一種具有生物活性的可生物降解水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水凝膠材料，特別涉及一種具有生物活性的可生物降解水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來神經(jīng)損傷的發(fā)病率逐年上升，但目前臨床上對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)仍不理想，對粗大、長段神經(jīng)缺損和多發(fā)性神經(jīng)損傷更是無計可施。人們一直都在探索并尋找能夠有效取代自體移植神經(jīng)的橋接物。
[0003]水凝膠因其獨特的結(jié)構(gòu)與特殊的性能使得其作為理想的支架材料越來越受到人們的重視，用于神經(jīng)組織工程的水凝膠，按照制備水凝膠的高聚物的種類不同，分為天然高分子水凝膠(如透明質(zhì)酸)，合成高分子水凝膠(如羥乙基甲基丙烯酸)，以及多肽自組裝水凝膠。
[0004]在神經(jīng)組織工程支架材料中，天然高分子水凝膠雖然生物相容性好，本身帶有一定的生物活性，可與細(xì)胞相互作用，但是其機(jī)械性能往往差強人意，且容易變異。而合成高分子水凝膠一般化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并且可以通過改變某些條件來調(diào)節(jié)和控制水凝膠的機(jī)械性能，以滿足使用要求，其最大缺點就是缺乏生物活性，不利于神經(jīng)細(xì)胞選擇性吸附和激活一些特異基因，因此需要將合成高分子水凝膠進(jìn)行生物活性修飾，基于神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)材料的仿生設(shè)計，利用材料的多組分復(fù)合技術(shù)，將一些具有生物活性的分子引入到合成高分子水凝膠的表面，以期改變合成高分子水凝膠對神經(jīng)細(xì)胞的選擇性吸附以及促神經(jīng)軸突生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種具有生物活性的可生物降解水凝膠及其制備方法，其表面修飾有生物活性基團(tuán)，具有生物相容性好、機(jī)械強度高的特點。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0007]提供一種具有生物活性的可生物降解水凝膠，它由以下方法制備得到:
[0008]I)合成超低分子量聚乳酸:將丙交酯放入硅烷化的玻璃聚合管中，再加入辛酸亞錫和一縮二乙二醇，其中丙交酯與辛酸亞錫、一縮二乙二醇的摩爾比為12?28:0.02:1，用旋片真空泵抽真空后封管，置于140°C油浴鍋中反應(yīng)24小時，制得超低分子量聚乳酸(PLA)；
[0009]2)制備聚(丙交酯-Co-環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸):將聚乙二醇(PEG)和步驟I)所得超低分子量聚乳酸加入三口燒瓶中，其中聚乙二醇與超低分子量聚乳酸質(zhì)量比為9:1，加入二氯甲烷為溶劑，然后置于_5°C的低溫恒溫反應(yīng)浴中，攪拌的同時對體系充氮，待攪拌均勻形成溶液后依次滴加三乙胺的二氯甲烷溶液和富馬酰氯的二氯甲烷溶液，溶液中聚乙二醇與所加入的三乙胺、富馬酰氯摩爾比為2:5:3，滴加完畢后于-5°C繼續(xù)反應(yīng)6小時，然后將三口燒瓶置于室溫下反應(yīng)12小時，反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)移除溶劑，將剩余物溶解在無水乙酸乙酯中，過濾除去沉淀，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分離出乙酸乙酯，剩余物質(zhì)采用乙醚沉淀，沉淀物后處理得到聚(丙交酯-Co-環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸)(PLEOF);
[0010]3)制備代巰基的Nogo-66:將2_巰基丙酸溶解于四氫呋喃中得到0.01?lg/mL的2-巰基丙酸溶液，加入二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，使2-巰基丙酸與二環(huán)己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺摩爾比為1:2.5:2.5，活化I?2小時后加入Nogo-66多肽和N，N- 二異丙基乙胺，其中2-巰基丙酸與Nogo-66多肽、N，N- 二異丙基乙胺的摩爾比為1:1.5:1.5，室溫下反應(yīng)2?6h后加入正己烷，沉淀物分離、干燥得到代巰基的Nogo-66 ;
