專利名稱：三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬微生物檢測領域，涉及一種沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌三重快速檢測方法及其檢測引物組和檢測試劑盒。
背景技術：
沙門氏菌印/ )是公共衛(wèi)生領域的重要致病菌，屬革蘭氏染色陰性腸桿菌。據統(tǒng)計在世界各國發(fā)生的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首， 我國內陸地區(qū)所發(fā)生的細菌性食物中毒中也以沙門氏菌為首要原因。除引發(fā)食物中毒外， 該屬的細菌還可以導致胃腸炎、傷寒和副傷寒等疾病。志賀氏菌5^)屬革蘭氏染色陰性腸桿菌，是人類細菌性痢疾最常見的病原菌。近年來，志賀氏菌I型的細菌性痢疾已發(fā)展為世界性流行趨勢，我國至少在十余個省區(qū)發(fā)生了不同規(guī)模流行。金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aareM)隸屬于葡萄球菌屬，革蘭氏染色呈陽性。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等， 甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生難題，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。根據現行有效的國家標準和行業(yè)標準，幾乎所有的食品均需對這三種食源性致病菌進行檢測以排除其污染。常規(guī)檢測采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，且每個致病菌需應用獨立的檢測方法單獨進行檢測，工作量大，檢測周期長，且受到檢測人員專業(yè)、經驗等多種因素限制，容易出現誤判。隨著分子生物學方法在食品微生物檢測中的逐步應用，致病菌的檢測效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和熒光PCR方法雖可提高檢測效率，但對儀器設備要求較高，對檢測人員的專業(yè)背景和檢測能力也有一定要求，因此無法大范圍的推廣使用。LAMP方法是一種新型的恒溫核酸擴增技術，該技術主要利用4種不同的特異性引物識別靶DNA上6個特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(feiDNA)，在恒溫條件下快速擴增核酸，保證了擴增的高特異性和高效率。由于LAMP獨特的核酸擴增機制， 它的產物是由多重復靶序列的莖一環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝膠電泳上會呈現出LAMP反應典型的階梯狀條帶；同時，核酸大量生成時，從dNIPs中析出的焦磷酸根離子與反應體系中的Mg2+結合，產生肉眼可見的擴增反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀；另外，由于擴增產物大量生成，加入熒光染料(如Syber Green I、溴化乙錠、Gel Red 等)。因此LAMP擴增結果不但觀察方式多樣，且結果鑒定簡單，非常適合高通量的快速檢測。鑒于LAMP技術有眾多優(yōu)勢，現已被逐漸應用于病原微生物的檢測。如分支桿菌屬、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一個系統(tǒng)中針對某一種致病菌進行檢測，在需要快速篩查多個致病菌時，需分別對其進行檢測，仍有較大工作量。多重恒溫核酸檢測技術能在同一反應體系中，同一反應條件下，實現多個目的菌的快速篩查，具有廣闊的應用前景。經國內外文獻查詢，尚未見有LAMP應用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌多重快速檢測的相關報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒。為實現上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是本發(fā)明沙門氏菌的快速檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。本發(fā)明志賀氏菌的快速檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。本發(fā)明金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。本發(fā)明使用引物組對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌進行多重快速檢測的方法是將沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組和金黃色葡萄球菌的檢測引物組與待測樣品的DNA進行LAMP反應，反應結束后對反應液進行陰陽性判定，以確定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌中的任一種或任幾種；其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。進一步地，本發(fā)明所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種方案進行 第一種方案所述LAMP反應在59. 5-62. 5°C下反應70_110min ；
第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟
(1)先在59. 5-62. 5°C下反應 70-1 IOmin ；
(2)后在80°C下反應6-12min。進一步地，本發(fā)明在進行所述LAMP反應的反應液中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3μΜ，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3μΜ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ Μ,并且，還包含有濃度為0. 6-0. 7 M的甜菜堿、濃度為 3. 8-5. 4mM的MgS04、10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、濃度為0. 4-0. 6U/μ L的 feiDNA聚合酶、濃度各為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。本發(fā)明快速檢測試劑盒包括沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、三種陽性對照品、Bs DNA聚合酶、10 Xfe DNA聚合酶緩沖液、 MgSO4溶液、甜菜堿溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4 所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的標準菌株的基因組DNA。本發(fā)明快速檢測試劑盒的LAMP反應液中，包含有沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、甜菜堿、BstmA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水，其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3μΜ，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0.2-0. 3 μ Μ，所述甜菜堿的濃度為0.6-0. 7 Μ, MgSO4的濃度為 3. 8-5. 4mM, 10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，feiDNA聚合酶的濃度為0. 4-0. 6U/ μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 6-1. OmM。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明是根據已公開的沙門氏菌侵襲蛋白A (invA)基因序列、志賀氏菌侵襲性質?？