專利名稱:一種發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法。
背景技術(shù)：
由于環(huán)境中硝酸鹽、亞硝酸鹽的大量富集及食品加工中添加化學(xué)合成的亞硝酸鹽，使農(nóng)產(chǎn)品原料、水源、加工食品及飼料中有大量亞硝酸鹽殘留。亞硝酸鹽是一種對(duì)人體有害的物質(zhì)，它不僅使人直接中毒、致死，而且是致癌物亞硝胺的前體。如何安全、快速地降解亞硝酸鹽成為保護(hù)人體健康急需解決的問題?，F(xiàn)在世界各國都在致力于亞硝酸鹽替代物以及降低其殘留研究。但是至今還未找到一種理想的、能夠完全替代亞硝酸鹽的物質(zhì)，世界各國現(xiàn)在都在致力于研究減少肉制品中亞硝酸鹽殘留量的措施。利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸還原酶，可以很好的降解亞硝酸鹽，減少其殘留，在肉制品加工有很廣泛的應(yīng)用前景。
傳統(tǒng)研究認(rèn)為，進(jìn)行亞硝酸鹽降解成NO的細(xì)菌都是兼性厭氧微生物，因?yàn)橹挥性跓o氧條件下，才能誘導(dǎo)出NiR。然而，近幾年人們不斷地發(fā)現(xiàn)好氧條件下發(fā)生也會(huì)發(fā)生亞硝酸鹽的降解，如 Giovanni Vigliotta 等研究發(fā)現(xiàn)一種酵母 Debaryomyceshansenii T0B-Y7能夠在純化學(xué)合成培養(yǎng)基中、在微需氧條件下利用亞硝酸鹽作為唯一氮源，降解亞硝酸鹽的能力伴隨YNIl基因的表達(dá)，該基因?yàn)榫幋a同化NAD(P)H NiR,電子傳遞體的添加有助于NiR的產(chǎn)生。由于好氧條件下微生物體內(nèi)同時(shí)存在呼吸鏈和亞硝酸鹽還原雙重的電子傳遞系統(tǒng)，目前外界環(huán)境的變化對(duì)NiR的生產(chǎn)及電子傳遞的影響還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法。
本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵巨大芽孢桿菌(Bacillus, megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627,得到亞硝酸還原酶。
所述發(fā)酵中包括添加連二亞硫酸鈉的步驟。
所述添加連二亞硫酸鈉的時(shí)機(jī)為從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus,megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627接種在所述發(fā)酵中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，培養(yǎng)8h-18h后，添加所述連二亞硫酸鈉；具體為培養(yǎng)8h、9h、12h、14h、16h或18h后，添加所述連二亞硫酸鈉；所述添加連二亞硫酸鈉的量為每IL所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入(0.005-0.05)mo I 所述連二亞硫酸鈉，具體為 O. 005mol、0. 01mol、0. 02mol 或 O. 05mol。
所述發(fā)酵的方式為以下A或B :
A 1)從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus, megaterium)MPF_906 CGMCC No. I627 接種在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先持續(xù)振蕩培養(yǎng)(14-18) h，具體為14h、16h或18h ；
2)在步驟I的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)(2_6)h，具體為2h、4h 或 6h ；
B 1)從所述將巨大芽孢桿菌(Bacillus, megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627 接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先間隔性振蕩培養(yǎng)8-12h，具體為8h、9h或12h，再持續(xù)振蕩培養(yǎng)(2-8) h，具體為 2h、6h 或 8h ；
2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)(4-6) h，具體為4h、5h 或 6h。
所述發(fā)酵的方式還可以為從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus, megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先間隔性振蕩培養(yǎng)(8_12)h，具體為8h、10h或12h，再持續(xù)振蕩培養(yǎng)(8-12) h，具體為8h、10h或12h。
所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為振蕩培養(yǎng)，且每隔(l_4)h靜置(5_15)min，具體為每隔 lh、2h、3h 或 4h 靜置 5min、IOmin 或 15min ；
所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)中和所述間隔性振蕩培養(yǎng)中的振蕩的速度均為160r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為12mm ；
所述間隔性振蕩培養(yǎng)和所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的溫度均為30°C。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基為將15g葡萄糖、I. 5g牛肉膏、I. 5g蛋白胨、I. 35g磷酸氫二鉀、O. 7g磷酸二氫鉀、Ig氯化鈉、O. 138g亞硝酸鈉、O. Ig MgSO4 ·7Η20、0· Olg MnSO4 .H2O和O. 02gCaCl2 · 2H20溶于水中，用水補(bǔ)至IL ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. O。
所述方法中，在所述發(fā)酵后，收集菌體，超聲破碎所述菌體，收集上清液得到亞硝酸還原酶。
所述超聲的功率為200w ;所述超聲的次數(shù)為90次；所述超聲的方式為間歇10s，
