一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株nt04y01及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各 種組織和器官內(nèi)部的真菌，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內(nèi)生真菌在植株的地下和 地上部分的任何組織器官都能存在（Faeth&Fagan，2002)。研宄發(fā)現(xiàn)：植物內(nèi)生真菌不僅包 括了互惠共利的和中性的內(nèi)共生真菌，也包括了那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原菌；有的內(nèi)生 真菌能促進(jìn)宿主植物的生長、增強(qiáng)宿主的抗逆性、促進(jìn)宿主植物活性成分的合成和積累，在 提高植物產(chǎn)量和質(zhì)量中可以起到積極作用。因此，內(nèi)生真菌與植物的互作研宄己日益受到 研宄者的關(guān)注，并成為內(nèi)生真菌研宄領(lǐng)域的國際熱點(diǎn)。
[0003] 鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)屬蘭科附生草本植物，是我 國傳統(tǒng)名貴中藥，廣泛運(yùn)用于慢性咽炎、閉塞性周圍血管病、白內(nèi)障、青光眼等疾病的治療 藥方及各種保健品中，市場需求量很大，長期無節(jié)制的采挖造成其資源枯竭，已無野生資源 可用。近年來，鐵皮石斛的人工種植已在浙江、云南等地大規(guī)模開展，成為一個(gè)新興產(chǎn)業(yè)。因 此，研宄篩選具有明顯促生作用的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株，將對(duì)鐵皮石斛的大規(guī)模人工種 植具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種具有明顯促生作用的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01 及其在鐵皮石斛生長中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所提供的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01，在分類學(xué)上屬于叢赤殼屬 (他(^1^&)，命名為他(^1^ &8口.，已于2014年7月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏號(hào)為CCTCCNO.M2014331 ;該菌株的基因組18srDNA堿基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0006] 本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01是采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)從 鐵皮石斛?endrobiumofficinaleKimuraetMigo)植物活體中分離、純化得到。
[0007] 本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01可通過制備成真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基 或生物菌肥應(yīng)用于鐵皮石斛的生長中。
[0008]由本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制備真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基的方法， 包括如下步驟：菌種活化一種子液培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一將發(fā)酵液真空抽濾，將菌絲體與液氮 研磨液與濾液合并后滅菌，得到真菌誘導(dǎo)子一將真菌誘導(dǎo)子接入MS培養(yǎng)基中，即得真菌誘 導(dǎo)子培養(yǎng)基。
[0009] 作為優(yōu)選方案，真菌誘導(dǎo)子按5%?15%體積的量接入MS培養(yǎng)基中。
[0010] 由本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制備生物菌肥的方法，包括如下 步驟：菌種活化一種子液培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一將發(fā)酵液與樹皮粉攪拌混勻，即得生物菌肥。
[0011] 作為優(yōu)選方案，按每50g樹皮粉加5?15mL發(fā)酵液攪拌混勾。
[0012] 作為優(yōu)選方案，上述的菌種活化采用試管斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基（固體PDA)，于28 ± 1°C活化培養(yǎng)72小時(shí)。
[0013] 作為優(yōu)選方案，上述的種子液培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（液體PDA)，于 28±1°C搖床培養(yǎng)72小時(shí)。
[0014] 作為優(yōu)選方案，上述的發(fā)酵培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（液體PDA)，于 28±1°C發(fā)酵培養(yǎng)7天，接種量為5V%?15V%。
[0015] 實(shí)驗(yàn)證明：采用本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制備的真菌誘導(dǎo)子 培養(yǎng)基和生物菌肥均對(duì)鐵皮石斛的生長具有明顯的促進(jìn)作用，可用于鐵皮石斛的人工種植 中，以提高鐵皮石斛的產(chǎn)量，具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01在100倍顯微鏡下觀察到的 菌絲（A)和孢子（B)的形態(tài)圖。
[0017] 圖2為本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01在電子顯微鏡下觀察到的菌 絲形態(tài)圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01在電子顯微鏡下觀察到的孢 子形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0020] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件、實(shí)驗(yàn)室手冊中所 述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01于2014年7月9日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心（湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏號(hào)為CCTCC N0.M2014331 ;該菌株的基因組18srDNA堿基序列如SEQIDNo. 1所示。
[0023] 所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01的固體培養(yǎng)特征為：
[0024] 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基上于28±1°C培養(yǎng)，最初氣生菌絲無色，漸變灰 白色；菌落呈灰白色絨毛狀，邊緣不整齊，近培養(yǎng)基處10天后有淡紫色，菌絲體較發(fā)達(dá)。
[0025] 所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01的液體培養(yǎng)特征為：
