(溶液的）體積與體積比。
[0109] HPLC 和 LC/MS 方法： 方法 I (LC-MS): 儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC System ;柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1. 8μ50 χ I mm ;流動相A :1 1水+ 0· 25 ml 99%濃度的甲酸，流動相B :1 1乙腈+ 0· 25 ml 99% 甲酸；梯度：〇· 〇 min 90%A - I. 2 min 5%A - 2. 0 min 5%A ;恒溫箱：50°C ;流速：0· 40 ml/ min ;紫外檢測：208 - 400 nm。
[0110] 在下面描述的本發(fā)明的合成中間體和工作實施例中，如果以對應(yīng)的堿或酸的鹽的 形式給出化合物，通過各種制備和/或純化方法得到的這樣的鹽的精確化學(xué)計量組成通常 是未知的。除非更詳細地指出，對名稱和結(jié)構(gòu)式的添加(諸如"鹽酸鹽"、"三氟乙酸鹽"、"鈉 鹽"或"χ HCl"、"x CF3C00H"、"x Na+"）不應(yīng)當(dāng)就這樣的鹽而言在化學(xué)計量上理解，而是僅 僅具有關(guān)于其中包含的成鹽組分的描述性特征。
[0111] 如果通過以未知化學(xué)計量組成（如果屬于確定的類型）的溶劑合物(例如水合物） 的形式描述的制備和/或純化方法得到合成中間體或工作實施例或其鹽，這相應(yīng)地適用。
[0112] 起始化合物和中間體: 實施例1A 5-氟-1-(2-氟芐基）-IH-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-甲脒鹽酸鹽
將406.0 g (1.50 mol) 5-氟-1-(2-氟芐基）-1Η-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-甲腈（該 化合物的制備描述于W02012/028645,實施例3，第10頁）懸浮于2. 08 1乙醇中。然后加 入54. I g (0.30 mol)甲醇鈉在甲醇（30%)中的溶液，并將混合物在室溫攪拌過夜。加入 88.4 g (1.65 mol)氯化銨，并將混合物加熱至65°C和在65°C攪拌3.5 h。在真空中除去 溶劑，并將殘余物與1.6 1乙酸乙酯一起攪拌過夜。將沉淀的固體濾出，每次用140 ml乙 酸乙酯洗滌2次，并在真空干燥箱中在50°C在輕微氮氣流下干燥。得到441.4 g (理論值 的90. 7%)標(biāo)題化合物。
[0113] 實施例2A 3, 3-二氰基-2-(三氟甲基）丙烯酸甲酯
該化合物的合成描述于Journal of Fluorine Chemistry, 1991，第51卷，第3期第 323 - 334 頁。
[0114] 實施例3A 2_ (二氰基甲基）_3, 3, 3-三氟-2-甲基丙酸甲酯
將3.00 g (14. 698 mmol)實施例2A溶解在四氫呋喃（30 ml)中并冷卻至0°C。然后 逐滴加入7. 35 ml (22. 047 mmol)甲基氯化鎂（3M在THF中），使得溫度不超過5°C。完全 加入后，將混合物攪拌另外10 min。然后加入IN鹽酸水溶液，隨后用乙酸乙酯萃取混合物。 分離各相，并將水相用乙酸乙酯萃取另外2次。將合并的有機相用飽和的氯化鈉水溶液洗 滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。然后將粗產(chǎn)物在在硅膠上色譜分離（流動相：環(huán)己烷，然 后環(huán)己烷：乙酸乙酯9:1 (v:v)。濃縮后得到3.24 g (理論值的63%)標(biāo)題化合物。 !?|Ι：: 31? ：#Λ：IIti
[0115] 實施例4A 4-氨基-2- [5-氟-I- (2-氟芐基）-IH-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三 氟甲基）-5, 7-二氫-6H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-6-酮
將 700 mg (6. 246 mmol)叔丁醇鉀加入 I. 348 g (4. 164 mmol)實施例 IA在叔丁醇（23 ml)中的溶液中。然后加入1.100 g (4.997 mmol)實施例3A在叔丁醇（5 ml)中的溶液， 并將混合物回流加熱過夜。冷卻后，將水和乙酸乙酯加入反應(yīng)混合物中。分離各相，并將水 相用乙酸乙酯萃取另外2次。然后將合并的有機相用飽和的氯化鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉 干燥，過濾，在真空中濃縮，并在高真空下干燥。得到1.98 g標(biāo)題化合物（理論值的99%)。 K WsR U、 q、MSr 部b M H urU ⑷、u:汝、JBs、次鉢 iud ! Η?、H >3(1漢、、IHl,
