本發(fā)明涉及一種利用自組裝石墨烯高靈敏檢測(cè)蛋白質(zhì)單分子的方法，屬于電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在過(guò)去的30年，單分子檢測(cè)已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注。 單分子檢測(cè)可以用來(lái)研究電子遷移過(guò)程的基礎(chǔ)理論，闡明電子遷移的基本行為和過(guò)程，這些都是傳統(tǒng)的僅僅研究大量分子的集合體所不能解決的。單分子水平的檢測(cè)對(duì)單分子范圍內(nèi)的研究是非常必要的，而且可以顯著促進(jìn)現(xiàn)有的傳感技術(shù)的發(fā)展。最近幾年，出現(xiàn)了一些檢測(cè)單分子的技術(shù)和方法，這些方法包括：利用熒光檢測(cè)分子的氧化還原狀態(tài)、表面增強(qiáng)拉曼光譜和掃面電鏡法。這些方法對(duì)單分子檢測(cè)做出巨大的貢獻(xiàn)，然而，它們也有一些不足，如這些檢測(cè)方法往往需要利用先進(jìn)的設(shè)備、復(fù)雜的檢測(cè)過(guò)程或檢測(cè)靈敏度不高；

利用電化學(xué)技術(shù)檢測(cè)單分子或幾個(gè)分子是非常有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)橐粋€(gè)具有氧化還原反應(yīng)的活性分子和電極的一次碰撞過(guò)程中，對(duì)氧化還原電流只能貢獻(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)電子。因此，利用電子轉(zhuǎn)移過(guò)程檢測(cè)單個(gè)分子需要一種技術(shù)手段，用來(lái)大幅度增加每個(gè)分子貢獻(xiàn)的電子數(shù)；

這種放大電流可以通過(guò)循環(huán)氧化還原過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種方法最早由Reilley提出，被Bard及合作者用在他們開(kāi)拓性的顆粒碰撞實(shí)驗(yàn)中。最近，Bard及同事提出了一種利用微電極檢測(cè)金屬納米顆粒碰撞的新方法，即通過(guò)放大電化學(xué)催化反應(yīng)產(chǎn)生的電流。在這個(gè)方法中，納米粒子和微電極碰撞產(chǎn)生階梯式的電流變化。Compton 和合作者提出了納米粒子和微電極的碰撞過(guò)程，納米粒子和微電極碰撞的一瞬間，納米粒子就成為納米電極。 隨后的氧化還原反應(yīng)就在納米粒子電極上發(fā)生，而不在基體微米電極上；

石墨烯是一種由單碳原子緊密堆積而成二維蜂窩狀晶體結(jié)構(gòu)的新型碳材料，具有優(yōu)異的結(jié)構(gòu)、化學(xué)和電學(xué)特性。由于其優(yōu)異的電化學(xué)特性，石墨烯可以用作卓越的電極材料和傳感器，用來(lái)檢測(cè)酶、DNA和抗體。石墨烯可以用共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵方法來(lái)修飾。MP-11分子可以通過(guò)非共價(jià)鍵方式和石墨烯結(jié)合，形成石墨烯在中間、MP-11在兩面的三明治結(jié)構(gòu)。石墨烯修飾的MP-11有2個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：第一，表面帶負(fù)電荷的石墨烯片可以很容易地在靜電場(chǎng)的作用下遷移到電極表面，增加碰撞幾率。第二，單層分布的MP-11分子在石墨烯的兩側(cè)，形成了一個(gè)石墨烯裝載MP-11分子的“車輛”，因而石墨烯“車輛”和微電極碰撞產(chǎn)生的電流比單個(gè)的MP-11分子產(chǎn)生的電流大的多。這種放大的電流很容易地被檢測(cè)到；

我們的發(fā)明受Bard和其他研究者的啟發(fā)，提出了一種利用粒子-電極碰撞檢測(cè)單分子的方法。用單分子修飾納米石墨烯，這樣可以增加氧化還原分子和電極的活性接觸面積，當(dāng)MP-11分子修飾的納米石墨烯和微電極碰撞時(shí)，氧化還原電流被顯著放大，這種被檢測(cè)到的放大電流間接地反應(yīng)了MP-11分子和電極的碰撞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用自組裝石墨烯高靈敏檢測(cè)蛋白質(zhì)單分子的方法，該方法將蛋白質(zhì)分子和納米石墨烯自組裝，利用電化學(xué)工作站，通過(guò)計(jì)時(shí)電流，研究石墨烯和微電極的碰撞，從而檢測(cè)單分子，該方法有檢測(cè)設(shè)備和工藝簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)；

