026] 引物混合液：上游引物8 ymol/L、下游引物8 ymol/L。其中， 上游引物的序列為：5' -CCTGAATGTAACAGCCCTAT -3' ； 下游引物的序列為：5' -TGATCCGATCCACTATGC-3'。
[0027] 標(biāo)準(zhǔn)MYF5基因模板：濃度為0. 8 μ mol/L，MYF5基因模板序列為 5' -CCTGAATGTAACAGCCCTATCTGGTCCAGAAAGAGCAGCAGTTTTGACAGCGTCTACTGTCCTGATGTAC CAAATGTATATGCCACGGATAAAAGCTCCTTATCCAGCTTGGATTGCTTATCCAGCATAGTGGATCGGATCA-3'。
[0028] 超純水：純度超過18. 25 ΜΩ · CM。
[0029] 應(yīng)用本發(fā)明的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)牛MYF5基因 mRNA表達(dá)水平的步 驟如下： (1)按比例配制MYF5熒光定量PCR反應(yīng)液，20 μ L反應(yīng)體系如下表：
在同一次定量反應(yīng)中應(yīng)同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
[0030] 其中，陰性對(duì)照為超純水；陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)MYF5基因模板。
[0031] (2)取 2XSYBR GREEN MIX 1000 μ L、引物混合液 100 μ L、超純水 800 μ L 充分 混勻，配制1900 μ L的FQ-PCR反應(yīng)預(yù)混液； (3) 充分混勻以上各種液體，將預(yù)混液按19 μ L/管分裝成100小管，加至熒光定量專用 PCR反應(yīng)管或者反應(yīng)板中； (4) 配制以 10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀釋度的標(biāo)準(zhǔn) MYF5基因模板5管，每管10 μ L ; (5) FQ-PCR擴(kuò)增：在每個(gè)裝有19 μ L PCR反應(yīng)預(yù)混液的反應(yīng)管中分別加入1 μ L待測(cè) cDNA，超純水(陰性對(duì)照)或標(biāo)準(zhǔn)MYF5基因模板(陽(yáng)性對(duì)照)，震蕩混勾，瞬時(shí)離心后上機(jī)到熒 光定量PCR儀（Bio-Rad CFX96TM)中，95°C下預(yù)變性30秒，然后按95°C 5秒，57. 8°C 20秒 熱循環(huán)40次，并在57. 8°C時(shí)檢測(cè)記錄熒光信號(hào)，根據(jù)該熒光信號(hào)制作熔解曲線。PCR擴(kuò)增 曲線參見圖1A，圖IA表明MYF5基因熒光信號(hào)值符合標(biāo)準(zhǔn)的"S"型曲線，熔解曲線（圖1B) 表明該熒光定量具有高度的檢測(cè)專一性。因此，本發(fā)明可以準(zhǔn)確的測(cè)定MYF5的表達(dá)水平， 并具有高度的特異性，效果很理想，與設(shè)計(jì)的預(yù)期完全一致。
[0032] 其中，待測(cè)cDNA的制備方法如下： a、RNA提取過程：采集牛種(黃牛、奶牛或牦牛)的組織，將IOOmg組織在液氮中磨碎，加 入ImL TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理；將勻漿樣品在室溫（15-30°C)放置5分鐘，使核酸 蛋白復(fù)合物完全分離；加入〇. 2 mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘；4°C 1000 OXg 離心15分鐘(樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層);把水相轉(zhuǎn) 移到新管中；加入0. 5 mL異丙醇沉淀水相中的RNA，室溫放置10分鐘；4°C 10000 X g離心 10分鐘，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀；移去上清，使用ImL 75 %乙醇洗滌RNA沉淀； 4°C 7000 X g離心5分鐘，棄上清；室溫放置干燥RNA沉淀；加入25-200 μ 1無 RNase的水 用槍頭吸打幾次，58°C放置10分鐘使RNA溶解，此時(shí)得到牛種的RNA溶液。
[0033] b、反轉(zhuǎn)錄過程，即獲得cDNA的過程：在PCR管中加入50 μ mol/L oligo dT溶液 1.5 yL，10 mmol/L dNTP 混合液 I yL，?？?RNA 2.5 yL，RNase free dH20 5 yL，混勻，于 65 °C下放置5分鐘后，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻。在上述PCR管中繼續(xù)加入5XPrime Script? 緩沖液 4 μ L，40 U/μ L RNA 酶抑制劑 0.5 μ L，200 U/μ L Prime Script?反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L， RNase free dH20 4.5 yL，混勻，于 30 °C 10 min，42 °C 60 min，70 °C 15 min 條件下處 理。
[0034] (6)PCR反應(yīng)結(jié)束后，讀取各個(gè)反應(yīng)的Ct值用以定量分析：以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為 橫坐標(biāo)，以陽(yáng)性對(duì)照的Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和各個(gè)標(biāo)本的Ct值對(duì)每 個(gè)反應(yīng)的起始模板數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。同時(shí)于3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳，溴乙錠染 色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察，灰度掃描分析記錄各PCR反應(yīng)的結(jié)果。以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小， 從而進(jìn)一步確定擴(kuò)增的是否是目的基因。