乖?ipaH)基因序列、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因序列，分析設計得到本發(fā)明的三重LAMP檢測引物組。本發(fā)明的三重LAMP檢測引物組特異性強，能準確檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA。(2)本發(fā)明能在同一反應體系中和同一反應溫度條件下，實現同時對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測，準確判斷所檢樣品是否被沙門氏菌、志賀氏菌或金黃色葡萄球菌污染，大大提高實驗室檢測效率。(3)本發(fā)明的快速檢測方法能快速高效擴增沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA目的片段，整個LAMP擴增過程最快可在70分鐘內完成，擴增產物得率高，對上述三種致病菌的檢測簡便、準確。(4)在本發(fā)明的快速檢測方法中，LAMP擴增反應可在恒定溫度下完成，且允許的溫度波動范圍較大(士 1. 5°C )，因此對溫控的儀器設備要求不高，水浴器或板式加熱器均可滿足要求。(5)本發(fā)明的快速檢測方法靈敏度高，沙門氏菌的陽性擴增結果僅需10fg/yL目的菌基因組DNA，志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的陽性擴增結果均僅需lfg/yL目的菌基因組 DNA。(6)本發(fā)明的快速檢測方法結果判定簡便，且可根據實驗室實際條件采用不同的結果判定方式，方法適應性較強。(7)與常規(guī)的平板培養(yǎng)法相比，本發(fā)明的快速檢測方法可大大縮短檢測周期，減少檢測環(huán)節(jié)，從而降低因檢測環(huán)節(jié)過多或人員技術水平和經驗的差異造成的誤判的幾率，使檢測結果更為準確可靠。
圖1是對沙門氏菌LAMP反應產物進行測序的部分DNA序列。圖2是對志賀氏菌LAMP反應產物進行測序的部分DNA序列。圖3是對金黃色葡萄球菌LAMP反應產物進行測序的部分DNA序列。圖4是多重擴增產物加入熒光染料后的觀察結果。圖5是多重擴增產物離心后沉淀的觀察結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌三重LAMP快速檢測Mg2+濃度測試本實施例的具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯， 360C 士 1°C培養(yǎng)18小時。1. 2、應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取上述培養(yǎng)產物中的細菌DNA。2、LAMP 反應
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系
2. 2. 1、沙門氏菌的LAMP反應體系
應用不同的Mg2+濃度分別建立6組沙門氏菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25μΜ的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿，10 %(體積)的10 XfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的feiDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，沙門氏菌基因組DNA模板IyL; 并且在以上6組反應體系中，MgSO4濃度分別為2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、6. 2mM ；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 2、志賀氏菌的LAMP反應體系
應用不同的Mg2+濃度分別建立6組志賀氏菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25μΜ的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿， 10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，志賀氏菌基因組DNA模板IyL; 并且在以上6組反應體系中，MgSO4的濃度分別采用2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、 6. 2mM ；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 3、金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系
分別應用不同的Mg2+濃度分別建立6組金黃色葡萄球菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0.25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0.65 M的甜菜堿，10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，濃度各為0. 8mM 的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板IyL; 并且在以上6組反應體系中，MgSO4的濃度分別采用2. 2mM、3mM、3. 8mM、4. 6mM、5. 4mM、 6. 2mM ；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件
應用恒溫水浴器，反應條件為先在61°C下反應90min ；后在80°C下反應6min。2. 4、結果觀察
將以上反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結果。其中沙門氏菌擴增時， 當Mg2+濃度在3. 8-5. 4mM區(qū)間時，呈現出明亮的梯狀電泳條帶；志賀氏菌擴增時，當Mg2+濃度在3-6. 2mM區(qū)間時，呈現出明亮的梯狀電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴增時，當Mg2+濃度在 3. 8-6. 2mM區(qū)間時，呈現出明亮的梯狀電泳條帶。綜合三種目標菌檢測時的Mg2+濃度范圍， 確定該三重檢測方法的最佳Mg2+濃度為3. 8-5. 4mM。實施例2 沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌三重LAMP快速檢測反應溫度測試本實施例具體檢測方法如下
1、樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯， 360C 士 1°C培養(yǎng)18小時。1.2、應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產物中的細菌 DNA。2、LAMP 反應
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系
2. 2. 1、沙門氏菌的LAMP反應體系
應用不同的反應溫度分別建立6組沙門氏菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系的體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25μΜ的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿，10 % (體積)的10 XfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的Bstmk聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4,沙門氏菌基因組DNA模板1 μ L，以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 2、志賀氏菌的LAMP反應體系應用不同的反應溫度分別建立6組志賀氏菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25μΜ的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿， 10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4,志賀氏菌基因組DNA模板1 μ L，以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 2. 3、金黃色葡萄球菌的LAMP反應體系
