S)，第 三條鏈不作任何標(biāo)記（命名為AS)，其中QS和AS單鏈DNA富含胸腺嘧啶T，三條鏈在水溶 液中共同形成穩(wěn)定的DNA三叉結(jié)構(gòu)。在該含有3WJ的溶液加入含有Hg 2+，Hg2+能夠介導(dǎo)QS 和AS單鏈DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，將第QS單鏈DNA從DNA三叉結(jié)構(gòu)中'推 離'出去，DNA三叉結(jié)構(gòu)變?yōu)殡p鏈DNA，使標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX和猝滅基團(tuán)BHQ1的兩條DNA 分開(kāi)，BHQ1對(duì)HEX熒光的猝滅被解除，HEX熒光值增加，HEX熒光值的變化與Hg 2+濃度在一 定范圍存在線性關(guān)系，所以通過(guò)熒光值的變化，檢測(cè)出Hg2+的濃度。具體原理見(jiàn)附圖1。
[0034]在含10nM熒光探針中加入汞離子、半胱氨酸和谷胱甘肽，并監(jiān)測(cè)加入前后熒光信 號(hào)的變化。結(jié)果如附圖2所示，初始時(shí)熒光探針3WJ在554處熒光發(fā)射信號(hào)很弱，當(dāng)加入了 500 yM的汞離子，可以觀測(cè)到熒光強(qiáng)度得到了很大程度的增強(qiáng)，當(dāng)繼續(xù)加入500 yM半胱氨 酸或者谷胱甘肽，可以觀測(cè)到大約90%的熒光信號(hào)被抑制，以上結(jié)果表明該方法可以實(shí)現(xiàn) 對(duì)汞離子和谷胱甘肽以及半胱氨酸的檢測(cè)。
[0035] 具體操作步驟如下：
[0036] (1)熒光探針DNA三叉結(jié)構(gòu)的形成
[0037] 三條單鏈DNA的序列：
[0038] SS 單鏈 DNA :5' -HEX CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3'
[0039] QS 單鏈 DNA :5，-ACAGACAGCCCACAAGACAGAG BHQ1-3'
[0040] AS 單鏈 DNA : 5' -CGGCGCTGCTGGAGGCTTCTGTCTGT-3，
[0041] ①將三條單鏈DNA按1:1:1的比例加入，終濃度均為15nM，緩沖液終濃度如下。
[0042]
[0043] 將以上組分混勻，95°C加熱5min，自然冷卻過(guò)夜，配對(duì)成1. 5X3WJ。
[0044] (2)熒光探針3WJ對(duì)Hg2+的定量檢測(cè)
[0045] ①Hg2+貯存液的配制
[0046] 0? 5 % HN03溶解 HgCl 2，配成 0? 1M 的 Hg2+貯存液；
[0047] Hg2+貯存液的稀釋緩沖液：0? 05MTris-HCl，pH7. 4 ;0? 1MNaCl;
[0048] ②10nM熒光探針3WJ與不同濃度Hg2+孵育條件如下：
[0049]
[0050] 將以上各組分混勻，37°C水浴40min，自然冷卻至室溫。使得熒光探針的三叉結(jié)構(gòu) 能夠被Hg 2+破壞，形成雙鏈DNA，使另一條修飾BHQ1的DNA與之分開(kāi)，從而使熒光值增大。
[0051] ③用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各管的熒光值，測(cè)定參數(shù)如下。
[0052]激發(fā)波長(zhǎng)：535. Onm
[0053] 發(fā)射波長(zhǎng)開(kāi)始：545. Onm
[0054] 發(fā)射波長(zhǎng)結(jié)束：620.0 nm
[0055]掃描速度：30nm/min
[0056] 激發(fā)波長(zhǎng)狹縫寬度：5. Onm
[0057] 發(fā)射波長(zhǎng)狹縫寬度：10.0 nm
[0058] 將測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖4，R2= 0. 997，y = 58. 08x+62. 18,根據(jù)公式LOD =3 〇 /slope算得最低檢測(cè)限度（limitation ofdetection, LOD)為3nM，線性良好，檢測(cè)范 圍寬。
[0059] (3)熒光探針3WJ對(duì)Hg2+檢測(cè)的選擇性
[0060]將 A1C13、CaCl2、FeCl3、GuS04、KC1、LiS0 4、MnCl2、NiCl2、ZnS〇A、別溶于 ddH 20 配制 成相應(yīng)的金屬離子溶液，終濃度均為0. 1M，加入熒光探針3WJ，反應(yīng)體系如下：