[0026] a)培養(yǎng)基PDA，搖瓶培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度28 ± 1°C;
[0027] b)發(fā)酵培養(yǎng)特征：培養(yǎng)第1-2天，未見明顯生長現(xiàn)象；培養(yǎng)第3天，有白色菌絲出 現(xiàn)；培養(yǎng)第4-5天，菌絲增多；培養(yǎng)第6天，形成直徑l-2mm白色菌絲球；培養(yǎng)第7天，菌絲 球增大到2_4mm。
[0028] 本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01的形態(tài)特征為：
[0029] 1、無性世代，菌絲體密集，近樹枝狀，較發(fā)達(dá)，有隔；可側(cè)生短?；驘o梗孢子（囊）， 孢子囊中最多可含8個(gè)孢子。
[0030] 2、有性世代，未發(fā)現(xiàn)。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 1)取本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01菌種，在無菌條件下，用接種針挑 取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管，于28±1°C活化培養(yǎng)72小時(shí)；
[0033] 2)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體PDA種子培養(yǎng)基中， 于28± 1°C、140rpm搖床培養(yǎng)72小時(shí)，得種子液；
[0034] 3)在無菌條件下，按10V% (體積百分比）接種量接入500mL液體PDA培養(yǎng)基中， 于28 ± 1 °C、140rpm搖床培養(yǎng)7天；
[0035] 4)將發(fā)酵液真空抽濾，菌絲體與液氮的研磨液與濾液合并，于121°C滅菌20分鐘， 得到真菌誘導(dǎo)子；
[0036] 5)將真菌誘導(dǎo)子按10%體積的量接入MS培養(yǎng)基中，得到真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基；
[0037] 6)在無菌條件下，接苗于對(duì)照（MS)培養(yǎng)基和真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基中，無菌室培養(yǎng)， 記錄好苗的數(shù)量，根數(shù)目及高度；
[0038] 7)定期觀察，培養(yǎng)6個(gè)月后，對(duì)原球莖、苗進(jìn)行稱重，并計(jì)算增苗棵數(shù)，與對(duì)照組進(jìn) 行組間分析；觀察結(jié)果見表1所示；
[0039] 表1真菌誘導(dǎo)子對(duì)鐵皮石斛苗增殖分化的影響（X土S)
[0040]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01，其特征在于：該菌株在分類學(xué)上屬于叢赤殼 屬，命名為Nectria sp.，已于2014年7月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為 CCTCC N0.M2014331 ;該菌株的基因組18s rDNA堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01在鐵皮石斛生長中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：將鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制備成 真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基或生物菌肥應(yīng)用于鐵皮石斛的生長中。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，由所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制 備真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基的方法包括如下步驟：菌種活化一種子液培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一將發(fā)酵液 真空抽濾，將菌絲體與液氮研磨液與濾液合并后滅菌，得到真菌誘導(dǎo)子一將真菌誘導(dǎo)子接 入MS培養(yǎng)基中，即得真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：真菌誘導(dǎo)子按5%?15%體積的量接入MS 培養(yǎng)基中。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，由所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制 備生物菌肥的方法包括如下步驟：菌種活化一種子液培養(yǎng)一發(fā)酵培養(yǎng)一將發(fā)酵液與樹皮粉 攪拌混勻，即得生物菌肥。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：按每50g樹皮粉加5?15mL發(fā)酵液攪拌混 勻。
8. 如權(quán)利要求4或6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的菌種活化采用試管斜面培養(yǎng)，培 養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于28±1°C活化培養(yǎng)72小時(shí)。
9. 如權(quán)利要求4或6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的種子液培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖 液體培養(yǎng)基，于28 ± 1 °C搖床培養(yǎng)72小時(shí)。
10. 如權(quán)利要求4或6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的發(fā)酵培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖液 體培養(yǎng)基，于28± 1°C發(fā)酵培養(yǎng)7天，接種量為5V%?15V%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01及其應(yīng)用，所述菌株NT04Y01在分類學(xué)上屬于叢赤殼屬，命名為Nectria sp.已于2014年7月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO.M2014331；該菌株的基因組18s rDNA堿基序列如SEQ ID No.1所示。實(shí)驗(yàn)證明：采用本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株NT04Y01制備的真菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)基和生物菌肥均對(duì)鐵皮石斛的生長具有明顯的促進(jìn)作用，可用于鐵皮石斛的人工種植中，以提高鐵皮石斛的產(chǎn)量，具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。CCTCC NO. M201433120140709
【IPC分類】C12R1-645, C05F11-08, C12N1-14
【公開號(hào)】CN104593274
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510044012
【發(fā)明人】黎萬奎, 王莉莉, 馬昭, 唐承晨, 張純, 胡之璧, 王崢濤
【申請(qǐng)人】上海中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月28日