[0035] 由于本發(fā)明在設(shè)計(jì)MYF5基因熒光定量引物時(shí)，所選擇的基因片段在奶牛、黃牛、 牦牛中完全同源，所以使用本發(fā)明的特異性引物以及采用本發(fā)明的方法能夠有效擴(kuò)增來源 于這些物種的MYF5基因，從而檢測(cè)各個(gè)牛種的MYF5基因的mRNA表達(dá)量。
[0036] 最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)牛MYF5基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物，其特征在于：所述特異性引物 的核苷酸序列為： 上游引物序列為：5' -CCTGAATGTAACAGCCCTAT-3' ； 下游引物序列為：5' -TGATCCGATCCACTATGC-3'。2. -種牛MYF5基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試 劑盒包括特異性引物，所述特異性引物序列為： 上游引物序列為：5' -CCTGAATGTAACAGCCCTAT-3' ； 下游引物序列為：5' -TGATCCGATCCACTATGC-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括SYBRGreen染料。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰 性對(duì)照。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述陽(yáng)性對(duì)照的核苷酸序列參見序列 表中SEQIDNo. 3。6. 權(quán)利要求2-5任一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于：是以待測(cè)cDNA為模板， 利用權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBRGreen染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct值， 并以MYF5標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量測(cè)定。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的使用方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件 是：95°C預(yù)變性30秒；95°C5秒，57. 8°C20秒，捕捉熒光信號(hào)，循環(huán)40次。8. -種牛MYF5基因mRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)方法，其特征在于：是以待測(cè)cDNA為模 板，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBRGreen染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct 值，并以MYF5標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量測(cè)定。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件 是：95°C預(yù)變性30秒；95°C5秒，57. 8°C20秒，捕捉熒光信號(hào)，循環(huán)40次。10. 權(quán)利要求1所述的特異性引物、權(quán)利要求2-5任一所述的試劑盒、序列表中SEQID No. 3所述的核苷酸序列在定量檢測(cè)牛MYF5基因mRNA表達(dá)水平中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述牛 為黃牛、奶牛和牦牛。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)牛MYF5基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物，其特征在于：所述特異性引物的核苷酸序列為：上游引物序列為：5’-CCTGAATGTAACAGCCCTAT-3’；下游引物序列為：5’-TGATCCGATCCACTATGC-3’。本發(fā)明還提供相應(yīng)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了方便快捷的定量檢測(cè)不同牛種MYF5基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的目的。本發(fā)明可以監(jiān)測(cè)不同牛種、不同組織、不同時(shí)期的MYF5基因的mRNA表達(dá)狀態(tài)，檢測(cè)該基因在肌肉發(fā)育過程中的表達(dá)狀況，同時(shí)可以鑒定與肌肉生長(zhǎng)阻滯相關(guān)的疾病。本發(fā)明在檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104894267
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510308587
【發(fā)明人】裴杰, 郭憲, 包鵬甲, 褚敏, 梁春年, 丁學(xué)智, 閻萍, 馮瑞林, 王宏博, 朱新書
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年6月8日