濃度的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于汞離子檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種采用DNA檢測(cè)汞離子濃度的方法，尤其是 一基于DNA三叉結(jié)構(gòu)的熒光探針檢測(cè)Hg 2+濃度的方法及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 汞被認(rèn)為是分布最廣泛的重金屬污染物之一，以不同的形式存在（有機(jī)、無機(jī)形 式存在或者作為復(fù)合物）于環(huán)境當(dāng)中，可以通過食物鏈在人體內(nèi)富集，汞攝入過量會(huì)引起 許多健康問題，例如：DNA損傷、腦損傷、器官功能損壞、免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞。在水生生 態(tài)系統(tǒng)中，二價(jià)汞離子（Hg 2+)的生物甲基化會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)和基因毒性的甲基汞，所以開發(fā)對(duì) 環(huán)境和食品中Hg2+的檢測(cè)十分必要。
[0003] Katz在1963年提出，當(dāng)在天然DNA中加入汞離子后，汞離子會(huì)導(dǎo)致DNA中胸腺嘧 啶的滑動(dòng)并形成由汞離子連接的金屬離子堿基對(duì)，并提出了汞離子與胸腺嘧啶以1 :2的比 例形成了 T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的假設(shè)，這個(gè)假設(shè)也在后面的研究中被證實(shí)了。近年來，日本科學(xué) 家Akira Ono和Humika Togashi小組用恪解曲線、電噴霧電離-質(zhì)譜和核磁共振等手段 證實(shí)了汞離子在DNA中形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，將兩個(gè)胸腺嘧啶橋連在一起的（如圖7)，并且， T-Hg 2+-T的形成不會(huì)對(duì)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)及電子傳遞特性產(chǎn)生明顯影響。
[0004]目前檢測(cè)汞離子的方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS)、原子吸收光譜測(cè)定 法（AAS)、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法、冷蒸汽原子熒光光譜等幾種。盡管這些方法具有 高度靈敏性，能進(jìn)行多組分分析，但是成本高，耗時(shí)長(zhǎng)并且操作復(fù)雜，隨后又發(fā)展了一些基 于有機(jī)發(fā)色團(tuán)、有機(jī)熒光小分子以及共輒聚合物的傳感技術(shù)。這些方法相對(duì)于傳統(tǒng)方法具 有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)勢(shì)，但是卻有水溶性差、靈敏度低、選擇性局限的缺點(diǎn)，因此，人們迫 切需要簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的Hg 2+檢測(cè)分析方法。
[0005] 熒光分析法是一種由試樣溶液中熒光物質(zhì)所發(fā)生的熒光強(qiáng)度的變化來測(cè)定試樣 溶液中熒光物質(zhì)含量的方法，它具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、選擇性好等多種突出優(yōu)點(diǎn)。DNA 熒光探針對(duì)生物分子影響較小，熒光信號(hào)具有分析檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。在以往 的研究中，已經(jīng)開發(fā)出來一種基于分子信標(biāo)（molecular beacon, MB)的方法，基本的思路是 在萊離子的作用下'打開'（turn-on)或者'關(guān)閉'（turn-off)分子新標(biāo)，以造成可檢測(cè)的 熒光值的變化，根據(jù)此來檢測(cè)溶液中二價(jià)汞離子的濃度（具體原理見圖7)，這種方法相對(duì) 簡(jiǎn)單，易操作，靈敏度高，但是分子信標(biāo)的兩端被焚光發(fā)色團(tuán)（fluorophore)和焚光猝滅團(tuán) (quencher)占據(jù)，這就可能影響了其他標(biāo)記的用，更重要的是這種分子信標(biāo)的方法容易出 現(xiàn)假陽(yáng)性的問題，這些都影響了其在實(shí)踐中的應(yīng)用。
[0006] 現(xiàn)有專利文獻(xiàn)中公開了與本申請(qǐng)相關(guān)的幾篇專利文獻(xiàn)，具體內(nèi)容如下：
[0007] CN102912011A公開了一種基于寡核苷酸鏈的熒光增強(qiáng)型Hg 2+檢測(cè)芯片及方法，利 用了 Hg2+能特異性地與兩條相鄰全胸腺嘧啶（T)寡核苷酸鏈上的T堿基共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn) 定的分子間T - Hg2+-T結(jié)構(gòu)，進(jìn)而誘導(dǎo)與全T寡核苷酸鏈雜交的互補(bǔ)鏈的釋放。制備包括 三個(gè)步驟：首先將檢測(cè)探針固定在經(jīng)化學(xué)修飾的玻片上，然后將熒光標(biāo)記以及淬滅基團(tuán)標(biāo) 記的互補(bǔ)鏈分別與其雜交。使用芯片時(shí)只需將待測(cè)樣品添加到芯片上并保持一段時(shí)間，沖 洗后利用熒光芯片信號(hào)分析系統(tǒng)掃描芯片，通過分析熒光信號(hào)的變化即可實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢 測(cè)。樣品中Hg 2+濃度越高，熒光信號(hào)增強(qiáng)得越多。檢測(cè)的Hg2+的濃度范圍是10nM-100yM， 具有很好的離子選擇性。
[0008] CN104263837A公開基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的表面增強(qiáng)拉曼散射 效應(yīng)檢測(cè)水溶液中Hg 2+和/或Ag +的方法，屬于重金屬離子的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。包括通過制 備BPS包裹的金納米粒子、設(shè)計(jì)核酸探針、信標(biāo)分子的修飾和重金屬離子Hg 2+和/或Ag +的 檢測(cè)等步驟。本發(fā)明提供了一種基于三重信標(biāo)修飾的金納米粒子三聚體的拉曼信號(hào)來檢測(cè) 水溶液中二價(jià)汞離子和/或銀離子的方法，并且可以做到同時(shí)檢測(cè)這兩種離子，此種方法 工作量少，節(jié)約成本，靈敏度高，方便快捷。
[0009] 最近發(fā)展起來的簡(jiǎn)單快速地檢測(cè)Hg2+的方法中，許多都采用了分子信標(biāo)的技術(shù)方 法，本發(fā)明不同于傳統(tǒng)的分子信標(biāo)的方法，設(shè)計(jì)應(yīng)用了 DNA三叉結(jié)構(gòu)，用于檢測(cè)Hg2+的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一基于DNA三叉結(jié)構(gòu)的熒光探針檢測(cè)Hg2+濃度的方法及應(yīng) 用，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一個(gè)基于DNA三叉結(jié)構(gòu)（3WJ)的生物檢測(cè)器，可以用于直接特異性的定量 檢測(cè)Hg 2+的濃度，同時(shí)本發(fā)明還基于該方法，得出一種利用該結(jié)構(gòu)檢測(cè)生物巰基（如谷胱甘 肽和半胱氨酸）的濃度的方法。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0012] 一種基于DNA三叉結(jié)構(gòu)（DNA three-way junction, 3WJ)的焚光探針檢測(cè)Hg2+濃度 的方法，其特征在于：采用三條單鏈DNA，其中第一條鏈標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX，第二條標(biāo)記了 猝滅基團(tuán)BHQ1，第三條鏈不作任何標(biāo)記，其中標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX和標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQ1 單鏈DNA富含胸腺嘧啶T，三條鏈在水溶液中共同形成穩(wěn)定的DNA三叉結(jié)構(gòu)。在該含有3WJ 的溶液加入含有Hg 2+，Hg2+能夠介導(dǎo)SS和AS單鏈DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg 2+-T結(jié)構(gòu)，將 標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQ1單鏈DNA從DNA三叉結(jié)構(gòu)中'推離'出去，DNA三叉結(jié)構(gòu)變?yōu)殡p鏈DNA， 使標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX和猝滅基團(tuán)BHQ1的兩條DNA分開，BHQ1對(duì)HEX熒光的猝滅被解除， ffiX熒光值增加，HEX熒光值的變化與Hg 2+濃度存在線性關(guān)系，通過熒光值的變化，檢測(cè)出 Hg2+的濃度。
[0013] 而且，所述三條單鏈DNA的序列如下：
[0014]標(biāo)記了熒光基團(tuán) HEX 單鏈 DNA :5' -HEXCTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3'
[0015]標(biāo)記了猝滅基團(tuán) BHQ1 單鏈 DNA :5，-ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3'
[0016]無標(biāo)記單鏈 DNA:5' -CGGCGCTGAACCAGGCTTCTGTCTGT-3'。