[0061]
[0062] 將以上組分混勻，37°C水浴40min，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定各管的熒光值，將實(shí)驗(yàn) 結(jié)果整理繪制圖表，如附圖3。在所有被加入的金屬離子里只有汞離子能夠?qū)е旅黠@的熒光 強(qiáng)度降低，其他金屬離子對(duì)傳感體系的熒光影響并不大，這個(gè)結(jié)果證明該測(cè)汞離子體系對(duì) 于其他干擾離子具有良好的選擇性。
[0063] (4)熒光探針3WJ對(duì)谷胱甘肽的定量檢測(cè)
[0064]
[0065] 按以上體系將各組分依次加入EP管中，共13份，混勻，37°C水浴40min，自然冷 卻至室溫，使得熒光探針的三叉結(jié)構(gòu)能夠被Hg2+破壞，形成雙鏈DNA，記錄加入Hg 2+之后熒 光值的變化，而后向其中分別加入不同濃度的谷胱甘肽，終濃度為20nM-1000nM，37 °C水浴 40min，自然冷卻至室溫，用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定熒光值，將測(cè)得的數(shù)據(jù)整理繪圖，得出 熒光探針在加入Hg 2+充分破壞3WJ結(jié)構(gòu)之后，加入不同濃度的谷胱甘肽可使熒光探針的熒 光值降低，隨著谷胱甘肽濃度的增加，熒光值逐漸減弱，在谷胱甘肽濃度達(dá)到400nM時(shí)，熒 光值的變化趨于平穩(wěn)，由此可根據(jù)谷胱甘肽終濃度為20nM-400nM這一范圍做出能定量檢 測(cè)谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如附圖5, y = -46. 93X+267. 76, R2為0. 999,線性良好，能夠準(zhǔn) 確定量谷胱甘肽的濃度。
[0066] (5)熒光探針3WJ DNA對(duì)半胱氨酸的定量檢測(cè)
[0067]
[0068] 按以上體系將各組分依次加入EP管中，共13份，混勻，37°C水浴40min，自然冷 卻至室溫，使得熒光探針的三叉結(jié)構(gòu)能夠被Hg2+破壞，形成雙鏈DNA，記錄加入Hg2+之后熒 光值的變化，而后向其中分別加入不同濃度的半胱氨酸，終濃度為20nM-1000nM，37 °C水浴 40min，自然冷卻至室溫，用熒光分光光度計(jì)分別測(cè)定熒光值，將測(cè)得的數(shù)據(jù)整理繪圖，得出 熒光探針在加入Hg2+充分破壞3WJ結(jié)構(gòu)之后，加入不同濃度的半胱氨酸可使熒光探針的熒 光值降低，隨著半胱氨酸的增加，熒光值逐漸減弱，在半胱氨酸濃度達(dá)到400nM時(shí)，熒光值 的變化趨于平穩(wěn)，由此可根據(jù)半胱氨酸終濃度為20nM-400nM這一范圍做出能定量檢測(cè)谷 胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如附圖6, y = -45. 18X+310. 33, R2為0. 996,線性良好，能夠準(zhǔn)確定 量半胱氨酸的濃度。
[0069] (6)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)
[0070] 10nM熒光探針3WJ在有自來(lái)水樣品的背景下，與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品Hg2+孵育條件如 下：
[0071]
[0072] 將以上各組分混勻，37°C水浴40min，自然冷卻至室溫，用熒光分光光度計(jì)分別測(cè) 定熒光值，將測(cè)得的加標(biāo)樣品熒光值減去未加標(biāo)的樣品，差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到實(shí)際 測(cè)得的Hg 2+濃度，比上理論的Hg2+濃度，即得到加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在自來(lái)水作為 背景的條件下，加入標(biāo)準(zhǔn)樣品的Hg 2+濃度分別為5nM，10nM，30nM，300nM，400nM時(shí)，加標(biāo)回收 率分別為103. 0 %，102. 3 %，102. 8 %，104. 9 %，97. 4 %，如表1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，該熒光 探針能較準(zhǔn)確地測(cè)定Hg2+的濃度。
[0073]表1實(shí)際水樣中汞離子的回收率。