[0116] 實施例5A 2_ [5-氟-1-(2-氟芐基）-IH-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-基]-4-碘-5-甲基-5-(三氟 甲基）-5, 7-二氫-6H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-6-酮
預(yù)先將1.980 g (4. 165 mmol)實施例4A放入二氧雜環(huán)己烷（38 ml)中，加入2. 804 ml (20. 825 mmol)亞硝酸異戊酯和1. 007 ml (12. 495 mmol)二碘甲烷，并將混合物在85°C 加熱過夜。冷卻后，將混合物濃縮至干燥，將殘余物溶解于二氯甲烷中，加入硅藻土，然后將 混合物在真空中濃縮。然后將吸附在硅藻土上的粗制化合物在硅膠上色譜分離（流動相： 二氯甲烷：甲醇梯度）。濃縮后，將殘余物再次溶解于二氯甲烷中，加入硅藻土，然后將混合 物在真空中 濃縮。然后將吸附在硅藻土上的預(yù)純化的化合物在硅膠上色譜分離（流動相：環(huán)己 烷：乙酸乙酯梯度）。濃縮得到1. 04 g (理論值的42%)標(biāo)題化合物。
[0117] 工作實施例： 實施例1 2- [5-氟-1- (2-氟芐基）-IH-吡唑并[3, 4-b]吡啶-3-基]-5-甲基-5-(三氟甲 基）-4- [ (3, 3, 3-三氟丙基）氨基]-5, 7-二氫-6H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-6-酮
在適合用在微波中的反應(yīng)容器內(nèi)，將1. 037 g (1. 769 mmol)實施例5A溶解在1-甲 基-2-吡咯烷酮（10 ml)中，并加入484μ1 (5. 395 mmol) 3, 3, 3-三氟丙基-1-胺。然后 使用隔膜封閉，并在微波中在150°C加熱3h。冷卻后，將反應(yīng)混合物倒入水中。將形成的固 體濾出。然后將固體溶解在乙酸乙酯中，用硫酸鈉干燥，過濾并在真空中濃縮。將殘余物溶 解于3 ml乙腈中，加入水，并在超聲浴中簡短地處理。再次過濾，并用大量水洗滌，然后在 高真空下干燥。得到980 mg標(biāo)題化合物（理論值的97%)。
[0118] 分離成對映異構(gòu)體： 通過手性相（Daicel Chiralpak AZ-H, 5μΜ 250 X 30 mm)上的制備型SFC (流動相： (CO2/乙醇 70/30,流速：100 ml/min，溫度：40°C，壓力：80 巴，波長：210 nM)，將 980 mg 外 消旋體分離成對映異構(gòu)體。
[0119] 實施例1-1 (對映異構(gòu)體1) 收率：310 mg Rt = 3.794 min; ee > 99%,純度> 97%(手性相（Daicel Chiralpak AZ-H, 5μΜ 250 X 4.6 mm)上的分析型SFC (流動相：（CO2/甲醇80/20,流速：3 ml/min))。
[0120] 實施例1-2 (對映異構(gòu)體2) 收率：145 mg Rt = 5.875 min; ee > 99%,純度> 99%(手性相（Daicel Chiralpak AZ-H, 5μΜ 250 χ 4.6 mm)上的分析型SFC (流動相：（CO2/甲醇80/20,流速：3 ml/min))。
[0121] Β·藥理學(xué)效力的評估 下面使用以下縮寫： BSA 牛血清白蛋白 EDTA 乙二胺四乙酸 MCi 微居里 Tris三（羥基甲基）氨基甲烷 可以在下述測定中證實根據(jù)本發(fā)明的化合物的藥理學(xué)作用： B-L對重組的鳥苷酸環(huán)化酶報道細胞系的作用 如在F. Wunder等人，Anal. Biochem. 339. 104-112 (2005)中所述，用重組的鳥苷酸 環(huán)化酶報道細胞系測定了根據(jù)本發(fā)明的化合物的細胞作用。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明的化合物的代表性值（MEC =最小有效濃度）在下表（表1)中列出： 表1:
[0123] B-2.對清醒的自發(fā)性高血壓大鼠的血壓的無線電遙測測量 使用Data Sciences International DSI，USA的市售可得的遙測系統(tǒng)，用于對清醒的 大鼠進行下述血壓測量。
