一種油橄欖葉橄欖苦苷粗提取物制備羥基酪醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物和化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及油橄欖葉橄欖苦苷粗提取物制備羥基酪醇 的方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002]油橄欖（OleaeuropaeaL.)屬木庫(kù)科（Oleaceae)、木庫(kù)欖屬（Olea)常綠喬木，是 世界著名的木本油料樹種。橄欖油能大大降低心血管和肺癌的發(fā)病率，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì) 價(jià)值已被大家認(rèn)可。生物學(xué)家進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)橄欖葉含有的抗氧化活性成份較之橄欖油更為突 出，主要有橄欖苦苷、羥基酪醇、黃酮類、木酚素類、咖啡酰苯乙醇苷類等多酚類化合物。尤 其是羥基酪醇（Hydroxytyrosol，HT;化學(xué)名為3,4_二羥基苯乙醇），清除自由基的能力強(qiáng)， 表現(xiàn)出獨(dú)特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流等。而且還能抑制人類 早幼細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60、腺癌細(xì)胞HT29及HT29克隆體19A、女性乳腺癌MCF-7細(xì)胞等擴(kuò) 散，透過阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，具有很好的抗癌活性。
[0003] 天然羥基酪醇在橄欖葉中含量很低，僅有0.01-0. 8%，大多數(shù)以酯化物（橄欖苦 苷）的形式存在于油橄欖的各個(gè)部位。目前HT主要是從橄欖果、葉，以及在制備橄欖油 或餐用橄欖果過程中產(chǎn)生的殘?jiān)蛷U水中分離的，而廢水中橄欖苦苷、女貞苷、毛蕊花苷 等糖苷、黃酮苷及多酚類物質(zhì)成分復(fù)雜，分離效率低。以化學(xué)合成HT已有報(bào)道，Lucia和 Napolitano等在-25°C下，酪醇經(jīng)IBX氧化和硫代硫酸鈉還原得到HT，收率僅為30%;以3， 4-二羥基苯乙酸作為原料，以氫化鋁鋰，TMSCHNH/硼氫化鈉，四正丁基硼烷化胺/碘甲烷為 還原劑，收率都低于50%，而且原料和催化劑成本昂貴，反應(yīng)條件苛刻，無法工業(yè)化制備。
[0004] 橄欖苦苷（Oleuropein，0E)結(jié)構(gòu)為裂環(huán)烯醚類多酚化合物，極易受空氣、陽(yáng)光、 酸、堿、氧化劑、過渡金屬離子、長(zhǎng)時(shí)間高溫等因素的影響，發(fā)生氧化、縮合、螯合等反應(yīng)遭受 破壞，尤其是在酸、堿和酶的作用下易降解為HT和欖香酸，如下式所示。
[0005]
[0006] 油橄欖果及葉中OE含量高，尤其在葉中達(dá)到10~17%。因此利用油橄欖OE降解 制備天然HT是國(guó)內(nèi)外研宄熱點(diǎn)。W02008136037報(bào)道酸催化的降解方法需要硫酸催化劑， GhaythRigane對(duì)比了酸水解和堿水解橄欖枯餅"alperujo"中OE的化學(xué)處理工藝。意大 利研宄人員利用固定化的嗜高溫葡萄糖苷酶（pH= 7.0,60°C)降解0E，并從復(fù)雜的酶 解混合物中分離出未酶解的〇E、HT和欖香酸。該方法使用的酶價(jià)格昂貴，且反應(yīng)條件必須 是嗜高溫。所以進(jìn)行水解橄欖苦苷的方法研宄顯得尤為重要，本研宄關(guān)鍵在于各種水解方 法對(duì)橄欖苦苷作用的比較，同時(shí)最佳酶解效果和經(jīng)濟(jì)適用、條件溫和的酶系篩選以及降解 油橄欖葉橄欖苦苷制備羥基酪醇酶解工藝的優(yōu)化。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種油橄欖葉橄欖苦苷粗提取物制備羥基酪醇的方法，本 發(fā)明的技術(shù)方案是采用如下步驟來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 3. 1制備方法：
[0009] 酸水解工藝：粗提取物與酸水解液固液比為Ig: 10~100mL，加入為0.lmol/L~ lmol/LHCl溶液，置于30°C~100°C的恒溫水浴搖床中。水解Ih~IOh后，中和至中性，過 濾，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮干燥，得到羥基酪醇提取物；
[0010] 堿水解工藝：粗提取物與酸水解液固液比為Ig: 10~100mL，加入0?lmol/L~ lmol/LNaOH溶液，置于30°C~100°C的恒溫水浴搖床中。水解Ih~IOh后，中和至中性， 過濾，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮干燥，得到羥基酪醇提取物；
