專利名稱：食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食源性致病菌的檢測(cè)方法，尤其涉及一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜 和聚類分析對(duì)食源性致病菌進(jìn)行鑒別的方法。
背景技術(shù)：
食源性致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，不僅導(dǎo)致人類多種疾病的發(fā)生， 而且嚴(yán)重威脅著人們的健康并造成經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年有數(shù)十億人 感染上食源性疾病。美國(guó)“9. 11”事件后，世界各地對(duì)生物恐怖事件給予了極大的關(guān)注，由 此建立對(duì)食源性致病菌的鑒定和檢測(cè)方法勢(shì)在必行。一般來說，造成食源性疾病的致病菌 層出不窮，但尤以沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌為最。如何 快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)這些致病菌，是有效遏制食源性疾病、確保食品安全的首要任務(wù)?，F(xiàn)有的常規(guī)食品微生物檢測(cè)方法包括反復(fù)增菌、菌落分離及多種生化和血清學(xué)鑒 別實(shí)驗(yàn)，或者是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)現(xiàn)的。雖然這些檢測(cè)方法十分專業(yè)和經(jīng)典，但 其步驟復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，成本高，且其最主要的不足之處在于必須進(jìn)行預(yù)增菌，而從取樣到 確定是定性還是定量鑒別微生物，最低需要一天以上的時(shí)間，因此難以適應(yīng)飛速發(fā)展的現(xiàn) 代食品生產(chǎn)和流通的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其靈 敏度高，易于操作，檢測(cè)速度快，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的在線檢測(cè)，從而克服了現(xiàn)有技術(shù) 中的不足。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案一種食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于，該方法為采用金 或銀納米溶膠作為增強(qiáng)試劑，以表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)對(duì)檢測(cè)結(jié) 果進(jìn)行聚類分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的鑒別。進(jìn)一步地講，該方法具體為取食源性致病菌中的至少一種制成活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品，并將活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品與 金或銀納米溶膠充分混合后以拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)，其后將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，并由此 鑒別食源性致病菌的種屬；所述食源性致病菌至少包括沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增 李斯特菌；所述金或銀納米溶膠的使用量與致病菌的用量在1毫摩爾100活菌數(shù) 1毫摩 爾30000活菌數(shù)之間。該方法包括如下步驟(1)活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備取食源性致病菌中的至少一種的菌種在LB固體培養(yǎng)基上于30-37°C劃線培養(yǎng)對(duì)-4他，其后挑取分散的單一菌落置于水中振蕩，而后在5000-10000rmp離心處理 5-30min，離心沉淀物經(jīng)洗滌后，制成活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述食源性致病菌至少包括沙門 氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌；(2)拉曼光譜檢測(cè)將拉曼光譜表面增強(qiáng)試劑與上述活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品以1毫摩爾100活菌數(shù) 1毫摩爾30000活菌數(shù)的用量比例混合、振蕩，使兩者充分結(jié)合，而后以拉曼光譜進(jìn)行檢 測(cè)；⑶數(shù)據(jù)處理將標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，由此鑒別食源性致病菌的種屬。步驟O)中拉曼光譜儀的測(cè)定條件設(shè)為激光功率范圍20-300mw，掃描時(shí)間 2-20so步驟O)中活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品與增強(qiáng)試劑混合、振蕩的時(shí)間為2-60s。步驟(3)中是通過比對(duì)食源性致病菌的拉曼光譜圖中各峰峰值來鑒別食源性致 病菌種屬的。所述金納米溶膠的制備方法為將0. 30-1. 50mg/mL氯金酸鉀溶液置入溫度為105_135°C的條件下煮沸，加入的檸 檬酸鈉溶液濃度為0. Iwt % -IOwt %，煮沸5-95min，制得金納米溶膠。