應用不同的反應溫度分別建立6組金黃色葡萄球菌LAMP反應體系，具體如下 各組反應體系體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25μΜ的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿， 10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L WfeiDNA聚合酶，濃度各為 0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4,金黃色葡萄球菌基因組DNA模板IyL;以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件
應用恒溫水浴器，將本實施例的2. 2中所述6組沙門氏菌LAMP反應體系、6組志賀氏菌反應體系、6組金黃色葡萄球菌反應體系，分別先在6種不同溫度下進行反應，所采用的溫度分別為58. 50C>59. 5°C、61°C、62. 5°C>63. 5°C>64. 5°C，反應時間為 90min ；后再分別在 80°C下反應6min。2. 4、結果觀察
將以上反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結果。其中沙門氏菌擴增時，當反應溫度在59. 5-64. 5°C區(qū)間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶；志賀氏菌擴增時，當反應溫度在59. 5-63. 5°C區(qū)間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶；金黃色葡萄球菌擴增時，當反應溫度在 59. 5-62. 5°C區(qū)間時，呈現明亮的梯狀電泳條帶。綜合三種目標菌檢測時的溫度范圍，確定該三重檢測體系的最佳反應溫度為59. 5-62. 5°C。實施例3 三重LAMP快速檢測對沙門氏菌的檢測靈敏度本實施例的具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將沙門氏菌標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36 °C 士 1 °C培養(yǎng)18小時。1. 2、應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產物中細菌DNA。2、LAMP 反應
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP的反應體系
建立9個反應管，各反應管中反應體系的總體積為25 μ L，包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物， 濃度為0. 65 M的甜菜堿，10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的 feiDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4 ；各反應管還需分別加入沙門氏菌基因組DNA模板液1 μ L，所用沙門氏菌基因組DNA模板液的濃度分別為IOng/μ L、lng/μ L、100pg/μ L、10pg/μ L、lpg/μ L、 lOOfg/yLUOfg/yLUfg/uL.O. lfg/yL,以測試該檢測方法對沙門氏菌的檢測靈敏度； 以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件
應用恒溫水浴器，先在61°C下反應90min，后在80°C下反應6min。2. 4、結果觀察
將以上各反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結果。通過對反應產物的電泳分析，當模板DNA液的濃度降至IOfg/ μ L時，仍可見較為明亮的梯狀電泳條帶。說明本發(fā)明方法對沙門氏菌DNA的檢測靈敏度為IOfg/μ L。 實施例4 三重LAMP快速檢測對志賀氏菌的檢測靈敏度本實施例具體檢測方法為 1、樣品DNA的提取
1.1、將志賀氏菌標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時。1. 2、應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產物中細菌DNA。2、LAMP 反應
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系
建立9個反應管，各反應管反應體系總體積為25 μ L，分別包括濃度均為0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度均為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物， 濃度為0. 65 M的甜菜堿，10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的 feiDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4 ；各反應管還需加入志賀氏菌基因組DNA模板液1 μ L，所用模板DNA液濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/μ L、0. lfg/μ L，以測試該檢測方法對志賀氏菌的檢測靈敏度；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件
應用恒溫水浴器，先在61°C下反應90min，后在80°C下反應6min。2. 4、結果觀察
將以上各反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結果。通過對反應產物的電泳分析，當模板DNA液的濃度降至lfg/μ L時，仍可見較為明亮的梯狀電泳條帶。說明本方法對志賀氏菌DNA的檢測靈敏度為lfg/μ L。實施例5 三重LAMP快速檢測對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度本實施例具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1.1、將金黃色葡萄球菌標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，36°C 士 1°C培養(yǎng)18小時。1.2、應用QIAGEN細菌基因組DNA分別提取試劑盒提取以上培養(yǎng)產物中的細菌 DNA。2、LAMP 反應
2.1、分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系
建立9個反應管，各反應管反應體系總體積為25 μ L，包括0. 25 μ M的所述沙門氏菌檢測的上游引物和下游引物、濃度均為0. 25 μ M的所述志賀氏菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 25 μ M的所述金黃色葡萄球菌檢測的上游引物和下游引物，濃度為0. 65 M的甜菜堿，10 %(體積)的10 XfeiDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 5U/ μ L的feiDNA聚合酶，濃度各為0. SmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)，濃度為4. 6mM的MgSO4 ；各反應管還需加入金黃色葡萄球菌基因組DNA模板液1 μ L，所用金黃色葡萄球菌基因組DNA 模板液的濃度分別為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ LUfg/μ L、0. lfg/μ L，以測試該檢測方法對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度；以上各反應體系的剩余體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件
應用恒溫水浴器，反應條件為先在61°C下反應90min，后在80°C下反應為6min。2. 4、結果觀察