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：

（1） 納米石墨烯的制備：取2 g石墨納米纖維、10 mL濃硫酸和1 g P2O5，混合加熱至80 °C，使其預(yù)氧化30 min，然后在6 h內(nèi)冷卻到室溫，將混合物用蒸餾水稀釋、抽濾并洗至中性，預(yù)氧化后的石墨干燥后與50 mL濃硫酸混合，并緩慢加入6 g高錳酸鉀，攪拌，控制溫度低于20°C，然后將混合物放在 35 °C的油浴中攪拌 2 h, 然后加入280 mL水后終止反應(yīng)，向反應(yīng)結(jié)束后的混合物中加入5 mL 30 % 的過(guò)氧化氫，混合物變成明黃色，所得混合物用分散在水中，然后抽濾，抽濾后的濾餅用1:10 的稀鹽酸清洗，然后干燥，配制濃度為0.1mg/ mL的氧化石墨烯分散液50 mL，然后加入50 mg 維生素，在室溫下強(qiáng)力攪拌24小時(shí)，還原得到單層分布的納米石墨烯；

（2） 蛋白質(zhì)分子（MP-11）和石墨烯的自組裝: 將1 mL 濃度為0.186 mg/mL的 MP-11溶液加入1 mL濃度為0.05 mg/mL 的納米石墨烯溶液， 攪拌12 h，得到MP-11非共價(jià)鍵修飾的納米石墨烯，清洗MP-11/graphene溶液以出去多余的MP-11分子，最后稀釋到10 mL，用同樣的方法配制MP-11濃度為20、40 μM 的MP-11/graphene溶液；將直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為5 mg/ mL的Lomant試劑的DMSO溶液中，保持一夜，得到Lomant單層修飾的金電極，命名為L(zhǎng)omant/Au電極；將另一根直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為10 mM 的MPA的酒精溶液中，保持48 h，將此電極命名為MPA/Au電極；

（3） 蛋白質(zhì)分子的電化學(xué)檢測(cè): 采用三電極電化學(xué)工作站測(cè)量循環(huán)伏安和計(jì)時(shí)電流。工作電極為直徑2 mm 和12.5 μm的金電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對(duì)電極。向pH=7，濃度為10 mM PBS溶液中加入MP-11/graphene，記錄電流和時(shí)間的關(guān)系曲線，工作電壓分別為-400，-600和-800 mV，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔是50 ms。

有益效果

本發(fā)明采用電化學(xué)方法檢測(cè)納米石墨烯修飾的單分子，實(shí)驗(yàn)設(shè)備和檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行，靈敏度高，在電化學(xué)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是MP-11和納米石墨烯的自組裝示意圖；

圖2是單片石墨烯/MP-11和金電極碰撞檢測(cè)蛋白質(zhì)分子（MP-11）的原理圖；

圖3是MP-11/石墨烯（黑色）、石墨烯（紅色）和MP-11（藍(lán)色）分別加入電解液后記錄的計(jì)時(shí)電流圖。金電極的直徑是12.5 μm，電壓 -400 mV ，數(shù)據(jù)采集間隔50ms。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明：

實(shí)施例1

（1） 納米石墨烯的制備：取2 g石墨納米纖維、10 mL濃硫酸和1 g P2O5，混合加熱至80 °C，使其預(yù)氧化30 min，然后在6 h內(nèi)冷卻到室溫，將混合物用蒸餾水稀釋、抽濾并洗至中性，預(yù)氧化后的石墨干燥后與50 mL濃硫酸混合，并緩慢加入6 g高錳酸鉀，攪拌，控制溫度低于20°C，然后將混合物放在 35 °C的油浴中攪拌 2 h, 然后加入280 mL水后終止反應(yīng)，向反應(yīng)結(jié)束后的混合物中加入5 mL 30 % 的過(guò)氧化氫，混合物變成明黃色，所得混合物用分散在水中，然后抽濾，抽濾后的濾餅用1:10 的稀鹽酸清洗，然后干燥，取15 mg干燥后氧化石墨烯分散于45 mL水中得到氧化石墨烯分散液，將氧化石墨烯分散液稀釋，用氨水調(diào)節(jié)至pH=10，用60%的水合肼 20 μL在95 °C還原1 h，得到單層納米石墨烯溶液；

（2） 蛋白質(zhì)分子（MP-11）和石墨烯的自組裝: 將1 mL濃度為0.05 mg/mL 的納米石墨烯溶液和1 mL 濃度為0.186 mg/mL的 MP-11混合，然后稀釋到10 mL 并攪拌12 h，得到MP-11非共價(jià)鍵修飾的納米石墨烯；

（3） 蛋白質(zhì)分子的電化學(xué)檢測(cè): 采用三電極電化學(xué)工作站測(cè)量循環(huán)伏安和計(jì)時(shí)電流。工作電極為直徑2 mm 和12.5 μm的金電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對(duì)電極。向pH=7，濃度為10 mM PBS溶液中加入MP-11/graphene，記錄電流和時(shí)間的關(guān)系曲線，工作電壓分別為-400，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔是50 ms；

實(shí)施例2. 將實(shí)施例1中步驟（3）的工作電壓改為-600mV，其他同實(shí)施例1；

實(shí)施例3. 將實(shí)施例1中步驟（3）的工作電壓改為-800mV，其他同實(shí)施例1。