一種檢測牛MYF5基因mRNA表達水平的特異性引物和熒光定量檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測牛MYF5基因 mRNA表達水平的 特異性引物和熒光定量PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最 常用的技術(shù)。PCR技術(shù)將模板DNA、特異性引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放 在同一個緩沖反應(yīng)體系中，進行反復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實現(xiàn)靶DNA 片段在反應(yīng)液中呈2n倍擴增(其中η為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了實時熒光檢測技術(shù)和計算 機分析技術(shù)。熒光定量PCR在普通PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒光標(biāo)記物質(zhì)，通過檢測每 個熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來實時監(jiān)測DNA的擴增情況，并獲得每個 樣本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應(yīng)管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環(huán)數(shù)）； 同時，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下檢測2-10個倍數(shù)稀釋的已知數(shù)量的靶標(biāo)DNA，獲得 其Ct值，以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和 各個標(biāo)本的Ct值對每個反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進行定量測定。
[0004] 雖然Northern blot技術(shù)可檢測基因的mRNA表達水平，但整個實驗過程操作比較 復(fù)雜。Northern blot實驗中一個主要的問題是存在RNA的降解，所以Northern Blot中 所有的實驗用品都需要經(jīng)過除去RNA酶的過程，如高溫烘烤、DEPC處理等。另外，Northern Blot中很多實驗用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對人體都有一定的傷害。基因芯片實驗 雖然降低了實驗人員的工作量，并可以在一次實驗中同時檢測幾千個基因表達量變化，但 是其靈敏度較低。
[0005] 而SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其 熒光大大增強。該性質(zhì)用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBR Green的最大吸收波長約為 497 nm，發(fā)射波長最大約為520 nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā) 射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0006] SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié) 合，不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于 一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引 起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn) 物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結(jié)果。 [0007] 生肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic Regulatory Factors，MRFs)基因家族控制著動物肌細 胞的增殖和分化，并與肌纖維的數(shù)量和大小密切相關(guān)，MyoD基因家族可編碼4種不同的轉(zhuǎn) 錄因子，分別為Myf5、Myogenin、MyoD (Myf3)、MRF4 (Myf6)，它們各自或協(xié)同控制著肌肉生 成方面的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在肌肉發(fā)生的決定時期，缺少MYF5基因的表達會使肌原細胞不能 正常的發(fā)育。更為重要的是，MYF5可能對動物的肉質(zhì)和風(fēng)味有著非常重要的影響，因此，檢 測動物MYF5基因的表達水平，不僅可以很好的監(jiān)測動物肌肉的生長發(fā)育狀態(tài)，檢測該基因 在肌肉發(fā)育過程中的表達狀況，同時也可能對動物的肉質(zhì)有一定的鑒定作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種檢測MYF5基因 mRNA表達水平的特異性引物和熒光定量PCR檢 測試劑盒。通過大量的實驗研宄，我們優(yōu)化出了一套能夠有效檢測不同牛種(包括奶牛、黃 牛和牦牛)MYF5基因 mRNA表達量的引物和PCR反應(yīng)的條件，并組裝成MYF5基因 mRNA表達 檢測熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，以滿足生命科學(xué)、動物醫(yī)學(xué)和動物科學(xué)研宄者的檢 測需要。
[0009] 本發(fā)明提供一種檢測牛MYF5基因 mRNA表達水平的特異性引物，所述特異性引物 的核苷酸序列為： 上游引物序列為：5' -CCTGAATGTAACAGCCCTAT-3' ； 下游引物序列為：5' -TGATCCGATCCACTATGC-3'。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種牛MYF5基因 mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測 試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物，所述特異性引物序列為： 上游引物序列為：5' -CCTGAATGTAACAGCCCTAT-3' ； 下游引物序列為：5' -TGATCCGATCCACTATGC-3'。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SYBR Green染料。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0013] 優(yōu)選地，所述陽性對照的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 3。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測cDNA為模板，利用 權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進行實時熒光定量PCR，記錄Ct值，并以 MYF5標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽性對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進行定量測定。
[0015] 優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C 5秒， 57. 8°C 20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0016] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種牛MYF5基因 mRNA表達水平的定量檢測方法，是 以待測cDNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進行實時熒光 定量PCR，記錄Ct值，并以MYF5標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽性對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值進行定量測定。
[0017] 優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C 5秒， 57. 8°C 20秒，捕捉焚光信號，循環(huán)40次。
[0018] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述特異性引物、試劑盒、序列表中SEQ ID No. 3所述 的核苷酸序列在定量檢測牛MYF5基因 mRNA表達水平中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述牛為黃牛、奶 牛和牦牛。
[0019] 與現(xiàn)有最好技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1.本發(fā)明實現(xiàn)了方便快捷的定量檢測不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)肌肉生成因子 5 (Myogenic factor 5，MYF5)基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的目的。本發(fā)明可以監(jiān)測不同牛種(包 括奶牛、黃牛和牦牛)、不同組織、不同時期的MYF5基因的mRNA表達狀態(tài)，檢測該基因在肌 肉發(fā)育過程中的表達狀況，同時可以鑒定與肌肉生長阻滯相關(guān)的疾病。
[0020] 2.本發(fā)明在檢測基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗成本低的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0021] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為MYF5基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的熒光檢測結(jié)果圖。其中，A :擴增曲線，橫坐標(biāo)為PCR 循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU);B:恪解曲線，橫 坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為單位溫度下相對熒光值的變化量。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0023] 其中，SYBR Green染料購自寶生物工程(大連）有限公司。
[0024] 實施例1 本發(fā)明的MYF5基因 mRNA表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒由以下組分組成： 2XSYBR GREEN MIX 5mL ； 陽性對照：標(biāo)準(zhǔn)MYF5基因模板 500 μ L ; 引物混合液 500 yL; 超純水 5mL。
[0025] 其中，2X SYBR GREEN MIX 由以下組分組成：Taq DNA 聚合酶 0· I U/μ UdNTPs 底 物 0· 4 mmol /1,、Mg2+ 5. 0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、ρΗ8· 3 的 Tris · HCl 20 mmol/L、質(zhì)量 百分含量為〇. 02%的明膠和SYBR Green染料。
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