專利名稱：抗炎癥化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗炎癥效果的化合物，特別涉及從沙棘分離得到的抗炎癥化合物。
背景技術(shù)：
沙棘(Hippophae rhamnoides L.)，胡頹子科落葉灌木，主要生長(zhǎng)在中國(guó)黃河流域，此外，還廣泛分布于歐洲、前蘇聯(lián)、西亞、中東等地。在中國(guó)，自古以來，沙棘的果實(shí)就被用于哮喘、消化不良、炎癥等的治療中。
此外，近年來，沙棘還被應(yīng)用于動(dòng)脈硬化、心絞痛、潰瘍、放射線傷害等的治療中。作為該植物的化學(xué)成分，已報(bào)道了包含于其果實(shí)、種子、莖和葉中的類黃酮糖苷、甾醇、精油、三萜衍生物。關(guān)于藥理作用，已知有降低血壓、抗動(dòng)脈硬化、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌作用。
例如，在日本專利特開2004-217545號(hào)公報(bào)中，公開了來源于沙棘的顯示出蛋白質(zhì)非酶性糖化抑制活性、醛糖還原酶抑制活性和自由基清除活性的新的類黃酮糖苷，并且可被有效用于糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防·治療、衰老或癌癥、動(dòng)脈硬化、腦栓塞等疾病的預(yù)防·治療中。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開2004-217545號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題迄今為止，盡管已知沙棘具有抗炎癥效果，但是關(guān)于其有效成分，一直都是未知的。本發(fā)明的目的在于探明來源于沙棘的具有抗炎癥效果的化合物，并開發(fā)該化合物的新用途。
解決本發(fā)明的問題的方法本發(fā)明人們針對(duì)來源于沙棘的有效成分進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果探明了具有抗炎癥效果的化合物。本發(fā)明是基于該發(fā)現(xiàn)完成的，并提供下述通式(1)所示的三萜衍生物。該三萜衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽具有抗炎癥作用(抑制一氧化氮的產(chǎn)生的作用)、自由基清除作用。
上式中，R1、R2和R3同時(shí)或者各自獨(dú)立地表示羥基、氫原子、C1-6烷基或烷基醚基。
另外，本發(fā)明還提供以下述通式(2)所示的苯并吡喃衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的一氧化氮抑制劑。該苯并吡喃衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽具有自由基清除作用。
上式中，R4表示氫原子、烷基、?；⑻穷?。
具體實(shí)施例方式
該三萜衍生物和苯并吡喃衍生物以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽，具有抗炎癥作用(抑制一氧化氮的產(chǎn)生的作用)、自由基清除作用。因此，可以認(rèn)為它們能夠有效用于各種炎癥性疾病、各種變態(tài)反應(yīng)性疾病、糖尿病等的治療中。
為了基于治療目的而使用新的三萜衍生物和苯并吡喃衍生物以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽，可以將各個(gè)化合物及其無毒性鹽作為有效成分，通過口服或非口服方式給藥。給藥量根據(jù)癥狀、年齡、性別、體重、給藥方式等而異，例如，對(duì)成人口服給藥時(shí)，每日劑量通常為0.1～1000mg。
用于將新的三萜衍生物和苯并吡喃衍生物以及它們的藥學(xué)上可接受的鹽制劑化的劑型并沒有限制，可以以口服方式使用錠利、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑等固體制劑，溶液、懸浮液、乳劑等液態(tài)制劑。另外，也可以以非口服方式使用靜脈內(nèi)、肌肉、皮下等的注射劑，栓劑、貼付劑等。
在制成固體制劑時(shí)，可以使用淀粉、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素等賦形劑。另外，如果需要，還可以使用潤(rùn)滑劑、崩解劑、包覆劑、著色劑等。當(dāng)以注射利及液態(tài)制劑形式使用時(shí)，可以包含穩(wěn)定化劑、溶液助劑、懸浮化劑、乳化利、緩沖劑、保存劑等。
下面，對(duì)上述通式(1)所示的三萜衍生物和通式(2)所示的苯并吡喃衍生物的制造實(shí)例進(jìn)行說明。
將沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的樹枝皮(3kg)浸漬在80％的丙酮(10L)中48小時(shí)，得到提取物。重復(fù)進(jìn)行3次，濃縮、干燥所得到的提取物，得到929.84g的浸膏。
將該929.84g的浸膏溶于水中，依次使用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行分配萃取，接著在減壓條件下進(jìn)行濃縮。其結(jié)果分別得到正己烷餾分(21.14g)、氯仿餾分(29.34g)、乙酸乙酯餾分(37.12g)、正丁醇餾分(180.23g)、水餾分(631.73g)。
針對(duì)各個(gè)餾分，將樣品濃度調(diào)整至100μg/mL，并用它們進(jìn)行后述的一氧化氮(NO)產(chǎn)生抑制試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們各自的NO產(chǎn)生抑制活性分別為正己烷餾分(89.5％)、氯仿餾分(90.3％)、乙酸乙酯餾分(67.2％)、正丁醇餾分(24.6％)、水餾分(0.8％)。
接著，對(duì)各個(gè)餾分進(jìn)行MTT分析，然后使用硅膠柱(wako gelC-300，6.5×18cm)對(duì)活性最強(qiáng)的28.1g氯仿餾分進(jìn)行處理，依次使用正己烷、乙酸乙酯∶正己烷(2∶98、4∶96、8∶92、15∶85、20∶80、40∶60、80∶20)、乙酸乙酯、以及甲醇進(jìn)行洗脫。結(jié)果得到6個(gè)餾分fr.1(1.3g)、fr.2(1.0g)、fr.3(2.0g)、fr.4(1.5g)、fr.5(2.8g)、fr.6(12.2g)。
然后，針對(duì)fr.3餾分，使用正相HPLC(色譜柱Shiseido SilicaSG 80A 10×250mm；流動(dòng)相為己烷∶乙酸乙酯＝70∶30；流速為4.0mL/min(室溫))進(jìn)行洗脫，利用Shodex RI-72(差示折光計(jì))接收保留時(shí)間為8分20秒時(shí)洗脫出來的峰。使用反相HPLC(色譜柱Capcell PAK C18 10×250mm；流動(dòng)相為甲醇∶水＝95∶5，流速為4.0mL/min(室溫))洗脫該餾分(230mg)。利用UV(210nm)檢測(cè)器接收保留時(shí)間為10分40秒時(shí)洗脫出來的峰，得到化合物1(24.9mg)。下面顯示了化合物1的結(jié)構(gòu)式(3) 接著，以水∶甲醇(50∶50→0∶100)為流動(dòng)相的ODS柱(Chromatorex ODS 100-200目，5.5×15cm)洗脫fr.4餾留分，得到9個(gè)餾分(fr.4-1至fr.4-9)。其中，使用反相HPLC(色譜柱Capcell PAK C18 10×250mm；流動(dòng)相為甲醇∶水＝35∶65；流速為4.0mL/min(室溫))洗脫fr.4-1(0.12g)，利用UV(254nm)檢測(cè)器接收保留時(shí)間為13分40秒時(shí)洗脫出來的峰，得到化合物3(12.8mg)。下面顯示了化合物2的結(jié)構(gòu)式(4)。

