食源性致病菌五重?zé)晒鈖cr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及食源性致病菌五重?zé)晒釶CR檢測試劑盒和檢測方 法。 技術(shù)背景
[0002] 民以食為天，食以安為先。食品安全與人們的生活息息相關(guān)，食品安全沒有保障， 不僅會影響人類的健康與生存，而且還會嚴(yán)重影響社會與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。2000年世界衛(wèi)生大 會通過了《食品安全決議》，制定了全球食品安全戰(zhàn)略，將食品安全列為公共衛(wèi)生的優(yōu)先領(lǐng) 域。但是食品安全事件時有發(fā)生，特別是近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件在世 界范圍內(nèi)大多數(shù)國家的發(fā)生率顯著上升，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。引起食源性疾 病的金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌等致病菌，很容 易通過直接或間接對食物進(jìn)行污染，導(dǎo)致中毒事件頻發(fā)。如2009年1月美國的鼠傷寒沙門 菌花生醬污染事件，波及43個州，致3人死亡?？焖佟?zhǔn)確地檢測和鑒定食源性致病菌是 有效地控制與預(yù)防食源性疾病爆發(fā)的前提條件。但是有關(guān)食源性致病菌快速檢測技術(shù)平臺 在我國還比較薄弱，加強食源性致病菌快速檢測技術(shù)平臺的建設(shè)具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會意 義。
[0003] 目前食源性致病菌檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"還是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，但其檢測周期長、 檢測程序繁瑣，不能達(dá)到快速檢測的目的。實時熒光PCR技術(shù)是1996年由美國ABI公司 推出的一種新型檢測技術(shù)，由于實時熒光PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、簡便快速等 優(yōu)點，在食源性致病菌檢測方面已取得了豐碩的成果。但是目前運用于食源性致病菌檢測 的實時熒光PCR檢測試劑盒大部分是基于Taqman探針技術(shù)開發(fā)的，不但檢測成本高，而 且進(jìn)行多重檢測時對實時熒光PCR儀的通道數(shù)量有一定的要求。熔解曲線（resolution melting)技術(shù)是不同于探針技術(shù)的又一種實時熒光PCR檢測技術(shù)，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加 入熒光染料，當(dāng)熒光染料與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號 急劇減弱，如果升高溫度使DNA變性，以溫度為橫坐標(biāo)對熒光信號作圖，可得到熔解曲線。 把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為融點溫度（melting temperature, Tm)。如果擴(kuò)增產(chǎn)物 長度不同、其GC比值不同，進(jìn)行溶解分析時就會有其獨特的熔解曲線，并且熔解曲線性質(zhì)、 位置和Tm值都是不同的。如果不同病原菌擴(kuò)增產(chǎn)物長度不同、其GC比值不同，進(jìn)行熔解分 析時就會有其獨特的熔解曲線。由于早期使用的熒光染料SYBR Green I為不飽和染料，穩(wěn) 定性差而且存在著染料重分布問題，從而限制了熔解曲線技術(shù)的應(yīng)用。隨著飽和熒光染料 LC Green和Eva Green的發(fā)明，解決了不飽和染料穩(wěn)定性差而且存在著染料重分布的問題， 基于熔解曲線技術(shù)的多重?zé)晒釶CR已經(jīng)在檢驗檢測領(lǐng)域顯示出了巨大的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種基于熔解曲線技術(shù)的食源性致病菌五重實時熒光PCR 檢測試劑盒，通過一次反應(yīng)快速、經(jīng)濟(jì)和可靠的完成金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門 氏菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌等五種食源性致病菌的檢測。
[0005] 本發(fā)明基于熔解曲線技術(shù)，以金黃色葡萄球菌的nuc基因、單增李斯特菌的hlyA 基因、沙門氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志賀氏菌的ipaH基因為靶基因。
[0006] 食源性致病菌五重實時熒光PCR檢測試劑盒包括五對特異性引物、EvaGreen PCR 預(yù)混液、超純水和陽性對照，其中EvaGreen PCR預(yù)混液包括PCR緩沖液、dNTP混合物、DNA 聚合酶和飽和熒光染料EvaGreen，陽性對照為金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、 副溶血性弧菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取液。超純水可同時作為陰性對照。
