混合底棲硅藻溶液中純種硅藻的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種純種底棲硅藻的分離方法，特別是混合底棲硅藻溶液中純種底棲硅藻的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]底棲硅藻是育苗生產(chǎn)中鮑苗的開(kāi)口餌料。鮑魚(yú)育苗生產(chǎn)中使用的底棲硅藻基本來(lái)源于自然海區(qū)，或者從海區(qū)藻類葉片上收集混合藻種，或者在海區(qū)掛板收集藻種，然后再到室內(nèi)擴(kuò)繁，但一般對(duì)藻種不進(jìn)行選擇，到達(dá)一定密度后，直接用于育苗生產(chǎn)，但這樣獲得的底棲硅藻，品質(zhì)不能得到保證，對(duì)鮑魚(yú)苗種生產(chǎn)的效果也不能保證。因?yàn)榛旌显宸N中底棲硅藻種類繁多，底棲硅藻的種類和各種底棲硅藻的含量比例不能控制，而不同種類底棲硅藻，其體內(nèi)不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分的含量差異很大，底棲硅藻的品質(zhì)對(duì)鮑苗生產(chǎn)的影響也很大。所以，從混合藻種中篩選分離優(yōu)質(zhì)底棲硅藻純種對(duì)鮑苗生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。
[0003]從混合底棲硅藻中分離單種有幾種方法，I)微吸管分離法；2)樣品系列稀釋分離法；3)水滴分離法；4)平板分離法。不管是哪一種方法，對(duì)于優(yōu)勢(shì)種或個(gè)體較大的種類，分離較容易。對(duì)于非優(yōu)勢(shì)種尤其是非優(yōu)勢(shì)種中個(gè)體較小的種類，分離非常困難。即使是運(yùn)氣好分離到非優(yōu)勢(shì)種中個(gè)體較小的單種，制成純種也不容易。因?yàn)榉莾?yōu)勢(shì)小個(gè)體單種底棲硅藻的繁殖往往較慢，某些菌類在藻類培養(yǎng)基內(nèi)(或上)可迅速繁殖，淹沒(méi)非優(yōu)勢(shì)的單胞藻單種，使純種難以獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種在混合底棲硅藻溶液中分離純種底棲硅藻的方法，它能夠較容易地從混合藻液中分離出各個(gè)類別的底棲硅藻純種，尤其是分離出非優(yōu)勢(shì)的底棲硅藻純種，為鮑魚(yú)育苗生產(chǎn)中篩選底棲硅藻良種提供技術(shù)支撐。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種混合底棲硅藻溶液中純種硅藻的分離方法，其特征在于:按照以下步驟進(jìn)行:
首先將濃度為0.05-0.15g/ml的混合底棲硅藻溶液中75 μm以上的顆粒碎肩濾除，然后將混合底棲硅藻溶液分為三等份，分別放入離心管中，將第一支離心管中混合底棲硅藻溶液搖勻，在350-450g RCF的條件下離心處理4_5min，得到沉淀A和第一上清液；
對(duì)第一上清液在850-950g RCF的條件下離心處理4_5min，得到沉淀B ；
將第二支離心管中的混合底棲硅藻溶液搖勻，在850-950g RCF的條件下離心處理
4-5min得到第二上清液，并對(duì)第二上清液在1650_1750g RCF的條件下離心處理4_5min，得到沉淀C ;
將第三支離心管中的混合底棲硅藻溶液搖勻，在1650-1750g RCF的條件下離心處理
4-5min得到第三上清液，并對(duì)第三上清液在2650_2750g RCF的條件下離心處理4_5min，得到沉淀D ; 取0.05-0.2g沉淀A、全部的沉淀B、全部的沉淀C和全部的沉淀D，分別用20_40ml的無(wú)菌海水稀釋混勻，分別得到沉淀A海水溶液、沉淀B海水溶液、沉淀C海水溶液和沉淀D海水溶液；
將沉淀A海水溶液在350-450g RCF的條件下離心處理5_6min，得到沉淀A1，對(duì)得到的沉淀A1進(jìn)行第一離心處理7次，得到沉淀A 2，所述的第一離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在350-450g RCF的條件下離心處理5_6min，獲取沉淀；
將沉淀B海水溶液在850-950g RCF的條件下離心處理5_6min，得到沉淀B1，對(duì)得到的沉淀B1進(jìn)行第二離心處理7次，得到沉淀B2，所述的第二離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在850-950g RCF的條件下離心處理5_6min ；將沉淀C海水溶液在1650-1750g RCF的條件下離心處理5_6min，得到沉淀C1，對(duì)得到的沉淀C1進(jìn)行第三離心處理7次，得到沉淀C2，所述的第三離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在1650-1750g RCF的條件下離心處理5_6min，獲取沉淀；