更進(jìn)一步地講，該方法包括如下具體步驟(1)活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備至少取沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的菌種分別 在LB固體培養(yǎng)基上于30-37°C劃線培養(yǎng)M-4 !，其后挑取分散的單一菌落置于水中振蕩， 而后在5000-100(K)rmp離心處理5-30min，離心沉淀物經(jīng)洗滌后，制成至少四種活化菌株標(biāo) 準(zhǔn)樣品；(2)拉曼光譜檢測(cè)將拉曼光譜表面增強(qiáng)試劑與上述活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品混合、振蕩，使兩者充分結(jié)合， 而后以拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)；(3)數(shù)據(jù)處理將各標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，由此建立可用于鑒別和區(qū)分食 源性致病菌的種屬的聚類分析圖；(4)參照步驟O)的操作，以拉曼光譜檢測(cè)一種以上未知菌種樣品，將所得拉曼光 譜檢測(cè)結(jié)果與步驟( 所得上述標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果和步驟C3)所得聚類分析圖 進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定未知菌種的種屬。


圖1是四種食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜比較圖；圖2是未知的18株細(xì)菌樣品拉曼光譜數(shù)據(jù)的聚類分析圖；以上圖中所示I為單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、II為沙門氏菌 (Salmonella spp)、III為埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli)、IV為金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)0
具體實(shí)施例方式本案發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究和實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，由于不同的細(xì)菌種類在它們的細(xì)胞生物化學(xué) 成分方面有所不同，每個(gè)分子都有一個(gè)特征光譜，可以通過拉曼光譜儀檢測(cè)出分子的特征 電磁波。利用拉曼光譜能同時(shí)獲得完整活細(xì)胞內(nèi)4種主要生物大分子結(jié)構(gòu)及其變化的直接 證據(jù)，包括核酸的磷酸骨架，脫氧核糖(或核糖)和堿基蛋白質(zhì)的主、側(cè)鏈；脂膜的脂肪酸 碳鏈氫鏈的反式和扭曲構(gòu)象以及各種不同構(gòu)象的碳水化合物等。因而，可以根據(jù)它們的拉 曼光譜就可以鑒別出細(xì)菌的種類。根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本案發(fā)明人提出了基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的食源性致病菌鑒別方 法，其技術(shù)方案大致如下(1)微生物樣品的制備活化食源性致病菌菌株，培養(yǎng)后將菌體在蒸餾水中洗滌，制成活化食源性致病菌 菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品，完畢后待進(jìn)樣。(2)增強(qiáng)試劑制備條件的優(yōu)化本發(fā)明可選取金納米溶膠、銀納米溶膠或其它類似試劑作為增強(qiáng)試劑。其中，金納 米溶膠及銀納米溶膠可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)知的方法制備。例如，金納米溶膠可采用檸 檬酸鈉還原氯金酸或其鹽類的方法制備，而銀納米溶膠可采用以NaBH4還原可溶性銀鹽的 方法制備。(3)拉曼光譜儀進(jìn)樣條件的設(shè)定(4)被測(cè)菌種拉曼光譜的收集將步驟(1)中制備的活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品與步驟( 中的增強(qiáng)試劑按合適比例(這 個(gè)比例以獲得較好的拉曼光譜表面增強(qiáng)率為宜)混合，振蕩結(jié)合一定時(shí)間(至樣品中的細(xì) 菌與納米粒子充分結(jié)合為宜)，置于拉曼光譜儀之中按照步驟(3)進(jìn)行測(cè)定，掃描得到的光 譜圖經(jīng)處理后轉(zhuǎn)換為可供數(shù)據(jù)處理的數(shù)據(jù)表待后續(xù)數(shù)據(jù)處理。(5)數(shù)據(jù)處理將拉曼光譜圖的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，通過各食源性致病菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜圖 各峰峰值鑒別不同種屬的食源性致病菌。前述的步驟可分別優(yōu)選為微生物樣品的制備菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30-37°C下培養(yǎng)對(duì)-4他，用 無菌接種環(huán)挑取分散的單一菌落，置于蒸餾水中振蕩，5000-10000rmp離心5-30min，重復(fù) 三次操作，而后以水洗滌，完畢。增強(qiáng)試劑制備條件的優(yōu)化采用納米金作為增強(qiáng)試劑，油浴升溫至105_135°C左 右加入0. 30-1. 50mg/mL氯金酸鉀溶液待沸騰，加入的檸檬酸鈉溶液濃度為0. -10% (質(zhì)量百分比)，煮沸反應(yīng)時(shí)間為5-95min。進(jìn)樣條件拉曼光譜儀測(cè)定條件設(shè)定為激光功率范圍20-300mw，掃描時(shí)間 2-20秒。各細(xì)菌樣品與金溶膠混合體積比為1 1-1 5，二者混合時(shí)間保持一致，為 2-60so數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS (SPSS公司)、SAS軟件(SAS Institute Inc.)或其他類 似軟件對(duì)拉曼光譜圖數(shù)據(jù)通過聚類分析，從而進(jìn)行食源性致病菌的鑒別。
