一種雙網(wǎng)絡(luò)聚(N-丙烯?；?L-α-氨基酸)/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙網(wǎng)絡(luò)聚(N-丙烯?；?L- α -氨基酸)/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，水凝膠越來越受重視，因?yàn)槠洳粌H具有與活體組織類似的多孔彈性水合網(wǎng)絡(luò)，還利于氧、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物在其中的傳輸，可為細(xì)胞粘附、增殖和分化提供理想的三維微環(huán)境。水凝膠已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研宄領(lǐng)域，如藥物或蛋白遞送、細(xì)胞遞送、生物粘合劑、組織工程、體外細(xì)胞三維培養(yǎng)等。其中，由天然高分子制備的水凝膠，如藻酸鹽、透明質(zhì)酸、殼聚糖、膠原、絲素蛋白等，具有良好的生物相容性、生物可降解性、細(xì)胞粘附性等性質(zhì)。制備水凝膠的交聯(lián)方法主要包括物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)兩種。物理交聯(lián)方法通常工藝簡單，但形成水凝膠強(qiáng)度不夠高，而化學(xué)交聯(lián)方法如光交聯(lián)、碳二亞胺法交聯(lián)、點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)等可賦予凝膠高的力學(xué)性能。然而，單一化學(xué)交聯(lián)方法制備的水凝膠無法滿足較高應(yīng)力環(huán)境下應(yīng)用的要求，如骨或軟骨組織等。為提高水凝膠的力學(xué)性能，新的技術(shù)手段不斷出現(xiàn)，如雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)水凝膠、互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠、納米復(fù)合凝膠和拓?fù)渌z等。
[0003]雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)水凝膠由兩種三維聚合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，可克服彼此缺點(diǎn)，具有良好的綜合性能，尤其是擁有較高的力學(xué)強(qiáng)度，近年受到越來越多的關(guān)注。如利用聚丙烯酸改性聚乙二醇形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)水凝膠，可使聚乙二醇水凝膠模量提高3.2倍[Waters DJ, etal.Structure and mechanism of strength enhancement in interpenetrating polymernetwork hydrogels.Macromolecules, 2011, 44:5776-5787];由聚甲基丙稀?；盘m糖膠和聚甲基丙烯酰胺化明膠制成的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠不僅具有高達(dá)6.9MPa的斷裂應(yīng)力，還可有效支持 NIH-3T3 纖維原細(xì)胞的生長[Shin H, et al.The mechanical properties andcytotoxicity of cell-laden double-network hydrogels based on photocrosslinkabIegelatin and gelIan gum b1macromolecules.B1materials, 2012, 33:3143-3152];再如，以中性寡聚(2，2-二甲基三亞甲基碳酸酯)-聚(乙二醇)_寡聚(2，2-二甲基三亞甲基碳酸酯)_ 二丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸為原料，經(jīng)兩步光化學(xué)交聯(lián)法制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠最大壓縮應(yīng)力高達(dá)8.38MPa，可有效支持豬軟骨細(xì)胞生長[Fan CJ, et al.A toughdouble network hydrogel for cartilage tissue engineering.Journal of MaterialsChemistry B，2013，1:4251-4258]。盡管這些水凝膠具有較高的力學(xué)性能和良好的生物相容性，但是它們無法滿足細(xì)胞三維培養(yǎng)結(jié)束時需要細(xì)胞/基質(zhì)快速分離的應(yīng)用環(huán)境。因此，開發(fā)能響應(yīng)刺激信號實(shí)現(xiàn)快速解離并具有良好力學(xué)性能和生物相容性的水凝膠，具有重要的研宄價值。
[0004]聚氨基酸(或稱為多肽)是一類具有良好生物相容性、酶特異性降解性和功能性的新型材料，其含有的功能性基團(tuán)如-NH2、-COOH賦予其獨(dú)特的生物學(xué)性能，如堿性聚賴氨酸荷正電對蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞膜就有很強(qiáng)的親和性、可刺激免疫球蛋白和干擾素 β 的合成、抑制腫瘤生長[Kuo YC, et al.Chondrogenesis in scaffolds withsurface modificat1n of elastin and poly-L-lysine.Colloids and SurfacesB:B1interfaces, 2012, 93:85-91];酸性聚氨基酸能誘導(dǎo)仿生礦化和骨細(xì)胞分化[AmosiN, et al.Acidic peptide hydrogel scaffolds enhance calcium phosphate mineralturnover into bone tissue.Acta B1materialia, 2012，8:2466-2475]。