑量依賴的方式抑制了亞硝酸鹽的產(chǎn)生。只加LPS處理組亞硝酸鹽的累積水平為20.4 μ M，加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl處理后，亞硝酸鹽的累積水平分別只有12.0,7.3和5.0 μ M，cecropin-TYl減少了 40.0,63.7和75.0%的亞硝酸鹽的產(chǎn)生。
[0029]二、姚虻唾液抗炎癥肽cecropin-TYl對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥細胞因子產(chǎn)生的影響。
[0030]將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中(2.5X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養(yǎng)基(購買自美國Gbico公司)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，如圖3標(biāo)注所示，在細胞中加入10ng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia col1lll:B4，購買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分別設(shè)置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育6小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，用酶聯(lián)免疫試劑盒(購買自達科為)檢測細胞因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1β (IL-Ιβ)和白介素-6(IL-6)的累積水平。同時收集細胞，用Trizol(購買自Takara)裂解細胞，提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購買自Takara)合成cDNA，并用熒光定量PCR檢測不同處理的細胞中炎癥細胞因子TNF-a、IL-1 β和IL_6的轉(zhuǎn)錄水平。
[0031]如圖3所示，cecropin-TYl以劑量依賴的方式抑制了 LPS誘導(dǎo)的炎癥細胞因子TNF-α ,IL-1 β和IL-6的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。在濃度為20mg/mL時，cecropin-TYl抑制了 60.3%的 TNF-a、67.5% 的 IL-1 β 和 94.1 % 的 IL-6 的轉(zhuǎn)錄，同時，20mg/mL 的 cecropin-TYl 減少了 72.1%的 TNF-a、63.4%的 IL-1 β 和 76.2%的 IL-6 的產(chǎn)生。
[0032]三、Cecropin-TYl對炎癥信號通路的影響。
[0033]將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中(I X 16細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養(yǎng)基(購買自美國Gbico公司)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，如圖4和圖5標(biāo)注所示，在細胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia c