一種基于分子轉(zhuǎn)子的用于成像組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的熒光探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于分子轉(zhuǎn)子的高信噪比細(xì)胞膜探針及其應(yīng)用，尤其涉及一種適 用于雙光子顯微鏡近紅外激發(fā)光源深紅發(fā)射的細(xì)胞膜熒光探針及其在標(biāo)記或顯示組織中 的細(xì)胞膜形態(tài)和活細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞膜作為真核細(xì)胞的第一屏障，通過選擇性地調(diào)節(jié)某些物質(zhì)的進(jìn)出，保證了細(xì) 胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，使各種生化反應(yīng)能夠有序進(jìn)行。同時(shí)，細(xì)胞膜與信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞分化， 細(xì)胞融合，細(xì)胞識(shí)別等細(xì)胞活動(dòng)息息相關(guān)。據(jù)我們所知，相比人工體外培養(yǎng)的細(xì)胞，許多細(xì) 胞的狀態(tài)及基本功能在組織中能更好地反應(yīng)其真實(shí)自然的情況。比如在體外培養(yǎng)的細(xì)胞的 細(xì)胞膜形態(tài)與其在真實(shí)組織中的形態(tài)存在著很大的不同。因此原位實(shí)時(shí)地可視化細(xì)胞膜對(duì) 于我們理解其相關(guān)的生理過程及形態(tài)是非常必要的。目前，熒光探針由于非侵入性、原位實(shí) 時(shí)快速檢測(cè)的特點(diǎn)已成為一種非常有利的生物成像工具。因此，開發(fā)一種能夠在細(xì)胞中特 別是組織中準(zhǔn)確勾勒細(xì)胞邊緣的細(xì)胞膜熒光探針是十分必要的。
[0003] 大量的研究已經(jīng)表明雙光子顯微鏡(TPM)比單光子顯微鏡在生物成像方面特別是 厚的或高散射的組織樣品的成像更具有優(yōu)勢(shì)。因?yàn)槭褂瞄L波長的近紅外光作為激發(fā)源和更 小的激發(fā)面積，TPM大大減小了對(duì)樣品光漂白作用。同時(shí)長波長的激發(fā)源也有效地避開了細(xì) 胞的自吸收和光散射，從而增大了樣品的穿透深度。因此，一些用于TPM的細(xì)胞膜探針已經(jīng) 被成功開發(fā)。Laurdan是早期開發(fā)的可用于成像細(xì)胞膜的雙光子探針，但是對(duì)細(xì)胞膜磷脂較 弱的親和力導(dǎo)致它們內(nèi)在化極其嚴(yán)重(Y.X.Zeng.et al.，2014.Proc.of SPIE Vol.9230)。 近期，Chi-Kin Koo et al.等人報(bào)道了一個(gè)大雙光子吸收截面的細(xì)胞膜探針，然而細(xì)胞圖 片的保真度較低（Chi-Kin，K. et al ·，2009，Inorg · Chem. ,48，7501)。相比普通的雙光子細(xì) 胞膜探針，基于轉(zhuǎn)子型的雙光子細(xì)胞膜探針有利于增強(qiáng)信噪比，提高照片質(zhì)量。分子轉(zhuǎn)子的 熒光強(qiáng)度強(qiáng)烈地依賴于環(huán)境的粘度，在高粘度環(huán)境下，其自由旋轉(zhuǎn)受阻，輻射躍迀增強(qiáng)，導(dǎo) 致熒光增強(qiáng)。分子轉(zhuǎn)子的這一性質(zhì)正好可以應(yīng)用到具有高粘度的細(xì)胞膜，從而使探針一旦 靶向到細(xì)胞膜后熒光顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)熒光的turn-on效果，提高照片的信噪比。
[0004]在生物成像中，紅光或深紅光發(fā)射也是十分有利于厚組織樣品內(nèi)信號(hào)的檢測(cè)。首 先，長波長的紅光或深紅光比短波長的藍(lán)綠光穿透力更強(qiáng)，能夠提高對(duì)生物樣品的探測(cè)深 度。其次，紅光或深紅光的波長處于生物光學(xué)窗口，光毒性低，大大降低了對(duì)樣品的光損傷。 而且，長波長的紅光或深紅光發(fā)射有效地避開了細(xì)胞的自吸收和自發(fā)熒光，有利于提高信 噪比。因此，開發(fā)雙光子紅光或深紅光發(fā)射的膜探針對(duì)于成像組織中的細(xì)胞膜探針十分有 利。然而，雙光子紅光或深紅光的細(xì)胞膜探針卻鮮有報(bào)道。據(jù)我們所知，只有兩個(gè)基于納米 粒子的紅發(fā)射的雙光子細(xì)胞膜探針被Liu et al.所報(bào)道（P.Liu，et al.，2015， Appl .Mater · Interfaces，7,6754)。這兩個(gè)探針都是通過焚光能量共振轉(zhuǎn)移將一個(gè)綠色的 熒光團(tuán)共輒地連接到一個(gè)紅色的熒光團(tuán)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了長波長的紅光發(fā)射。無疑，這樣一方面 增大了合成的難度，另一方面這樣大的分子結(jié)構(gòu)限制了其在組織樣品中的應(yīng)用?；诖?，研 究和開發(fā)新型的能夠清晰可視化細(xì)胞內(nèi)特別是組織中的細(xì)胞膜的熒光探針具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種基于分子轉(zhuǎn)子的用于成像 組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的熒光探針。
[0006] 本發(fā)明所述基于分子轉(zhuǎn)子的用于成像組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的熒光探 針為轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射細(xì)胞膜熒光探針，為三苯胺衍生物，其特征在于:所述熒光探 針的化學(xué)名稱為:N，N-二（（4-(2'-(4"-十二烷基)吡啶-4"碘化物）乙烯)苯基)苯胺，其化學(xué) 結(jié)構(gòu)通式如式(I)所示：
[0007] V. X
〇
[0008] 上述轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射細(xì)胞膜熒光探針的制備方案概述如下：
[0009] 以紅發(fā)射的苯乙烯吡啶鹽分子進(jìn)行改造。為了使該分子有大的雙光子吸收截面， 將兩個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)通過三苯胺連接起來，這樣可在兩個(gè)方向?qū)崿F(xiàn)光場(chǎng)極化，大大增強(qiáng)了分 子的雙光子吸收截面。本發(fā)明經(jīng)大量的試驗(yàn)篩選將連接體確定為三苯胺，是由于三苯胺本 身具有轉(zhuǎn)子的性質(zhì)，這一特性正好可以應(yīng)用于具有高粘度的細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)熒光的turn-on效 果，提高信噪比。在兩個(gè)吡啶鹽處各接十二個(gè)碳原子的親脂性的長烷基鏈能夠保證很好地 綁定到磷脂雙分子層中，減小內(nèi)在化?；谝陨戏桨负头磸?fù)試驗(yàn)，深紅發(fā)射的雙光子的三苯 胺衍生物ΤΙ (N，N-二（（4-( 2 ' -(4" -十二烷基)吡啶-4"碘化物)乙烯)苯基)苯胺)最終形成。 [0010]具體的，上述深紅發(fā)射的雙光子的三苯胺衍生物τι的制備反應(yīng)式如下：
[0011]
[0012] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射細(xì)胞膜熒光探針在標(biāo)記或顯示組織中的細(xì) 胞膜形態(tài)和活細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0013] 其中，所述組織為小鼠肌肉組織和肝臟組織;所述活細(xì)胞為永生化細(xì)胞和正常細(xì) 胞。所述永生化細(xì)胞是HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞，所述正常細(xì)胞是HUVEC細(xì)胞。
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)子型的雙光子深紅發(fā)射的細(xì)胞膜熒光探針(T1)在 高粘度環(huán)境(甘油）中的熒光強(qiáng)度明顯高于普通的有機(jī)溶劑。高的信噪比使它能夠清晰地染 色永生化細(xì)胞(HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞)和正常細(xì)胞(HUEVC細(xì)胞）的細(xì)胞膜，并且發(fā)出明亮的 深紅色熒光。將本發(fā)明公開的熒光探針T1與鑒別凋亡或死細(xì)胞的商業(yè)化染料SYT0X藍(lán)色核 酸染料(S-11348)進(jìn)行共染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明T1能夠染色活細(xì)胞。在TPM下，T1也能夠均勻連 續(xù)地染色組織(小鼠肌肉組織或肝臟組織）中的細(xì)胞膜。同時(shí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了該探針具有 低的毒性、優(yōu)秀的光穩(wěn)定性以及和其他探針很好的兼容性，提示該探針有望為研究與細(xì)胞 膜相關(guān)的生理和病理活動(dòng)提供直觀的和有利的影像證據(jù)。