另一方面，由L- α -氨基酸丙烯?；苌锝?jīng)自由基聚合形成的聚(N-丙烯?；?L- α -氨基酸)，同樣具有聚氨基酸的諸多性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，然而這類材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研宄尚處于嬰兒期，在組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用極少。這類聚合物形成的水凝膠脆性和模量均較大，單獨(dú)使用有一定限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種雙網(wǎng)絡(luò)聚(N-丙烯?；?L- α -氨基酸)/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠及其制備方法。該方法制得的復(fù)合水凝膠的交聯(lián)網(wǎng)鏈中含有二硫鍵，具有快速的還原解離性質(zhì)；且該復(fù)合水凝膠的荷電狀態(tài)、模量、降解性能、微孔結(jié)構(gòu)等性質(zhì)可靈活調(diào)控，在組織工程、三維細(xì)胞培養(yǎng)、體外腫瘤模型等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種雙網(wǎng)絡(luò)聚(N-丙烯?；?L-α -氨基酸)/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0008]配制質(zhì)量百分濃度為I %?4%的酰肼化透明質(zhì)酸溶液，并將其pH值調(diào)至4?6.5 ;將N-丙烯酰基-L- α -氨基酸、N，N’ -雙丙烯?；鵢L_胱氨酸、水溶性光引發(fā)劑和多端羰基聚乙二醇溶于蒸餾水中配成混合物溶液；按體積比為1: (0.5?2)將混合物溶液加入酰肼化透明質(zhì)酸溶液中，混合均勻后置于模具中進(jìn)行紫外光輻照，即得到雙網(wǎng)絡(luò)聚(N-丙烯?；?L- α -氨基酸)/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠；其中混合物溶液中N-丙烯?；?L- α -氨基酸的質(zhì)量百分濃度為10%?30%，N-丙烯?；?L-α -氨基酸、N，N’ -雙丙烯?；?L-胱氨酸和水溶性光引發(fā)劑的摩爾比為100: (2.5?15): (0.1?0.8)，酰肼化透明質(zhì)酸中的酰肼基團(tuán)和多端羰基聚乙二醇中的端羰基團(tuán)的摩爾比為1: (0.2?I)。
[0009]所述的酰肼化透明質(zhì)酸是由分子量為20萬?500萬的透明質(zhì)酸經(jīng)碳二亞胺法接枝2，2’ - 二硫代二乙酰肼、3，3’ - 二硫代二丙酰肼或4，4’ - 二硫代二丁酰肼形成的，取代度為 10%?50%。
[0010]所述的酰肼化透明質(zhì)酸的合成方法如下:
[0011]將透明質(zhì)酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和含二硫鍵的二酰肼溶于蒸餾水中配成混合溶液，混合溶液中透明質(zhì)酸的質(zhì)量百分濃度為0.2?2%，且透明質(zhì)酸重復(fù)單元數(shù)、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、含二硫鍵的二酰肼的摩爾比為100: (12?55): (15?60): (96?660);將混合溶液的pH值調(diào)至4.5?5.5，室溫下攪拌反應(yīng)24?48小時，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系依次經(jīng)透析和冷凍干燥，得到酰肼化透明質(zhì)酸。
[0012]所述的N-丙烯?；?L- α -氨基酸為N-丙烯酰基_L_谷氨酸、N-丙烯酰基_L_天冬氨酸、Νε -丙烯酰基-L-賴氨酸、NS-丙烯酰基-L-鳥氨酸、N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸或N-丙烯?；?L-纈氨酸。
[0013]所述的N-丙烯?；?L- α -氨基酸的合成方法如下:
[0014]將L- α -氨基酸(其中L-賴氨酸和L-鳥氨酸為其銅絡(luò)合物形式)溶于水中形成質(zhì)量百分濃度為5%?20%的L-α -氨基酸水溶液，將其置于冰水浴中攪拌冷卻，然后在0.5?2小時內(nèi)滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加過程中維持體系pH在8?9.5之間，其中滴加的氯仿溶液的體積為L-α -氨基酸水溶液體積的10%?25%，丙烯酰氯與L-α -氨基酸的摩爾比為(1.2?2):1 ;滴加完畢后在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時，隨后向反應(yīng)體系中加入8?12倍體積的沉淀劑(采用銅絡(luò)合物時需先用L- α -氨基酸摩爾數(shù)1.5倍的8_羥基喹啉除銅)，沉淀劑為乙醇、甲醇、丙酮或四氫呋喃，然后收集沉淀物并真空干燥，得到N-丙稀?；鵢L_ α -氨基酸。
[0015]所述的N，N’ -雙丙烯?；?L-胱氨酸的合成方法如下:
[0016]將L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成濃度為0.05g/mL?0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH與L-胱氨酸的摩爾比為2:1 ;然后對L-胱氨酸溶液進(jìn)行冰浴冷卻，再向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩爾比為(2.1?2.3):1，滴加過程中維持體系PH = 8.0，滴加完成后將溫度升至室溫并維持I?4小時，再在零下20°C進(jìn)行冷凍干燥；將冷凍干燥得到的物質(zhì)溶于pH = 2的水中，得到質(zhì)量百分濃度為5%?20%的溶液，然后用6?12倍體積量的丙酮沉淀，所得固體經(jīng)真空干燥即得到N