超聲5s。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明的方法發(fā)酵巨大芽孢桿菌(Bacillus,megaterium)MPF-906 CGMCC No. 1627獲得高酶活總體得率的亞硝酸還原酶。該方法是通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加電子供體及厭氧發(fā)酵(間隔性振蕩培養(yǎng))和好氧發(fā)酵(持續(xù)振蕩培養(yǎng))交替進(jìn)行等發(fā)酵條件的選擇與控制著手，獲得了高酶活總體得率的亞硝酸還原酶制備方法，為利用生物技術(shù)降解食品中的亞硝酸鹽打下了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的有益效果為
I.應(yīng)用本發(fā)明提供的通過在發(fā)酵過程中添加電子供體及周期性間歇厭氧發(fā)酵(間隔性振蕩培養(yǎng))而制備亞硝酸還原酶的方法，發(fā)酵最終單位發(fā)酵醪產(chǎn)酶能力得到了顯著提高。
2.由于本發(fā)明所用菌種產(chǎn)生的亞硝酸還原酶具有耐高溫特性，在70-80°C下仍保留很高的酶活。因此有可能將其用于肉類產(chǎn)品加工，極大的降低了亞硝酸鹽的殘留量，保證了肉制品的食用安全，也將促進(jìn)肉類制品加工企業(yè)提高質(zhì)量，具有重要的社會(huì)效益。本發(fā)明用普通的微生物培養(yǎng)手段生產(chǎn)酶，方法簡便，生產(chǎn)周期短(20-36h)。同時(shí)用來減少亞硝酸鹽對(duì)人體的危害，維護(hù)公共食品安全，保證了人民的身體健康，具有重要的社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例I、添加電子供體連二亞硫酸鈉生產(chǎn)亞硝酸還原酶
方法一[0029]一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備
(I)、斜面種子培養(yǎng)基配方營養(yǎng)肉湯粉I. 8%，瓊脂2%，亞硝酸鈉O. 0138%，ρΗ7· O。
(2)、液體種子培養(yǎng)基配方葡萄糖1.5%，蛋白胨0.2%，氯化鈉O. 1%，磷酸氫二鉀 O. 135%，磷酸二氫鉀 O. 07%, MgSO4 · 7Η20 濃度為 O. 01%, MnSO4 · H2O 濃度為 O. 001%,CaCl2 · 2Η20 濃度為 O. 002%, ρΗ7. O。
(3)、發(fā)酵培養(yǎng)基將15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、1.5g蛋白胨、1.35g磷酸氫二鉀、O. 7g磷酸二氫鉀、Ig氯化鈉、O. 138g亞硝酸鈉、O. Ig MgSO4 ·7Η20、0· Olg MnSO4 .H2O和O. 02gCaCl2 · 2H20溶于水，用水補(bǔ)至I升，pH7. O。
2、種子培養(yǎng)將保存于沙土管中的巨大芽孢桿菌(Bacillus, megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627 (本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)CGMCC No. 1627，可商購獲得。活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進(jìn)行。專利公開號(hào)為CN101050433。)接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24h，獲得活化菌種；再將該活化菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)20h，獲得種子培養(yǎng)液。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V : V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C、轉(zhuǎn)速160r/min (飛鴿牌高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)GL-20B ;旋轉(zhuǎn)半徑12mm)下持續(xù)振蕩培養(yǎng)16h后，添加電子供體連二亞硫酸鈉再持續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，所述連二亞硫酸鈉的添加量為在所述I升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加O. 02mol連二亞硫酸鈉，獲得發(fā)酵醪，將發(fā)酵容器中所有的產(chǎn)物記作發(fā)酵醪。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集，將上述發(fā)酵醪在4°C冷凍離心15min(26000Xg)，沉淀菌體用磷酸緩沖液(PH6. 5)重新懸浮，然后再次離心得到菌體。
5、將步驟4提取的菌體細(xì)胞，按IOOOmL發(fā)酵醪的菌體細(xì)胞加IOOmL 50mM磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PH6. 5)，超聲波破碎，超聲波條件為200w，超聲5s，間歇10s，90次。4°C冷凍離心15min(26000Xg)，上清液即為(亞硝酸還原酶)的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
用比濁法測定發(fā)酵結(jié)束后巨大芽孢桿菌的生物量，巨大芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵后的菌體生物量為6. 07X IO6個(gè)/ml。
所述亞硝酸鹽還原酶活性的測定
(I)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
按照GB/T 5009. 33-2003測定。用北京普析儀器廠生產(chǎn)的UV-1900型號(hào)雙光束紫外分光光度計(jì)測定。以亞硝酸鹽的濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)亞硝酸鹽還原酶活性的測定
參照Rosa (Rosa M, et al，2001)的方法，構(gòu)建亞硝酸鹽還原酶的活性測定方法。測定酶活反應(yīng)體系共250 μ L O. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6. 5),0. IM NaCl, O. IM NO2-, O. IMMV (甲基紫晶)，0· IM Na2S2O4,以及一定量酶液。20_36°C水浴中反應(yīng)lOmin，劇烈振蕩終止反應(yīng)。取10 μ L加格利斯試劑顯色，在480-620nm比色法測定亞硝酸鹽的變化。[0045]根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得出亞硝酸還原酶的酶活。
酶活定義每分鐘所還原InmoL亞硝酸鹽所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。酶活單位U/mL發(fā)酵醪。