[0015] 本發(fā)明提供的基于分子轉(zhuǎn)子的用于成像組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的熒光 探針是首次報(bào)道的可成像組織中細(xì)胞膜的雙光子深紅發(fā)射的探針分子。與功能相近的其他 細(xì)胞膜熒光探針相比，本發(fā)明所述探針具有分子結(jié)構(gòu)小、光穩(wěn)定性強(qiáng)、兼容性好、斯托克斯 位移大、激發(fā)能量低、雙光子吸收截面大的特點(diǎn)。本發(fā)明的熒光探針T1是一個(gè)轉(zhuǎn)子型的探針 分子，能夠在高粘度的細(xì)胞膜上實(shí)現(xiàn)熒光turn-on效果，預(yù)示其作為細(xì)胞膜熒光探針具有很 好的前景，有望填補(bǔ)細(xì)胞膜探針在組織成像方面的空缺。
【附圖說明】
[0016] 圖1:染色He La細(xì)胞的照片。
[0017] (I)用T1染色后在800nm激光輻照下得到的雙光子照片。其中a圖為雙光子熒光照 片;b圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片;c圖為a、b的疊加圖。
[0018] (II)分別用T1和S-11348染色細(xì)胞后的共聚焦熒光照片。其中d圖為用T1染色后在 488nm激光輻照下得到的照片;e圖為用S-11348染色后的在405nm激光輻照下得到的照片;f 圖為d、e的疊加圖。
[0019] (III)分別用T1和Hoechst 33342染色細(xì)胞后的共聚焦熒光照片。其中g(shù)圖為用T1 染色后在488nm激光輻照下得到的照片;h圖為用Hoechst 33342染色后的在405nm激光輻照 下得到的照片；i圖為g、h的疊加圖。
[0020] 圖2: T1分別染色SiHa細(xì)胞(I)和HUVEC細(xì)胞(II)的共聚焦熒光照片。
[0021] 其中a、d為488nm激光輻照下得到的照片;b、e圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片； c圖為a、b的疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。
[0022]圖3:T1染色HeLa細(xì)胞的共聚焦（I)和雙光子(II)熒光照片。
[0023] 其中l(wèi)a圖為488nm激光輻照下得到的照片，lid圖為800nm激光輻照下得到的雙光 子照片;b、e圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片;c圖為a、b的疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。T1 染色HeLa細(xì)胞后在488nm和800nm激光連續(xù)輻照下獲得的一系列不同時(shí)間的共聚焦（III圖） 和雙光子(IV圖）熒光照片。
[0024]圖4:用T1染色小鼠肌肉組織（I圖）和肝臟組織（II圖）后在800nm激光輻照下得到 的雙光子熒光照片。
[0025]其中a、d圖為雙光子熒光照片;b、e圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；c圖為a、b 的疊加圖，f圖為d、e的疊加圖。
【具體實(shí)施方式】 [0026] 實(shí)施例1:
[0027] N，N_二甲?；桨返暮铣?br>[0028] 將干燥的DMF(3 · 7mL)和三氯氧磷（3 · 7mL，40 · 7mmo 1)混合加入三口燒瓶，在0°C下 攪拌。30min后，將溶于氯仿中的三苯胺（1.0g，4. Ommol)逐滴加入上述混合物中，加熱攪拌 24h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入適量的氫氧化鈉和水，然后用二氯甲燒萃取，水洗。用無 水硫酸鈉進(jìn)行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物進(jìn)行柱層分析獲得最終產(chǎn)物。
[0029] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)：5(ppm)9.88(s,2H),7.85(d,J =