[0124] 所述系統(tǒng)由3個主要組件組成： -可植入的發(fā)射器（Physiotel?遙測發(fā)射機） -接收器（Physiotel?接收器），其經(jīng)由轉(zhuǎn)換開關(guān)（DSI Data Exchange Matrix)連接 至 -數(shù)據(jù)采集計算機。
[0125] 該遙測系統(tǒng)使得能夠在清醒的動物的常規(guī)棲息地連續(xù)記錄其血壓、心率和身體運 動。
[0126] 動物材料 對具有>200 g的體重的成年雌性自發(fā)性高血壓大鼠 （SHR Okamoto)進行研究。得自 Okamoto Kyoto School of Medicine, 1963 的 SHR/NCrl 是具有重度高血壓的雄性 Wistar Kyoto大鼠與具有輕度高血壓的雌性大鼠的雜交體，并在F13時移交至美國國立衛(wèi)生研究 院。
[0127] 在發(fā)射器植入以后，將實驗動物獨自地圈養(yǎng)在3型Makrolon籠中。它們自由攝取 標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。
[0128] 實驗室中的日/夜節(jié)律通過室內(nèi)照明在早上6:00和在晚上19:00進行變化。
[0129] 發(fā)射器植入 將使用的遙測發(fā)射機TAll PA - C40在第一次實驗使用以前至少14天于無菌條件下手 術(shù)植入實驗動物中。以此方式配備儀器的動物可以在傷口愈合且植入物穩(wěn)定后重復(fù)使用。
[0130] 在通流容器中開始含有5%異氟烷的麻醉氣體O2 + N2O 30:50。
[0131] 已經(jīng)開始麻醉以后，將動物連接至熱板上的麻醉罩，并接收1. 8%異氟烷進行麻醉 維持，并在它的腹部的大面積上剃毛和消毒。在沿著腹白線將腹腔切開以后，將所述系統(tǒng)的 液體填充的測量導(dǎo)管以頭蓋方向插入分歧部以上的降主動脈，并用組織膠（VetBonD?，3M) 固定。將發(fā)射器外殼在腹膜內(nèi)固定至腹壁肌肉，并進行傷口的分層閉合。
[0132] 手術(shù)后施用抗菌素（0xytetracyclin?10%，60 mg/kg皮下，0· 06 ml/100g體重， Beta-Pharma GmbH & Co,德國）和鎮(zhèn)痛劑（卡布洛芬?, 4 mg/kg皮下，Pfizer，德國） 以預(yù)防感染。
[0133] 物質(zhì)和溶液 除非另外指出，在每種情況下通過管飼法將要研究的物質(zhì)口服地施用給一組動物 (n=6)。將測試物質(zhì)溶解在合適的溶劑混合物中，或懸浮于0. 5%濃度的甲基纖維素中，其適 合于2 ml/kg體重的施用體積。
[0134] 采用溶劑處理過的動物組作為對照。
[0135] 試驗程序 將遙測測量裝置配置給24個動物。按實驗編號記錄每個實驗（V年月日）。
[0136] 生活在所述裝置中的每只帶儀器的大鼠分配有單獨的接收天線（1010接收器， DSI) 〇
[0137] 植入的發(fā)射器可以從外部通過引入的磁力開關(guān)激活，并在實驗預(yù)先開動中轉(zhuǎn)換到 發(fā)射狀態(tài)。發(fā)射的信號可以通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（用于Windows的Dataquest? A. R. T.，DSI) 在線獲得，并適當(dāng)?shù)剡M行處理。在每種情況下數(shù)據(jù)被存儲到為此生成的帶有實驗編號的文 件中。
[0138] 在標(biāo)準(zhǔn)程序中，下面各項在每種情況下測量10-秒時間： -收縮壓（SBP) -舒張壓（DBP) -平均動脈壓（MAP) -心率（HR) -活動（ACT)。
[0139] 在計算機控制下以5分鐘的間隔反復(fù)進行測量值采集。作為絕對值獲得的源數(shù) 據(jù)，在圖表中用當(dāng)前測量的氣壓表壓力（環(huán)境壓力參考監(jiān)控；APR-1)進行校正，并存儲為 單獨的數(shù)據(jù)。進一步的技術(shù)細節(jié)在制造公司（DSI)的廣泛文件中給出。
[0140] 除非另外指出，測試物質(zhì)在實驗當(dāng)天的9:00給藥。給藥之后，測量以上所述的參 數(shù)24小時。
[0141] 評價 實驗結(jié)束以后，使用分析軟件分選獲得的個體數(shù)據(jù)（Dataquest? A. R. T. Analysis)。作 為空白值設(shè)為在給藥前2小時的時間點，因此所選數(shù)據(jù)集合包括實驗當(dāng)天7:00到第二天 9:00的時間段。
[0142] 通過測定平均值（30分鐘平均值）將數(shù)據(jù)可預(yù)置時間進行平滑化（glaetten)，并 作為文本數(shù)據(jù)傳送至存儲介質(zhì)。以此方式將預(yù)先分選并壓縮的測量值傳送至Excel模板中 并制成表