[0074]
[0075] a :每個(gè)樣品設(shè)置4次平行實(shí)驗(yàn)求得平均值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于DNA三叉結(jié)構(gòu)的熒光探針檢測(cè)Hg 2+濃度的方法，其特征在于：采用三條單 鏈DNA，其中第一條鏈標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX，第二條標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQl，第三條鏈不作任 何標(biāo)記，其中標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX和標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQl單鏈DNA富含胸腺嘧啶T，三條鏈 在水溶液中共同形成穩(wěn)定的DNA三叉結(jié)構(gòu)。在該含有3WJ的溶液加入含有Hg 2+，Hg2+能夠 介導(dǎo)SS和AS單鏈DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，將標(biāo)記了猝滅基團(tuán)BHQl單鏈DNA 從DNA三叉結(jié)構(gòu)中'推離'出去，DNA三叉結(jié)構(gòu)變?yōu)殡p鏈DNA，使標(biāo)記了熒光基團(tuán)HEX和猝滅 基團(tuán)BHQl的兩條DNA分開(kāi)，BHQl對(duì)HEX熒光的猝滅被解除，HEX熒光值增加，HEX熒光值的 變化與Hg 2+濃度存在線性關(guān)系，通過(guò)熒光值的變化，檢測(cè)出Hg 2+的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA三叉結(jié)構(gòu)的熒光探針檢測(cè)Hg 2+濃度的方法，其特征 在于：所述三條單鏈DNA的序列如下： 標(biāo)記了熒光基團(tuán)JEX單鏈DNA : 5' -HEX CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3r 標(biāo)記了猝滅基團(tuán) BHQl 單鏈 DNA :5' -ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3' 無(wú)標(biāo)記單鏈 DNA : 5' -CGGCGCTGAACCAGGCTTCTGTCTGT-3'。3. -種利用DNA中形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)檢測(cè)谷胱甘肽和半胱氨酸濃度的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于一基于DNA三叉結(jié)構(gòu)的熒光探針特異性檢測(cè)Hg2+、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)等含巰基物質(zhì)濃度的方法及應(yīng)用。3WJ由三條單鏈DNA退火組成，包含一條標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX(稱為SS)、一條標(biāo)記猝滅基團(tuán)BHQ1(稱為QS)和一條不作任何標(biāo)記(稱為AS)的DNA。其中SS和AS富含胸腺嘧啶(T)。在無(wú)汞離子的情況下三條鏈在水溶液中形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。加入Hg2+，其介導(dǎo)3WJ形成T-Hg2+-T，造成3WJ空間結(jié)構(gòu)變化；再加入GSH或Cys后，3WJ結(jié)構(gòu)發(fā)生恢復(fù)。這種結(jié)構(gòu)變化可通過(guò)HEX熒光反映出來(lái)。通過(guò)熒光值的變化還可定量Hg2+、GSH和Cys。<pb pnum="1" />
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105039521
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510354085
【發(fā)明人】馬龍, 刁愛(ài)坡, 吳觀榮, 李玉峰, 秦萍, 李玉銀
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月24日