下面給出了所得的化合物的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)、MS、IR、UV數(shù)據(jù)。其中，化合物3和4是通過VSRIAN Mercury 300測(cè)定的，1H-NMR是在300MHz下測(cè)定的，13C-NMR是在75MHz下測(cè)定的。


另外，在表2中，給出了化合物2的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(300MHz，氘代氯仿(chloroform-d)溶劑)。


接著，使用正相HPLC(色譜柱Shiseido Silica SG 80A 10×250mm；流動(dòng)相為己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝60∶35∶5；流速為4.0mL/min(室溫))洗脫fr.4-6(0.07g)，利用UV(254nm)檢測(cè)器接收保留時(shí)間為11分13秒時(shí)洗脫出來的峰，得到化合物3(6.0mg)。下面顯示了化合物3的結(jié)構(gòu)式(5)

下面給出與化合物3的性狀有關(guān)的數(shù)據(jù)。另外，HR-FAB-MS(m/z)的測(cè)定是使用JOEL GC mate進(jìn)行的，UVλmaxnm(logε)的測(cè)定是使用Shimadzu UV-160進(jìn)行的，IRνcm-1max的測(cè)定是使用JASCO IR A-2進(jìn)行的。


另外，在表4中，給出了化合物4的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)(600MHz，氘代甲醇(methanol-d4)溶劑)。

