Nk細胞的體外制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種NK細胞的體外制備方法，具體的說，涉及一 種從胚胎干細胞誘導分化制備成NK細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] NK細胞（naturalkillercells)又稱自然殺傷細胞，是一類CD56+，CD3-的淋巴 細胞，是機體內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞，它無需抗原預先致敏即可識別腫瘤及病毒感染 的細胞。它位于機體防御體系的第一道防線，同時它又能通過早期分泌多種細胞因子和趨 化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在腫瘤免疫、清 除非己細胞等方面發(fā)揮重要作用。
[0003] 現(xiàn)階段臨床上獲得NK細胞療法是采用體外培養(yǎng)的方法，把患者自身外周血中的 NK細胞進行擴增，使細胞數(shù)目擴大數(shù)千倍且細胞毒活性極大增強，再回輸患者的體內(nèi)。取自 患者自身的細胞首先限制了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可能性；另外由于外周血中NK細胞的含量低， 僅占外周血淋巴細胞總數(shù)的5%-10%，細胞數(shù)量有限，且目前尚缺乏有效的高純度的體外擴 增體系，所以在很大程度上限制了NK細胞的臨床應(yīng)用，這種傳統(tǒng)的NK細胞制備方法并不 是理想的選擇。首先，它主要用于一對一的個體化治療方法，只能在醫(yī)院床邊開展；第二，這 種治療方法自然殺傷性細胞誘導的時間太長，至少需要6周，對于晚期腫瘤病人，尤其是手 術(shù)后放療、化療的病人，在細胞制備完成或細胞回輸之前可能就已經(jīng)去世；第三，一對一的 治療，即每一個人要做一全套細胞誘導擴增培養(yǎng)的過程，在實驗室管理方面，室內(nèi)質(zhì)量控制 很難，室間質(zhì)量控制更難；第四，很多病人本身的NK細胞就是缺陷的，回輸治療效果有限。
[0004] 目前雖然有大量的研宄集中在尋找不同來源的CD34+細胞向NK細胞誘導分化的 最佳體系，但是尚未有一種方法能夠簡便、高效地得到高純度、高數(shù)量、殺傷能力強的NK細 胞。
[0005] 隨著科研的發(fā)展和進步，利用干細胞誘導分化為NK細胞成為可能，是一個極具吸 引力的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。胚胎干細胞就是其中的佼佼者，胚胎干細胞具有高度的 未分化性以及很強的增殖能力，能夠分化為人體組織的各種細胞。目前，人胚胎干細胞已被 成功地分化為成熟和功能的子集的每一個胚層，包括細胞的造血系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題和不足，提供一種由胚胎干細胞誘導 培養(yǎng)NK細胞的體外制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中NK細胞來源不足、療效限制和難以產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)的問題，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明同時提供了NK細胞的體外制備的誘導培養(yǎng)體系，簡化純化和鑒定細胞產(chǎn) 物的程序，避免病毒污染造成的危害。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種NK細胞的體外制備方法，具體 包括以下步驟： (1)胚胎干細胞的體外培養(yǎng) 采用無飼養(yǎng)層的胚胎干細胞培養(yǎng)體系，胚胎干細胞復蘇后在明膠預處理過的培養(yǎng)皿中 貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d后，消化液消化傳代。
[0009] (2)誘導胚胎干細胞向造血細胞分化 采用基質(zhì)細胞共培養(yǎng)與細胞因子誘導相結(jié)合的方法，胚胎干細胞用2mL分化培養(yǎng)液重 懸后，接種于已經(jīng)預先鋪有OP9細胞的6孔板中，放入37°C、5%C02、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，并添加細胞因子Flt3配體（FL)，白細胞介素-15 (IL-15)，白細胞介素-6 (IL-6)，白 細胞介素-7 (IL-7)，Kit配體（KL)。培養(yǎng)1天，胚胎干細胞形成懸浮的細胞集落，把這些細 胞集落轉(zhuǎn)移到超低吸附培養(yǎng)皿中，并添加上述細胞因子，2-3天后收集細胞。
[0010] (3)免疫磁珠分離純化⑶34+細胞 由于造血干細胞主要分布于⑶34+細胞中，因此采用免疫磁珠法純化⑶34 +造血干細 胞，并用流式細胞儀檢測所分離得到的CD34+細胞純度。
[0011] (4)CD34+細胞的擴大培養(yǎng) 將純化后的⑶34+細胞以1.0X104cells/mL密度接種無血清培養(yǎng)基中，置于37°C、 5%C02、95%飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng)，每7天半量換液。培養(yǎng)液中均含細胞因子：干細胞 因子（SCF)、白細胞介素-3(IL-3)、血小板生成素（TPO)、紅細胞生成素（EPO)和白細胞介 素-6 (IL-6)。培養(yǎng)2-3周收集細胞。