下面結(jié)合附圖及若干較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不 僅僅局限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1 利用表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別四種食源性致病菌金黃色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella spp)、單增李其jf 特菌(Listeria monocytogenes)禾口埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli),其過禾呈為取上述四種致病菌的凍存菌種接種至TSB離心管中活化，在30_37°C活化至少 Mh，待TSB渾濁，接種至LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，在37°C培養(yǎng)24h 4 形成分散的 菌落，用無菌接種環(huán)挑取單一菌落至裝有4mL蒸餾水的離心管中振蕩混濁，于冷凍離心機(jī) 8500rmp離心5min，重復(fù)3次以上，取沉淀以水洗滌完畢待進(jìn)樣。取按照前述優(yōu)化條件制 備的金納米溶膠500 μ L與300 μ L前述菌體標(biāo)準(zhǔn)樣品分別于進(jìn)樣瓶中混合8s，拉曼測(cè)定 200mw，IOs得到光譜圖，按照上述操作每株細(xì)菌樣品，收集圖譜，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到圖1，該 圖中，500CHT1左右的峰是蛋白質(zhì)肽類的S-S鍵伸縮振動(dòng)jSOcnT1左右是碳水化合物的特征 峰1330(31^1左右的峰應(yīng)是腺嘌呤的特征峰——類似于DNA的譜圖1125(31^1特征峰的出現(xiàn) 表明納米顆?？赡苓M(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞壁后造成DNA的變性；其余大部分的峰可能是細(xì)胞壁中蛋 白質(zhì)、肽類和氨基酸；最強(qiáng)的730cm—1左右的峰歸屬于肽聚糖結(jié)構(gòu)中NAG成分，也有可能是 FAD的倍頻峰；金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌是革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁更厚更粗糙，金 納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞可能性較低，由1330cm—1峰的強(qiáng)度相吻合；沙門氏菌和埃希氏大腸桿菌 是革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁比陽性菌更薄，其脂質(zhì)雙分子層的振動(dòng)峰強(qiáng)度較小。實(shí)施例2 利用表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別未知的食源性致病菌樣品本實(shí)施例按照上述方法取未知的18株食源性致病菌樣品分別進(jìn)樣，收集所得拉 曼光譜圖譜，將光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS軟件處理得到聚類分析結(jié)果，再將光譜數(shù)據(jù)及聚類分析 結(jié)果與前述標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜圖及聚類分析結(jié)果比對(duì)，并由此確定了其中標(biāo)號(hào)為14、16的樣 品，3、4、9、10、12、13、17、18的樣品，1、5、7、11的樣品以及2、6、8、15的樣品分別為單增李斯 特菌、沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，從而實(shí)現(xiàn)了未知食源性致病菌樣品種 屬的鑒定。當(dāng)然，本實(shí)施例的過程僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā) 明的啟示，亦可很容易想到對(duì)除上述四種食源性致病菌之外的其他多種細(xì)菌以類似的方法 進(jìn)行區(qū)分和鑒定。但是，凡本領(lǐng)域技術(shù)人員因本發(fā)明所涉及之技術(shù)啟示，而采用等同替換或 等效變形方式形成的技術(shù)方案均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于，該方法為采用金 或銀納米溶膠作為增強(qiáng)試劑，以表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)對(duì)檢測(cè)結(jié) 果進(jìn)行聚類分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的鑒別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于， 該方法具體為取食源性致病菌中的至少一種制成活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品，并將活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品與金或 