一種檢測(cè)牛MSTN基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物和熒光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)牛MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的 特異性引物和熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最 常用的技術(shù)。PCR技術(shù)將模板DNA、特異性引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶、鎂離子等放 在同一個(gè)緩沖反應(yīng)體系中，進(jìn)行反復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實(shí)現(xiàn)靶DNA 片段在反應(yīng)液中呈2n倍擴(kuò)增(其中η為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003] 熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)和計(jì)算 機(jī)分析技術(shù)。熒光定量PCR在普通PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒光標(biāo)記物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)每 個(gè)熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的擴(kuò)增情況，并獲得每個(gè) 樣本的熒光定量變化曲線，進(jìn)而獲得每個(gè)反應(yīng)管的Ct值(熒光變化達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)）； 同時(shí)，在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下檢測(cè)2-10個(gè)倍數(shù)稀釋的已知數(shù)量的靶標(biāo)DNA，獲得 其Ct值，以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和 各個(gè)標(biāo)本的Ct值對(duì)每個(gè)反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。
[0004] 雖然Northern blot技術(shù)可檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作比較 復(fù)雜。Northern blot實(shí)驗(yàn)中一個(gè)主要的問(wèn)題是存在RNA的降解，所以Northern Blot中 所有的實(shí)驗(yàn)用品都需要經(jīng)過(guò)除去RNA酶的過(guò)程，如高溫烘烤、DEPC處理等。另外，Northern Blot中很多實(shí)驗(yàn)用品如甲醛、EB、DEPC、紫外燈等等對(duì)人體都有一定的傷害。基因芯片實(shí)驗(yàn) 雖然降低了實(shí)驗(yàn)人員的工作量，并可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)幾千個(gè)基因表達(dá)量變化，但 是其靈敏度較低。
[0005] 而SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其 熒光大大增強(qiáng)。該性質(zhì)用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。SYBR Green的最大吸收波長(zhǎng)約為 497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520 nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā) 射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
[0006] SYBR Green在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié) 合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。此外，由于 一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRB Green與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引 起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn) 物的影響。由解鏈曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結(jié)果。
[0007] MSTN全稱肌生成抑素（Myostatin)，是1997年美國(guó)John Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 一個(gè)研宄小組在研宄轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β )時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的生長(zhǎng)因子，被命名為生 長(zhǎng)/分化因子-8(GDF-8)。MSTN缺失的鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更廣泛，體重約是野生 鼠2倍。雙肌牛中MSTN基因發(fā)生突變，結(jié)果在同樣喂食條件下，雙肌牛比普通牛多提供30 %的肉產(chǎn)品。由于MSTN對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用，所以又命名為肌生成抑素。該因 子一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就受到科學(xué)工作者的廣泛重視，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研宄熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肌生成抑素（Myostatin，MSTN)基因 mRNA表達(dá)水平的特 異性引物和熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研宄，我們優(yōu)化出了一套能夠有效 檢測(cè)不同牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)MSTN基因 mRNA表達(dá)量的引物和PCR反應(yīng)的條件，并 組裝成MSTN基因 mRNA表達(dá)檢測(cè)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，以滿足生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和 畜牧獸醫(yī)研宄者的檢測(cè)需要。
[0009] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)牛MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的特異性引物，所述特異性引物 的核苷酸序列為： 上游引物序列為：5' -AACCAGGAGAAGATGGAC-3' ； 下游引物序列為：5 ' -TTAGAGGGTAACGACAGC-3 '。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種牛MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測(cè) 試劑盒，所述試劑盒包括特異性引物，所述特異性引物序列為： 上游引物序列為：5' -AACCAGGAGAAGATGGAC-3' ； 下游引物序列為：5 ' -TTAGAGGGTAACGACAGC-3 '。
[0011] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括SYBR Green染料。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0013] 進(jìn)一步地，所述陽(yáng)性對(duì)照的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQ ID No. 3。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述試劑盒的使用方法，是以待測(cè)cDNA為模板，利用 權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄Ct值，并以 MSTN標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量測(cè)定。
[0015] 優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C 5秒， 57. 6°C 20秒，捕捉焚光信號(hào)，循環(huán)40次。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種牛MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)方法，是 以待測(cè)cDNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物和SYBR Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 定量PCR，記錄Ct值，并以MSTN標(biāo)準(zhǔn)基因作為陽(yáng)性對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值進(jìn)行定量測(cè)定。
[0017] 優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95°C預(yù)變性30秒；95°C 5秒， 57. 6°C 20秒，捕捉焚光信號(hào)，循環(huán)40次。
[0018] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述特異性引物、試劑盒、序列表中SEQ ID No. 3所述 的核苷酸序列在定量檢測(cè)牛MSTN基因 mRNA表達(dá)水平中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述牛為黃牛、奶 牛和牦牛。
[0019] 與現(xiàn)有最好技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于： 1.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了方便快捷的定量檢測(cè)MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的目的，可以監(jiān)測(cè)不同 牛種(包括奶牛、黃牛和牦牛)、不同組織、不同時(shí)期的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，同時(shí)可以鑒定與 肌肉發(fā)育異常相關(guān)的疾病。
[0020] 2.本發(fā)明在檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的熒光檢測(cè)結(jié)果圖。其中，A :擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為PCR 循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對(duì)焚光量值（Relative Fluorescence Units，RFU);B:恪解曲線，橫 坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為單位溫度下相對(duì)熒光值的變化量。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0023] 其中，SYBR Green染料購(gòu)自寶生物工程(大連）有限公司。
[0024] 實(shí)施例1 本發(fā)明的MSTN基因 mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒由以下組分組成： 2XSYBR GREEN MIX 5mL ； 陽(yáng)性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)MSTN基因模板 500 μ L ; 引物混合液 500 yL; 超純水 5mL。
[0025] 其中，2X SYBR GREEN MIX 由以下組分組成：Taq DNA 聚合酶 0· I U/μ UdNTPs 底 物 0· 4 mmol /1,、Mg2+ 5. 0 mmol/L、KCl 100 mmol/L、ρΗ8· 3 的 Tris · HCl 20 mmol/L、質(zhì)量 百分含量為〇. 02%的明膠和SYBR Green染料。
[0026] 引物混合液：上游引物8 ymol/L、下游引物8 ymol