[0011]4)制備具有生物活性的可生物降解水凝膠:將步驟2)所得聚(丙交酯-Co-環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸)、多肽交聯(lián)劑(Ac)2-KYIGSRG、末端含雙鍵的GIKAVAK-Ac多肽以及丙烯酸丙炔酯、甲叉雙丙烯酰胺(BISAM)、4，4’ -偶氮雙(4-氰基纈草酸)(ACP)和DMF置于反應(yīng)容器中，各組分質(zhì)量比為聚(丙交酯-Co-環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸):多肽交聯(lián)劑(Ac)2-KYIGSRG:GIKAVAK-Ac多肽:丙烯酸丙炔酯:甲叉雙丙烯酰胺:4，4’-偶氮雙(4-氰基纈草酸)=945:120:0.23:0.0144 ?0.0433:90 ?240:9.25，其中聚(丙交酯-co_ 環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸)濃度為0.315g/mL，將反應(yīng)裝置抽真空后密封反應(yīng)器，于80°C反應(yīng)10小時，反應(yīng)完成后加入步驟3)所得代巰基的Nogo-66，其中代巰基的Nogo-66與所述丙烯酸丙炔酯摩爾比為1:1，室溫反應(yīng)6?24小時得到凝膠，將所得凝膠浸泡在蒸餾水中，每隔2?12小時換一次水，2?5天后，將凝膠放在_20°C冰箱中凍冰處理12?24小時，然后真空冷凍干燥48小時，得到具有生物活性的可生物降解水凝膠。
[0012]按上述方案，步驟2)所述聚乙二醇數(shù)均分子量為4000。
[0013]按上述方案，步驟4)所述多肽交聯(lián)劑(Ac)2-KYIGSRG的制備方法為:
[0014]a.將Fmoc-Gly-wang樹脂浸泡于DMF(N, N-二甲基甲酰胺)中處理I小時，再用DMF充分洗滌，干燥后得到活化處理后的Fmoc-Gly-wang樹脂；
[0015]b.將步驟a活化處理后的Fmoc-Gly-wang樹脂與呢啶的DMF溶液混合，攪拌均勻后放入固相多肽合成儀中進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，反應(yīng)完成后用DMF充分洗滌得到脫保護(hù)的Fmoc-Gly-wang 樹脂；
[0016]c.將步驟b)所得脫保護(hù)的Fmoc-Gly-wang樹脂與含F(xiàn)moc-氨基酸Fmoc-Arg(Pbf) -OH的縮合反應(yīng)活化溶液混合，縮合反應(yīng)活化溶液中溶劑為PyBOP (六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基)、HOBt (1-羥基苯并三唑)、DIEA (N，N- 二異丙基乙胺)的混合液，攪拌10分鐘后移入固相多肽合成儀進(jìn)行縮合反應(yīng)，經(jīng)茚三酮顯色反應(yīng)檢測，F(xiàn)moc-氨基酸Fmoc-Arg (Pbf) -OH反應(yīng)完全后，反應(yīng)完成后產(chǎn)物用DMF洗滌；
[0017]d.將步驟c)所述洗滌后產(chǎn)物與含另一種Fmoc-氨基酸的縮合反應(yīng)活化溶液混合，重復(fù) c)操作，所述 Fmoc-氨基酸依次為 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Lys (Fmoc) -OH,最后與含丙稀酸的縮合反應(yīng)活化溶液混合進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到樹脂產(chǎn)物，所述縮合反應(yīng)活化溶液中溶劑為PyB0P、H0Bt、DIEA的混合液；
[0018]e.依次用DMF、二氯甲烷洗滌所得樹脂產(chǎn)物，將樹脂產(chǎn)物干燥后與切肽試劑混合，切肽試劑為三氟乙酸(TFA)、三異丙基硅烷(TIPS)和水的混合液，室溫下攪拌反應(yīng)2小時后抽濾，用三氟乙酸洗滌樹脂，收集濾液后將濾液逐滴滴入乙醚中，離心收集沉淀，冷凍干燥，得到(Ac)2-KYIGSRG。
[0019]按上述方案，步驟4)所述末端含雙鍵的GIKAVAK-Ac多肽的制備方法與多肽交聯(lián)劑(Ac)2-KYIGSRG的制備方法相似，縮合反應(yīng)過程中依次加入Fmoc-氨基酸Fmoc-1le-OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -OH,以及丙烯酸。
[0020]本發(fā)明還提供上述具有生物活性的可生物降解水凝膠的制備方法，其步驟如下:
[0021]I)合成超低分子量聚乳酸:將丙交酯放入硅烷化的玻璃聚合管中，再加入辛酸亞錫和一縮二乙二醇，其中丙交酯與辛酸亞錫、一縮二乙二醇的摩爾比為12?28:0.02:1，用旋片真空泵抽真空后封管，置于140°C油浴鍋中反應(yīng)24小時，制得超低分子量聚乳酸；
[0022]2)制備聚(丙交酯-Co-環(huán)氧乙烷-Co-富馬酸):將聚乙二醇和步驟I)所得超低分子量聚乳酸加入三口燒瓶中，其中聚乙二醇與超低分子量聚乳酸質(zhì)量比為9:1，加入二氯甲烷為溶劑，然后置于_5°C的低溫恒溫反應(yīng)浴中，攪拌的同時對體系充氮，待攪拌均勻形成溶液后依次滴加三乙胺的二氯甲烷溶液和富馬酰氯的二氯甲烷溶液，溶液中聚乙二醇與所加入的三乙胺、富馬酰氯摩爾比為2:5:3，滴加完畢后于-5°C繼續(xù)反應(yīng)6小時，然后將三口燒瓶置于室溫下反應(yīng)1