銀納米溶膠充分混合后以拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)，其后將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，并由此鑒別 食源性致病菌的種屬；所述食源性致病菌至少包括沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯 特菌；所述金或銀納米溶膠的使用量與致病菌的用量在1毫摩爾100活菌數(shù) 1毫摩 爾30000活菌數(shù)之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在 于，該方法包括如下步驟(1)活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備取食源性致病菌中的至少一種的菌種在LB固體培養(yǎng)基上于30-37°C劃線培養(yǎng)M-4 !， 其后挑取分散的單一菌落置于水中振蕩，而后在5000-10000rmp離心處理5-30min，離心沉 淀物經(jīng)洗滌后，制成活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述食源性致病菌至少包括沙門氏菌、埃希氏大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌；(2)拉曼光譜檢測(cè)將拉曼光譜表面增強(qiáng)試劑與上述活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品以1毫摩爾100活菌數(shù) 1毫摩 爾30000活菌數(shù)的用量比例混合、振蕩，使兩者充分結(jié)合，而后以拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)；(3)數(shù)據(jù)處理將標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，由此鑒別食源性致病菌的種屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于， 步驟O)中拉曼光譜儀的測(cè)定條件設(shè)為激光功率范圍20-300mw，掃描時(shí)間2-20s。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于， 步驟O)中活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品與增強(qiáng)試劑混合、振蕩的時(shí)間為2-60s。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于， 步驟(3)中是通過比對(duì)食源性致病菌的拉曼光譜圖中各峰峰值來鑒別食源性致病菌種屬 的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在 于，所述金納米溶膠的制備方法為將0. 30-1. 50mg/mL氯金酸鉀溶液置入溫度為105_135°C的條件下煮沸，加入的檸檬酸 鈉溶液濃度為0. Iwt % -IOwt %，煮沸5-95min，制得金納米溶膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法，其特征在于， 該方法包括如下具體步驟(1)活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備至少取沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的菌種分別在LB固體培養(yǎng)基上于30-37°C劃線培養(yǎng)Μ-4 !，其后挑取分散的單一菌落置于水中振蕩，而后 在5000-10000rmp離心處理5-30min，離心沉淀物經(jīng)洗滌后，制成至少四種活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品。(2)拉曼光譜檢測(cè)將拉曼光譜表面增強(qiáng)試劑與上述活化菌株標(biāo)準(zhǔn)樣品混合、振蕩，使兩者充分結(jié)合，而后 以拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)；(3)數(shù)據(jù)處理將各標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，由此建立可用于鑒別和區(qū)分食源性 致病菌的種屬的聚類分析圖；(4)參照步驟O)的操作，以拉曼光譜檢測(cè)一種以上未知菌種樣品，將所得拉曼光譜檢 測(cè)結(jié)果與步驟( 所得上述標(biāo)準(zhǔn)樣品的拉曼光譜檢測(cè)結(jié)果和步驟( 所得聚類分析圖進(jìn)行 比對(duì)，從而鑒定未知菌種的種屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食源性致病菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜鑒別方法。該方法為采用金或銀納米溶膠作為增強(qiáng)試劑，以表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的鑒別。本發(fā)明方法靈敏度高，選擇性好，易于操作，檢測(cè)速度快，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的大規(guī)模在線檢測(cè)，適于在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102115778SQ20101057189
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者姚衛(wèi)蓉, 汪仕韜, 汪朋, 王毅謙, 邵景東, 黃玉坤 申請(qǐng)人:江南大學(xué)