[0011] 生物酶法工藝：以橄欖苦苷降解率和羥基酪醇含量為綜合考察指標(biāo)，從中溫淀粉 酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、e-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧 酶、e-葡萄糖苷酶1〇種酶中篩選出降解橄欖苦苷制備羥基酪醇效果最好的半纖維素酶； 通過酶解單因素和正交優(yōu)化確定最佳工藝條件，制備羥基酪醇提取物。
[0012] 3. 2橄欖苦苷和羥基酪醇HPLC分析方法：稱取橄欖苦苷和羥基酪醇對(duì)照品配制成 混合溶液，以HPLC峰面積為縱坐標(biāo)y，橄欖苦苷和羥基酪醇質(zhì)量（yg)分別為橫坐標(biāo)X，繪 制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程。液相條件為：色譜柱為C180DS色譜柱（250X5mm，5ym)，柱溫 為30°C，甲醇：水=35 : 45(0. 2%磷酸）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量IOyL，紫外吸收波長(zhǎng)為280nm， 流速為lmL/min。經(jīng)計(jì)算得到橄欖苦苷在0. 441~7. 056yg內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，如 圖1(a)。并且在此范圍內(nèi)線性回歸方程為yi= 1772846. 78Xl+89802. 31，相關(guān)系數(shù)R21 = 0. 9997。羥基酪醇在0. 5586~8. 9376yg內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系圖I(b)，并且在此范圍 內(nèi)線性回歸方程為y2= 1199063. 90x2+119947. 13,相關(guān)系數(shù)R22= 0. 9996。液相分析橄欖 苦苷和羥基酪醇含量方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)分別為0. 92%和1. 38%，說明其分析方法 精密度較高，重復(fù)性好。
[0013] 3. 3羥基酪醇提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)，稱取羥基酪醇提取物溶于甲醇，通過0. 45ym有機(jī) 膜濾過，采用HPLC分析，制備的羥基酪醇提取物中羥基酪醇含量2~20%。
[0014] 酸水解和堿水解后的HT含量分別為7. 41%、4. 09%。與酶解最優(yōu)工藝得到的HT 含量6. 07%相比，鹽酸水解的效果略優(yōu)于酶水解，但NaOH水解OE的效果不好。
[0015] 3. 4酶的篩選：選取中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋 白酶、e-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、e-葡萄糖苷酶這1〇種酶。配制pH分別為3. 〇~ 7. 0的磷酸鹽緩沖液，稱取相同酶活力的各種酶，分別對(duì)0. 1~5g油橄欖葉提取物酶解，固 液比為Ig: 10~100mL，并在各種酶的最適溫度和pH下酶解2~10h。酶解結(jié)束后，90°C 滅酶10min，酶解液在5000r/min離心10min，過濾，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，然后進(jìn)行液相分 析橄欖苦苷和羥基酪醇含量。每次試驗(yàn)進(jìn)行3次，求其平均值。（0E降解率=1-酶解液OE 質(zhì)量/提取物OE質(zhì)量（38.6%) ;HT含量=酶解液HT質(zhì)量/提取物質(zhì)量。）以橄欖苦苷降 解率和羥基酪醇含量為綜合考察指標(biāo)，篩選出降解橄欖苦苷制備羥基酪醇效果最好的半纖 維素酶。
[0016] 3. 5單因素實(shí)驗(yàn)：取0. 1~5g的油橄欖葉提取物樣品置于IOOmL的錐形瓶，加入 10~IOOmL緩沖溶液和10~IOOmg半纖維素酶，在30~80°C下酶解。酶解2~IOh結(jié)束 后，90°C滅酶lOmin，酶解液在5000r/min離心lOmin，過濾，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，用HPLC 分析濾液中羥基酪醇和橄欖苦苷，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各含量。以橄欖苦苷降解率和羥基 酪醇含量為檢測(cè)指標(biāo)，研宄不同因素（溫度、PH、時(shí)間、加酶量）對(duì)半纖維素酶水解橄欖苦苷 效率的影響。每次試驗(yàn)進(jìn)行3次，求其平均值。