將以上各反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結果。通過對反應產物的電泳分析，當模板DNA液的濃度降至lfg/μ L時，仍可見較為明亮的梯狀電泳條帶。說明本發(fā)明方法對金黃色葡萄球菌DNA的檢測靈敏度為Ifg/μ L。
實施例6 三重LAMP快速檢測的特異性、準確性分析本實施例具體檢測方法為
1、樣品DNA的提取
1. 1、將沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌標準菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯， 360C 士 1°C培養(yǎng)18小時。1. 2、應用QIAGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取以上培養(yǎng)產物中細菌DNA。1. 3、將三組DNA提取液按等體積比例混合，作為最終LAMP檢測模板。2、引物的合成
分別人工合成用于沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌檢測的上下游引物，其中，用于沙門氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 2 所示的核苷酸序列；用于志賀氏菌檢測的上游引物具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；用于金黃色葡萄球菌檢測的上游引物具有如 SEQ No. 5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No. 6所示的核苷酸序列。用于對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的三重LAMP產物進行PCR擴增和測序的引物詳見表1。表1沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌三重LAMP產物測序引物
權利要求
1.一種沙門氏菌的快速檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列。
2.一種志賀氏菌的快速檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
3.一種金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組，其特征是其上游引物具有如SEQ No. 5 所示的序列，其下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。
4.一種使用引物組對沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌進行多重快速檢測的方法，其特征是將沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組和金黃色葡萄球菌的檢測引物組與對待測樣品的DNA進行LAMP反應，反應結束后對反應液進行陰陽性判定，以確定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌中的任一種或任幾種；其中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2 所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如 SEQ No. 5所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征是所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種方案進行第一種方案所述LAMP反應在59. 5-62. 5°C下反應70_110min ；第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟(1)先在59. 5-62. 5°C下反應 70-1 IOmin ；(2)后在80°C下反應6-12min。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征是在進行所述LAMP反應的反應液中，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ M，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ Μ，并且，還包含有濃度為0. 6-0. 7 M的甜菜堿、濃度為3. 8-5. 4mM的MgS04、10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、濃度為 0. 4-0. 6U/ μ L WfeiDNA聚合酶、濃度各為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。
7.一種快速檢測試劑盒，其特征在于包括沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、三種陽性對照品、feiDNA聚合酶、IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、甜菜堿溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、 三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和無菌超純水；所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物具有如SEQ No. 5 所示的序列、下游引物具有如SEQ No. 6所示的序列，所述三種陽性對照品分別為沙門氏菌、 志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的標準菌株的基因組DNA。
8.一種快速檢測試劑盒，其特征在于其LAMP反應液中包含有沙門氏菌的檢測引物組、志賀氏菌的檢測引物組、金黃色葡萄球菌的檢測引物組、甜菜堿、feiDNA聚合酶、 IOXfeiDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸，無菌超純水，所述沙門氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3μΜ，所述志賀氏菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0. 2-0. 3 μ Μ，所述金黃色葡萄球菌的檢測引物組中的上游引物和下游引物的濃度均為0.2-0. 3 μ Μ，所述甜菜堿的濃度為0.6-0. 7 M，MgSO4 的濃度為3. 8-5. 4mM, 10 % (體積)的IOXfeiDNA聚合酶緩沖液，feiDNA聚合酶的濃度為 0. 4-0. 6U/μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 6-1. OmM。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于三種食源性致病菌多重快速檢測法及檢測引物組和試劑盒。沙門氏菌的快速檢測引物組的上游引物具有如SEQNo.1所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.2所示的序列；志賀氏菌的快速檢測引物組的上游引物具有如SEQNo.3所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.4所示的序列；金黃色葡萄球菌的快速檢測引物組的其上游引物具有如SEQNo.5所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.6所示的序列。利用上述檢測引物組對待測樣品中所提取的細菌的基因組DNA，在同一反應體系中進行LAMP反應，通過對反應產物的鑒定來判定樣品中是否含有沙門氏菌、志賀氏菌或金黃色葡萄球菌。各檢測引物組特異性強，能在同一反應體系中準確檢測沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA。
文檔編號C12Q1/68GK102206703SQ201110024340
公開日2011年10月5日 申請日期2011年1月23日 優(yōu)先權日2011年1月23日
發(fā)明者姜侃, 張東雷, 李洪波, 汪新, 金燕飛, 黃建鋒 申請人:李洪波, 浙江省質量技術監(jiān)督檢測研究院