測定菌體生物量及粗酶液亞硝酸還原酶的酶活。對(duì)照組除了不添加連二亞硫酸鈉外，其余條件均與實(shí)驗(yàn)組相同。方法一獲得的酶得率為144. 8U的酶/ml發(fā)酵醪，對(duì)照組獲得的酶得率為I. 02U的酶/ml發(fā)酵醪，計(jì)算，與對(duì)照組相比，得用本實(shí)施例的方法一發(fā)酵最終單位發(fā)酵醪產(chǎn)酶能力(酶得率)提高了 142倍。
方法二、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與方法一相同。·[0051]2、種子培養(yǎng)與方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C、轉(zhuǎn)速160r/min下持續(xù)振蕩培養(yǎng)14h后，添加電子供體連二亞硫酸鈉再持續(xù)振蕩培養(yǎng)6h，連二亞硫酸鈉的添加量為O. 005mol/L，獲得發(fā)酵醪，將發(fā)酵容器中所有的產(chǎn)物記作發(fā)酵醪。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與方法一相同。
5、超聲破碎與方法一相同。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與方法一相同，結(jié)果與方法一的結(jié)果無顯著差別。
方法三、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與方法一相同
2、種子培養(yǎng)與方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C、轉(zhuǎn)速240r/min下持續(xù)振蕩培養(yǎng)18h后，添加電子供體連二亞硫酸鈉再持續(xù)振蕩培養(yǎng)2h，連二亞硫酸鈉的添加量為O. 05mol/L，獲得發(fā)酵醪。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與方法一相同。
5、超聲破碎與方法一相同。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與方法一相同，結(jié)果與方法一的結(jié)果無顯著差別。
實(shí)施例2、周期性間歇性厭氧發(fā)酵(間歇性振蕩培養(yǎng))生產(chǎn)亞硝酸還原酶
方法一、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)8h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)12h，獲得發(fā)酵醪；所述間歇性培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔3h從搖床上拿下?lián)u瓶靜置15min ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min,旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。
5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同。對(duì)照組除了一直持續(xù)振蕩培養(yǎng)外，其余條件均與實(shí)驗(yàn)組相同。方法一獲得的酶得率為2. 19U的酶/ml發(fā)酵醪，對(duì)照組獲得的酶得率為1.5U的酶/ml發(fā)酵醪，計(jì)算，與對(duì)照組相比，得用本實(shí)施例的方法一發(fā)酵最終單位發(fā)酵醪產(chǎn)酶的酶活提高了 46%。
方法二、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)10h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)10h，獲得發(fā)酵醪；所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔Ih從搖床上拿下?lián)u瓶靜置5min ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min,旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。
5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同。
測定結(jié)果與本實(shí)施例的方法一的結(jié)果無顯著差別。
方法三、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)12h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)8h，獲得發(fā)酵醪；所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔2h從搖床上拿下?lián)u瓶靜置IOmin ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min,旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。
5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同。
測定結(jié)果與本實(shí)施例的方法一的結(jié)果無顯著差別。
實(shí)施例3、添加電子供體連二亞硫酸鈉并進(jìn)行周期性間歇厭氧發(fā)酵(間隔性振蕩培養(yǎng))生產(chǎn)亞硝酸還原酶[0098]方法一、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，發(fā)酵步驟如下
I)在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)8h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)8h，2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加電子供體連二亞硫酸鈉再持續(xù)振蕩培養(yǎng)4h，連二亞硫酸鈉的添加量為O. 02mol/L發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得發(fā)酵醪。
所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔Ih從搖床上拿下?lián)u瓶靜置5min ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。
5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同，結(jié)果與實(shí)施例I的方法一的結(jié)果無顯著差別。
方法二、
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，發(fā)酵步驟如下