[0017] 3. 6正交實(shí)驗(yàn)：在篩選出降解橄欖苦苷制備羥基酪醇效果最好的一種酶的基礎(chǔ) 上，考察溫度、PH、時(shí)間、加酶量四個(gè)因不同素對(duì)半纖維素酶水解橄欖苦苷效率的影響。在 單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了考察各因素交互作用對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響及其影 響因素的主次，并得到最佳酶解條件，采用四因素三水平[L9(34)]正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以溫 度、pH、時(shí)間、加酶量4個(gè)獨(dú)立變量為考察因素，研宄目標(biāo)值與影響因素間的關(guān)系。
[0018] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以HT含量為指標(biāo)，選取了溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間和酶量進(jìn)行正 交實(shí)驗(yàn)。其結(jié)果見表1。
[0019] 表IL9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
[0020] TableIDesignandresultsofL9 (34)orthogonaltests
[0021]
[0022] 由表I中R可看出，對(duì)酶解工藝影響因素的大小順序?yàn)闇囟?gt;pH>時(shí)間>酶量， 最佳工藝為A2B3C3D1，即溫度60°C，pH= 5. 5,時(shí)間6h，酶量40mg。為了檢驗(yàn)所得優(yōu)化條件 的重復(fù)性和穩(wěn)定性，按照此優(yōu)化條件，進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，HT含量分別為6. 03%、6. 14%、 6. 12%、5. 98%、6. 07,平均值為6. 07%，RSD為1.08%，OE降解率為85. 28%，說明本工藝 相對(duì)穩(wěn)定可行。
[0023] 酸水解和堿水解后的HT含量分別為7. 41 %、4. 09%。與酶解最優(yōu)工藝得到的HT 含量6. 07%相比，鹽酸水解的效果略優(yōu)于酶水解，但NaOH水解OE的效果不好。
[0024] 本發(fā)明通過三種水解方法比較，鹽酸水解效果略優(yōu)于酶水解，但NaOH水解效果不 好。油橄欖葉提取物酶解工藝與其相比，方法條件較溫和，整個(gè)過程減少了酸、堿催化劑的 使用。
[0025] 本發(fā)明采用中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、 0 -葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、e-葡萄糖苷酶10種酶進(jìn)行篩選，以橄欖苦苷降解率和 羥基酪醇含量為指標(biāo)，通過HPLC檢測(cè)，篩選出降解橄欖苦苷制備羥基酪醇效果最好的半纖 維素酶。
[0026] 本發(fā)明在酶的篩選基礎(chǔ)上，以溫度、pH、時(shí)間、加酶量為考察因素，為了考察各因素 交互作用對(duì)油橄欖葉提取物酶解效率的影響及其影響因素的主次，并得到最佳酶解條件， 采用四因素三水平[L9(34)]正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，由表2中R可看出，對(duì)酶解工藝影響因素的 大小為溫度>pH>時(shí)間>酶量，可看出最佳工藝為A2B3C3D1,即溫度60°C，pH= 5. 5,酶量 40mg，時(shí)間6h。為了檢驗(yàn)所得優(yōu)化條件的重復(fù)性和穩(wěn)定性，按照此優(yōu)化條件，進(jìn)行5次重復(fù) 試驗(yàn)，HT含量分別為6. 03%、6. 14%、6. 12%、5. 98%、6. 07,平均值為6. 07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差（RSD)為1. 08%，OE降解率為85. 28%，說明本工藝相對(duì)穩(wěn)定可行。
[0027] 本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為：
[0028] 1.油橄欖葉橄欖苦苷粗提取物酶解工藝與酸水解、堿水解相比，方法條件較溫和， 整個(gè)過程減少了酸、堿催化劑的使用；
[0029] 2.通過比較可能斷裂糖苷鍵的各種生物酶對(duì)橄欖苦苷的降解效果和羥基酪醇的 含量，得出半纖維素酶降解油橄欖葉提取物制備羥基酪醇的效果最好；
[0030] 3.優(yōu)化半纖維素酶降解油橄欖葉粗提取物制備羥基酪醇的工藝，羥基酪醇含量可 得到6. 07%。 四、【附圖說明】
[0031] 附圖1羥基酪醇和橄欖苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0032] 附圖2酶的種類對(duì)油橄欖葉粗提取物酶解效率的影響
[0033] 附圖3酶解單因素對(duì)油橄欖粗提取物橄欖苦苷降解和羥基酪醇生成的影響；
[0034] 附圖4羥基酪醇和橄欖苦