[0017] -種利用DNA中形成T-Hg2+_T結(jié)構(gòu)檢測(cè)谷胱甘肽和半胱氨酸濃度的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0019] 1、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)建立起來的熒光探針定量檢測(cè)Hg2+的方法，檢 測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R 2值為0. 997,線性良好，由此標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)出的Hg 2+濃度較準(zhǔn) 確。
[0020] 2、本發(fā)明建立的檢測(cè)方法檢測(cè)限度低，最低檢測(cè)限度為3nM，并且能夠檢測(cè) 上至500nM濃度的Hg 2+，檢測(cè)范圍較寬。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（US EPA，Environmental ProtectionAgency)規(guī)定飲用水中Hg2+的超標(biāo)濃度為lOnM;世界衛(wèi)生組織（World Health Organization)規(guī)定引用水中萊離子濃度不得超過30nM，本發(fā)明的檢測(cè)限低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)， 具備對(duì)應(yīng)用水、食品等進(jìn)行檢測(cè)的能力。
[0021] 3、本發(fā)明基于汞離子可以被生物巰基（biothiols)螯合的作用，進(jìn)而解除其在 T-Hg 2+_T中的作用，所以本3WJ檢測(cè)器還可以用來檢測(cè)谷胱甘肽和半胱氨酸等含有巰基的 化合物。發(fā)明人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，該熒光探針用于檢測(cè)谷胱甘肽相關(guān)系數(shù)R 2值為〇. 999,檢測(cè) 范圍為40nM-400nM，而用于檢測(cè)半胱氨酸相關(guān)系數(shù)R2值為0. 996,檢測(cè)范圍為20nM-400nM。
[0022] 4、本發(fā)明設(shè)計(jì)的熒光探針，不僅可以準(zhǔn)確地檢測(cè)Hg2+的濃度，還可以在用于谷胱 甘肽和半胱氨酸的定量，該檢測(cè)方法準(zhǔn)確，檢測(cè)范圍較寬，方法簡(jiǎn)單快捷，易操作。
[0023] 5、本發(fā)明建立起來的檢測(cè)方法對(duì)Hg2+檢測(cè)的特異性強(qiáng)，對(duì)于A1 3+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、 K +、Li2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等其他金屬離子均沒有作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明基于3WJ DNA探針檢測(cè)Hg2+的原理圖；
[0025] 圖2為3WJ探針加入Hg2+、谷胱甘肽、半胱氨酸后熒光值的變化；A是未經(jīng)過退火 的3WJ ;B是經(jīng)過退火的3WJ ;C是3WJ+Hg2+;D是含HEX修飾的單鏈DNA(SS) ;E是經(jīng)過退火 的3WJ+Hg2++谷胱甘肽；F是經(jīng)過退火的3WJ+Hg2++半胱氨酸。加入3WJ終濃度為5nM ;Hg2+ 濃度為500 y M;谷胱甘肽和半胱氨酸濃度為500 y M。
[0026] 圖3為本發(fā)明檢測(cè)體系的選擇性，加入3WJ終濃度為5nM，所有金屬離子的濃度為 500 yM ；
[0027] 圖4為本發(fā)明不同濃度汞離子下3WJ熒光探針的熒光發(fā)射光譜。內(nèi)插圖：萊離子 濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系；
[0028] 圖5為本發(fā)明不同濃度谷胱甘肽下3WJ熒光探針的熒光發(fā)射光譜。內(nèi)插圖：谷胱 甘肽濃度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系；
[0029] 圖6為不同濃度半胱氨酸下3WJ熒光探針的熒光發(fā)射光譜。內(nèi)插圖：半胱氨酸濃 度與熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系；
[0030] 圖7為前人應(yīng)用分子信標(biāo)檢測(cè)Hg2+濃度的示意圖。
[0031] 具體的實(shí)施方式
[0032] 為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實(shí)施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033] 本發(fā)明設(shè)計(jì)一種DNA三叉結(jié)構(gòu)作為生物檢測(cè)器，其由三條單鏈DNA退火后組成，其 中第一條鏈標(biāo)記了熒光基團(tuán)ffiX (命名為SS)，第二條標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQ1 (命名為Q