將沉淀D無(wú)菌海水溶液在2650-2750g RCF的條件下離心處理5_6min，得到沉淀D1，對(duì)得到的沉淀D1進(jìn)行第四離心處理7次，得到沉淀D2，所述的第四離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在2650-2750g RCF的條件下離心處理
5-6min，獲取沉淀；
將得到的沉淀A2、沉淀B2、沉淀C2和沉淀D 2以無(wú)菌操作法分別轉(zhuǎn)移到適量無(wú)菌海水中，形成A2、B2、CjP D2的海水母液，再按照海水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定時(shí)倍比稀釋的方法用無(wú)菌海水進(jìn)行梯度稀釋，獲得沉淀A2、B2, CjPD2海水母液的ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ4各濃度梯度藻液；
用平板分離法[1]培養(yǎng)A2、B2, CjP D 2各濃度梯度藻液中底棲硅藻，顯微鏡下觀察并收集平板上無(wú)細(xì)菌和其它單胞藻污染的藻落，即可獲得各種底棲硅藻純種。
[0006]一種混合底棲硅藻溶液中純種硅藻的分離方法，其特征在于:按照以下步驟進(jìn)行:
首先將濃度為0.lg/ml的混合底棲硅藻溶液中75 μm以上的顆粒碎肩濾除，然后將混合底棲硅藻溶液分為三等份，分別放入離心管中，將第一支離心管中混合底棲硅藻溶液搖勻，在400g RCF的條件下離心處理4min，得到沉淀A和第一上清液；
對(duì)第一上清液在900g RCF的條件下離心處理4min，得到沉淀B ；
將第二支離心管中的混合底棲硅藻溶液搖勻，在900g RCF的條件下離心處理4min得到第二上清液，并對(duì)第二上清液在1700g RCF的條件下離心處理4min，得到沉淀C ；
將第三支離心管中的混合底棲硅藻溶液搖勻，在1700g RCF的條件下離心處理4min得到第三上清液，并對(duì)第三上清液在2700g RCF的條件下離心處理4min，得到沉淀D ；
取0.1g沉淀A、全部的沉淀B、全部的沉淀C和全部的沉淀D，分別用30ml的無(wú)菌海水稀釋混勻，分別得到沉淀A海水溶液、沉淀B海水溶液、沉淀C海水溶液和沉淀D海水溶液；將沉淀A海水溶液在400g RCF的條件下離心處理6min，得到沉淀A1，對(duì)得到的沉淀A1進(jìn)行第一離心處理7次，得到沉淀A2，所述的第一離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在400g RCF的條件下離心處理6min，獲取沉淀； 將沉淀B海水溶液在900g RCF的條件下離心處理6min，得到沉淀B1，對(duì)得到的沉淀B1進(jìn)行第二離心處理7次，得到沉淀B2，所述的第二離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在900g RCF的條件下離心處理6min ；
將沉淀C海水溶液在1700g RCF的條件下離心處理6min，得到沉淀C1，對(duì)得到的沉淀C1進(jìn)行第三離心處理7次，得到沉淀C2，所述的第三離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在1700g RCF的條件下離心處理6min，獲取沉淀；將沉淀D無(wú)菌海水溶液在2700g RCF的條件下離心處理6min，得到沉淀D1，對(duì)得到的沉淀D1進(jìn)行第四離心處理7次，得到沉淀D 2，所述的第四離心處理為將沉淀用適量無(wú)菌海水稀釋混勻，并對(duì)得到的該沉淀的海水溶液在2700g RCF的條件下離心處理6min，獲取沉淀；將得到的沉淀A2、沉淀B2、沉淀C2和沉淀D 2以無(wú)菌操作法分別轉(zhuǎn)移到適量無(wú)菌海水中，形成A2、B2、CjP D2的海水母液，再按照海水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定時(shí)倍比稀釋的方法用無(wú)菌海水進(jìn)行梯度稀釋，獲得沉淀A2、B2, CjPD2海水母液的ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ4各濃度梯度藻液；
用平板分離法[1]培養(yǎng)A2、B2, CjP D 2各濃度梯度藻液中底棲硅藻，顯微鏡下觀察并收集平板上無(wú)細(xì)菌和其它單胞藻污染的藻落，即可獲得各種底棲硅藻純種。
[0007]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明所公開(kāi)的從混合底棲硅藻溶液中分離純種硅藻的方法，能夠一次性獲取混合底棲硅藻中幾乎所有可培養(yǎng)藻種的純種，并