[0012] (5)CD34+細胞誘導分化NK細胞 CD34+細胞擴增至足夠數(shù)量時，用無血清培養(yǎng)基重懸，并添加細胞因子組合①：干細胞 因子（SCF)，人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)和Flt3配體（FL)，37°C、5%CO# 95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后，將細胞轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，添加細胞因子 組合②：白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-12 (IL-12)、白細胞介素-15 (IL-15)、單克隆 抗體anti-CD3(anti-CD3)、白細胞介素-4(IL-4)和白細胞介素-7(IL-7)，放置于37°C， 5%C02、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)誘導NK細胞，每三天換液一次，并補充細胞因子組合②， 誘導4周后流式檢測CD3TD56+NK細胞。
[0013] (6)NK細胞殺傷活性的測定。
[0014] 進一步的，所述的步驟（1)胚胎干細胞的體外培養(yǎng)過程中采用無飼養(yǎng)層的DMEM培 養(yǎng)體系，所述的胚胎干細胞的培養(yǎng)液組成是：DMEM培養(yǎng)基，加入20%Knock0ut血清替代物、 0.ImM2-巰基乙醇、100yg/mLL-谷氨酰胺，1%的非必需氨基酸，1000U/mL的白細胞因子 LIF，0.ImMMEM〇
[0015] 進一步的，所述的步驟（2)誘導胚胎干細胞向造血細胞分化中采用基質(zhì)細胞共培 養(yǎng)與細胞因子誘導相結(jié)合的方法，所用的胚胎干細胞分化培養(yǎng)液組成是：a-MEM培養(yǎng)基， 體積分數(shù)10%Knock0ut血清替代品，100ymol/L硫代甘油（MTG);所用的誘導因子組合為： 5ng/mLFL+ 20ng/mLIL-15 + 20ng/mLIL-6 + 10ng/mLIL-7 +lOng/mLKL。本發(fā)明 采用無血清造血干細胞的培養(yǎng)基，避免異源基因的污染。
[0016] 進一步的，所述的步驟（4)為獲得足夠多的純凈的⑶34+細胞，采用先免疫磁珠分 離純化⑶34+細胞，后擴大培養(yǎng)⑶34+細胞的方法，并且培養(yǎng)過程中采用無血清培養(yǎng)基：MDM 培養(yǎng)基，5X1O_5M0 -巰基乙醇、1%BSA、0. 01mg/mL胰島素、0? 7mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2X10_6M膽 固醇、20mmol/100mLL-谷氨酰胺；擴增培養(yǎng)中所用的因子組合為50ng/mLSCF+ 20ng/mL IL-3 + 4U/mLTPO+ 3U/mLEPO+ 20ng/mLIL-6。
[0017] 進一步的，所述的步驟（5) CD34+細胞誘導分化NK細胞中采用細胞因子多次誘導 的方法來獲取足夠的NK細胞，所用的細胞因子組合①為：30ng/mL SCF+30ng/mL GM-CSF +5ng/mL FL;所用的細胞因子組合②為：10ng/mL IL-2+20ng/mL IL-12+20ng/mL IL-15 + lOng/mL anti_CD3 + 20ng IL-4 + lOng/mL IL_7〇
[0018] 本發(fā)明的制備方法具備以下優(yōu)點： (1)解決NK細胞來源不足的問題，為NK細胞治療提供了新的思路。
[0019] (2)采用無血清培養(yǎng)簡化了純化和鑒定細胞產(chǎn)物的程序，避免了病毒污染造成的 危害。
[0020] (3)在胚胎干細胞定向造血細胞分化階段，首創(chuàng)添加了誘導因子5ng/mLFL、20ng/ mLIL_15、20ng/mLIL_6、10ng/mLIL_7、10ng/mLKL，顯著縮短了誘導培養(yǎng)時間，提高了造 血細胞的活率。
[0021] (4)在造血細胞定向分化為NK細胞階段創(chuàng)造性地進行了二次誘導，在接種階段 添加了誘導因子組合①：30ng/mLSCF、30ng/mLGM-CSF、5ng/mLFL，培養(yǎng)兩天以后，添加誘 導因子組合②：10ng/mLIL-2、20ng/mLIL-12、20ng/mLIL-15、10ng/mLanti-CD3、20ng IL-4、lOng/mLIL-7。經(jīng)過該方法所獲得的NK細胞活性高，能達到97%以上，且NK細胞的 腫瘤殺傷效果顯著。
【附圖說明】
[0022] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本發(fā) 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中： 圖1是NK細胞的體外制備方法的技術(shù)方案實施流程圖。
[0023] 具體實施方法 下面將參考附圖并結(jié)合實施例，來詳細說明本發(fā)明。參照圖1 :NK細胞的體外制備方法 的技術(shù)方案實施流程圖所示，本發(fā)明【具體實施方式】如下： 實施例1胚胎干細胞的體外培養(yǎng)： 1.將液氮中保存的胚胎干細胞與37 °C水浴，快速溶化，細胞懸液由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)。
[0024]2.將上述細胞懸液接種于明膠預處理過的培養(yǎng)皿中，放置于37°C，5%C02、95%飽和 濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d，細胞融合度達到85%-90%后，用消化液消化傳代。
[0025] 3.按照1:3-1:5傳代到新的培養(yǎng)皿中，補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0026] 4.每2-3d用消化液消化傳代。
[0027] 實施例2誘導胚胎干細胞向造血干細胞分化 1.使用前1天將凍存的0P9細胞，以1. 5X105cells/mL細胞濃度接種到預鋪有明膠 的6孔培養(yǎng)板中。
[0028] 2.第2天將胚胎干細胞離心，