NO產(chǎn)生抑制活性試驗(yàn)以化合物1～3為樣品，按照下述步驟進(jìn)行一氧化氮產(chǎn)生抑制活性試驗(yàn)。將各個(gè)樣品溶解于DMSO中。另外，通過在500mL F-12HAM培養(yǎng)基中加入5mL的L-谷氨酰胺(200mM)、50mLFBS，制備成培養(yǎng)基，并使該培養(yǎng)基中的DMSO成為0.2重量％。接著，將50mL鋪滿的RAW264.7細(xì)胞加入到所制備的培養(yǎng)基中，制成細(xì)胞懸濁液。將該細(xì)胞懸濁液放入Falcon試管中。
使用離心機(jī)(1000rpm，3分鐘，4℃)離心RAW264.7細(xì)胞，使用抽吸器除去上清液。接著，在除去了上清液的Falcon試管中加入20mL新鮮的培養(yǎng)基，通過懸浮而得到調(diào)制成1.5×105個(gè)/mL的濃度的懸浮液。接著，在96孔板(住友Bakelite公司制造的8096R)中各注入200μL上述懸浮液，使用CO2培養(yǎng)箱使細(xì)胞粘附1小時(shí)。
培養(yǎng)后，在96孔板中加入2μL的LPS(10μg/mL，sigma公司制造的O5:B5)和2μL的小鼠INF-γ(33ng/mL，Genzyme公司制造)以及0.4μL的化合物溶液。將其在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)，取100μL培養(yǎng)上清液。
向其中加入50μL 0.1％的萘二胺和50μL磺胺溶液，在室溫下遮光放置10分鐘，然后使用分光光度計(jì)在O.D.570nm(對(duì)照655nm)下進(jìn)行測(cè)定。通過顯微鏡檢查觀察和MTT法判定細(xì)胞生存率(Cell viability)。
抑制率(％)＝{1-(X-Y)/(Z-Y)}×100X在試驗(yàn)化合物的存在下由IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的NO2-量Y在沒有試驗(yàn)化合物、IFN-γ和LPS的狀態(tài)下誘導(dǎo)的NO2-量Z由IFN-γ和LPS誘導(dǎo)的NO2-量進(jìn)而，從所計(jì)算出的值，求出樣品化合物的NO產(chǎn)生抑制活性被阻礙50％的濃度(IC50)。細(xì)胞生存率(Cell viability)的結(jié)果一并如表5所示。另外，在表中，“A”表示NO產(chǎn)生抑制率(％)，“B”表示細(xì)胞生存率(％)。

自由基清除活性以化合物1～3為樣品，根據(jù)Okada等的方法進(jìn)行自由基清除活性試驗(yàn)。在96孔板(住友Bakelite公司制造的#8096R)中加入40μL的0.2M醋酸緩沖液(pH5.5)、120μL的12％含水乙醇溶液、0.4μL以二甲亞砜溶解的試驗(yàn)化合物，然后進(jìn)一步加入40μL0.5mM的DPPH溶液，并在暗處放置30分鐘。然后使用平板讀取器(Bio-Rad公司制造的3550 Plate Reader)測(cè)定520nm的吸光度。并且，基于所得到的測(cè)定值，使用下述計(jì)算式計(jì)算出DPPH自由基的清除率。進(jìn)而，從所計(jì)算出來的值，求出樣品化合物的自由基清除活性被阻礙50％的濃度(IC50)，結(jié)果如表6所示。
清除率(％)＝{1-(X-Z)/(Y-Z)}×100X添加了實(shí)驗(yàn)化合物時(shí)的吸光度Y未添加實(shí)驗(yàn)化合物時(shí)的吸光度Z僅為二甲亞砜和12％乙醇溶液時(shí)的吸光度[表6]

權(quán)利要求
1.下述通式(1)所示的三萜衍生物 上式中，R1、R2和R3同時(shí)或者各自獨(dú)立地表示羥基、氫原子、C1-6烷基或烷基醚基。
2.以權(quán)利要求1所述的三萜衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的一氧化氮產(chǎn)生抑制劑。
3.以權(quán)利要求1所述的三萜衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的自由基清除劑。
4.以下述通式(2)所示的苯并吡喃衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的一氧化氮產(chǎn)生抑制劑 上式中，R4表示氫原子、烷基、?；?、糖類。
5.以權(quán)利要求4所述的苯并吡喃衍生物、或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的自由基清除劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于探明來源于沙棘的具有抗炎癥效果的化合物，并開發(fā)該化合物的新用途。上述目的是通過式(1)所示的三萜衍生物和以該三萜衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的一氧化氮產(chǎn)生抑制劑和自由基清除劑來解決的。通式(1)中，R
文檔編號(hào)C07J53/00GK1916016SQ20061011143
公開日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月18日
發(fā)明者北中進(jìn), 大根谷章浩 申請(qǐng)人:學(xué)校法人日本大學(xué)