[0007] 所述五對特異性引物的序列如下： nuc 上游引物：5' -AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3' nuc 下游引物：5' -CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3' hlyA 上游引物：5' -AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA 下游引物：5' -TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3' invA 上游引物：5' -CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA 下游引物：5' -GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3' tlh 上游引物：5' -CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3' tlh 下游引物：5' -CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3' ipaH 上游引物：5' -GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH 下游引物：5' -TTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG-3'。
[0008] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的設(shè)計，染料類實時熒光PCR能用于多重檢測是因為 如果不同的擴(kuò)增產(chǎn)物長度不同、其GC比值不同，進(jìn)行溶解曲線分析時就會有其獨特的溶解 曲線，并且溶解曲線性質(zhì)、位置和Tm值都是不同的。因此引物設(shè)計時不但要采用blast分 析保證引物的特異性，還要考慮擴(kuò)增產(chǎn)物的長度和GC比值，保證進(jìn)行溶解曲線分析時不同 的靶基因的能產(chǎn)生具有不同Tm值的溶解曲線。除引物外本發(fā)明所需其他試劑，如EvaGreen PCR預(yù)混液，包括PCR緩沖液、dNTP混合物、DNA聚合酶和飽和熒光染料EvaGreen，EvaGreen PCR預(yù)混液可購買商品化的EvaGreen PCR預(yù)混液，也可自行配制，本發(fā)明中使用商品化的 Bio-Rad SsoFast EvaGreen預(yù)混液；陽性對照為金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏 菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取液；超純水可同時作為陰性對照。
[0009] 本發(fā)明還涉及五種食源性致病菌五重實時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟： (1) 提取待測樣品DNA ; (2) 取特異性引物和EvaGreen PCR預(yù)混液，分別加入陰性對照、陽性對照或待測樣品 DNA形成擴(kuò)增反應(yīng)體系； 所述步驟（2)的優(yōu)選擴(kuò)增體系見表1。
【主權(quán)項】
1. 一種食源性致病菌五重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括五對特異 性引物、EvaGreenPCR預(yù)混液、陽性對照和超純水，其中EvaGreenPCR預(yù)混液包括PCR緩 沖液、dNTP混合物、DNA聚合酶和飽和熒光染料EvaGreen，陽性對照為金黃色葡萄球菌、單 增李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取液，所述五對特異性引 物序列如下： nuc上游引物：5'-AACAAGATCGCTATGGTAGAACAITGGC-3'nuc下游引物：5'-CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTITTCCACTA-3' hlyA上游引物：5'-AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA下游引物：5'-TTACCGITCTCCACCAITCCCAAG-3' invA上游引物：5'-CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA下游引物：5'-GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3' tlh上游引物：5'-CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3' tlh下游引物：5'-CGGGTTAGGGAAGCGCCAIT-3' ipaH上游引物：5'-GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH下游引物：5'-ITTACGGACTGGITCTCCCTCTGG-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食源性致病菌五重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，其特征在于，超 純水同時作為陰性對照。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種食源性致病菌五重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，主要包括五對特異性引物、EvaGreen PCR預(yù)混液、超純水和陽性對照，特異性引物包括金黃色葡萄球菌的nuc基因、單增李斯特菌的hlyA基因、沙門氏菌的invA基因、副溶血性弧菌的tlh基因和志賀氏菌的ipaH基因的特異性引物。本發(fā)明所述試劑盒檢測周期短、檢測成本低、檢測結(jié)果可靠。
【IPC分類】C12R1-42, C12Q1-68, C12Q1-04, C12Q1-14, C12R1-445, C12R1-63, C12Q1-10, C12R1-01
【公開號】CN104726594
【申請?zhí)枴緾N201510139899
【發(fā)明人】何培彥, 陳中文, 羅建勇, 王恒輝, 燕勇
【申請人】嘉興市疾病預(yù)防控制中心
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月27日