施例7
按照實(shí)施例5的方法轉(zhuǎn)化制備左旋多巴，不同的是，步驟(3)按照以下方式進(jìn)行:配制100mL 0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，ρΗ5.4，加入25g酪氨酸(酪氨酸分5次加入，每2.5h加I次，每次5g)、60g濕細(xì)胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸20g、硫酸銅0.2g,在26°C，pH5.4條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)15h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為24.5g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為90%。色譜條件同實(shí)施例1。
[0045]實(shí)施例8
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806 (市購，下同)的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，32°C，200r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以3%的接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速500?700r/min，溶氧40?50%，溫度30 °C，pH7.0，培養(yǎng)36h，發(fā)酵結(jié)束8000r/min、0°C離心1min收獲濕細(xì)胞197g ；
(3)配制100mL 0.2moINa2HPO4- NaH2PO4緩沖溶液，pH6.0，加入 1g 酪氨酸、50g 濕細(xì)胞混合均勾，再依次加入曲拉通lg、抗壞血酸10g、硫酸銅0.2g，在30°C，pH6.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)8h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為9.6g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為88.2%。色譜條件同實(shí)施例1。
[0046]種子培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖1.2%，蛋白胨0.8%，氯化鈉0.3%，氯化銨0.5%，玉米漿0.8%，豆餅水解液1.5%，水余量，pH7.0o
[0047]發(fā)酵培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖1.5%,氯化銨1%，硫酸鎂0.02%，磷酸二氫鉀0.12%，氯化鈣0.008%，硫酸銅0.03%，玉米漿0.5%，豆餅水解液0.5%，水余量，ρΗ7.0。
[0048]實(shí)施例9
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806 (市購，下同)的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28°C，150r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以5%的接種量接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速500?700r/min，溶氧40?50%，溫度28 °C，pH7.0，培養(yǎng)36h，發(fā)酵結(jié)束8000r/min、0°C離心1min收獲濕細(xì)胞189g ；
(3)配制100mL0.2mol乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH5.4，加入1g酪氨酸、50g濕細(xì)胞混合均勾，再依次加入曲拉通3g、抗壞血酸20g、硫酸銅0.5g，在30°C，pH5.4條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程中間歇弱通風(fēng)，每小時通空氣20min，通氣量為0.3vvm，反應(yīng)8h,取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為9.8g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為90%。色譜條件同實(shí)施例1。
[0049]種子培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖2.0%，蛋白胨0.3%，氯化鈉0.8%，氯化銨0.1%，玉米漿1.2%，豆餅水解液0.5%，水余量，pH7.0o
[0050]發(fā)酵培養(yǎng)基為(wt%):葡萄糖2.5%,氯化銨0.5%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.08%，氯化鈣0.012%，硫酸銅0.01%，玉米漿1.5%，豆餅水解液0.1%，水余量，ρΗ7.0。
[0051]對比例
(1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )ATCC17806 (市購，下同)的菌種斜面接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C，180r/min培養(yǎng)24h，成為一級種子；
(2)將種子液以5%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要參數(shù)控制如下:攪拌轉(zhuǎn)速500?700r/min，溶氧40?50%，溫度30°C，pH7.0，培養(yǎng)36h得發(fā)酵液；(3)將1g酪氨酸直接加入100mL發(fā)酵液中，再加入曲拉通lg、抗壞血酸10g、硫酸銅
0.2g，在30°C，pH5.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)8h，取樣酸溶后HPLC測左旋多巴含量為9.42g/L，對酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為86.5%。色譜條件和培養(yǎng)基同實(shí)施例1。
【主權(quán)項】
1.一種酶法制備左旋多巴的方法，其特征是包括以下步驟: (1)挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )的菌種斜面，接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得一級種子液； (2)將一級種子液以3?10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心，收集菌體細(xì)胞； (3)在緩沖溶液中加入酪氨酸和菌體細(xì)胞，在18?30°C，pH5.0?6.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:步驟(I)中，所述種子培養(yǎng)基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.2-2.0%，蛋白胨0.3-0.8%，氯化鈉0.3-0.8%，氯化銨0.1-0.5%，玉米漿 0.8-1.2%，豆餅水解液 0.5-1.5%，水余量，ρΗ7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.5-2.5%,氯化銨0.5-1%，硫酸鎂0.02-0.05%，磷酸二氫鉀0.08-0.12%，氯化鈣0.008-0.012%，硫酸銅0.01-0.03%，玉米漿0.5-1.5%，豆餅水解液0.1-0.5%，水余量，pH7.0o
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:步驟(I)中，所述種子培養(yǎng)基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，氯化銨0.3%，玉米漿1%，豆餅水解液1%，水余量，ρΗ7.0 ;步驟(2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖2%，氯化銨0.7%，硫酸鎂0.04%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈣0.01%，硫酸銅0.02%，玉米漿1%，豆餅水解液0.3%，水余量，pH7.0o
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征是:步驟(I)中，培養(yǎng)條件為:28-320C，150-200r/min培養(yǎng)24_26h ;步驟(2)中，培養(yǎng)條件為:攪拌轉(zhuǎn)速200?700r/min，溶氧20?50體積％，溫度28-30 °C，培養(yǎng)36_38h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:步驟(3)中，每升緩沖溶液中加入10-25g酪氨酸；每升緩沖溶液中加入40-60g菌體細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征是:步驟(3)中，采用間歇弱通風(fēng)的方式輔助酶促反應(yīng)的進(jìn)行，間歇弱通風(fēng)的方式是指:反應(yīng)過程中每小時通空氣15-20min，通氣量為0.1vvm?0.5vvm0
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征是:步驟(3)中，反應(yīng)8-15h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:步驟(3)中，向發(fā)酵液中加入酪氨酸后，再進(jìn)一步的加入表面活性劑、還原保護(hù)劑和硫酸銅，然后進(jìn)行酶促反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征是:步驟(3)中，表面活性劑在緩沖溶液中的濃度為0.01?0.3wt%,還原保護(hù)劑在緩沖溶液中的濃度為0.1?2wt%，硫酸銅在緩沖溶液中的濃度為0.01?0.lwt%o
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法制備左旋多巴的方法，包括：挑取一環(huán)嗜麥芽假單胞菌菌種斜面，接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得一級種子液；將一級種子液以3～10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后離心，收集菌體細(xì)胞；在緩沖溶液中加入酪氨酸和菌體細(xì)胞，在18～30℃，pH5.0～6.0條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，將酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴。本發(fā)明在轉(zhuǎn)化過程中采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)、優(yōu)選采用間歇弱通風(fēng)技術(shù)，提高了酶的催化效力，左旋多巴濃度可達(dá)27g/L，酪氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，且條件溫和，對映體選擇性高，無消旋作用發(fā)生，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有顯著地經(jīng)濟(jì)效益和工業(yè)應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12R1-38, C12P13-22
【公開號】CN104726513
【申請?zhí)枴緾N201510129123
【發(fā)明人】馮志彬, 王東陽, 蔡傳康
【申請人】山東陽成生物科技有限公司
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月24日