I)在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)9h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)6h，
2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加電子供體連二亞硫酸鈉再培養(yǎng)5h，連二亞硫酸鈉的添加量為O. 005mol/L發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得發(fā)酵醪。
所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔3h從搖床上拿下?lián)u瓶靜置IOmin ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。
5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同，結(jié)果與實(shí)施例I的方法一的結(jié)果無顯著差別。
方法三
一、生產(chǎn)亞硝酸還原酶
I、培養(yǎng)基制備與實(shí)施例一的方法一相同。
2、種子培養(yǎng)與實(shí)施例一的方法一相同。
3、將種子培養(yǎng)液以4% (體積百分含量(V/V))的接種量轉(zhuǎn)接到250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中得到發(fā)酵混合物，將發(fā)酵混合物按每個(gè)搖瓶IOOmL分裝，初始pH為7. 0，發(fā)酵步驟如下
I)在30°C先進(jìn)行間隔性振蕩培養(yǎng)12h，再進(jìn)行持續(xù)振蕩培養(yǎng)2h，
2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加電子供體連二亞硫酸鈉再培養(yǎng)6h，連二亞硫酸鈉的添加量為O. 05mol/L發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得發(fā)酵醪。
所述間歇性培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)，且每隔2h從搖床上拿下?lián)u瓶靜置15min ;所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的方式為在搖床上振蕩培養(yǎng)；所述搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為12mm。
4、發(fā)酵醪中的菌體細(xì)胞收集與實(shí)施例一的方法一相同。5、超聲破碎與實(shí)施例一的方法一相同,獲得亞硝酸還原酶的粗酶液。
二、測定菌體生物量及粗酶液中產(chǎn)亞硝酸還原酶的酶活
檢測方法與實(shí)施例I的方法一相同，結(jié)果與實(shí)施例I的方法一的結(jié)果無顯著差別。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)MPF-906CGMCC No. 1627，得到亞硝酸還原酶； 所述發(fā)酵中包括添加連二亞硫酸鈉的步驟； 所述發(fā)酵的方式為以下A或B : A 1)從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627 接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先持續(xù)振蕩培養(yǎng)14_18h ； 2)在步驟I的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)2-6h ； B 1)從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )MPF-906CGMCC No. 1627 接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先間隔性振蕩培養(yǎng)8-12h，再持續(xù)振蕩培養(yǎng)2-8h ； 2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)4-6h ； 所述添加連二亞硫酸鈉的量為每IL所述發(fā)酵培養(yǎng)基中加入O. 005-0. 05mol所述連二亞硫酸鈉； 所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為振蕩培養(yǎng)，且每隔l_4h靜置5-15min。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的方式為以下A或B: A 1)從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627 接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先持續(xù)振蕩培養(yǎng)14h、16h或18h ； 2)在步驟I的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)2h、4h或6h ； B 1)從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)MPF-906CGMCC No. 1627 接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，先間隔性振蕩培養(yǎng)8h、9h或12h，再持續(xù)振蕩培養(yǎng)2h、6h或8h ； 2)在步驟I)的基礎(chǔ)上添加所述連二亞硫酸鈉，繼續(xù)持續(xù)振蕩培養(yǎng)4h、5h或6h。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的方法，其特征在于所述間隔性振蕩培養(yǎng)的方式為振蕩培養(yǎng)，且每隔lh、2h、3h或4h靜置5min、IOmin或15min ； 所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)中和所述間隔性振蕩培養(yǎng)中的振蕩的速度均為160r/min，旋轉(zhuǎn)半徑為 12mm ； 所述間隔性振蕩培養(yǎng)和所述持續(xù)振蕩培養(yǎng)的溫度均為30°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為將15g葡萄糖、1.5g牛肉膏、I. 5g蛋白胨、I. 35g磷酸氫二鉀、O. 7g磷酸二氫鉀、Ig氯化鈉、O. 138g亞硝酸鈉、O. IgMgSO4 · 7Η20、0· Olg MnSO4 · H2O 和 O. 02g CaCl2 · 2H20 溶于水中，用水補(bǔ)至 IL ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于 所述方法中，在所述發(fā)酵后，收集菌體，超聲破碎所述菌體，收集上清液得到亞硝酸還原酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于 所述超聲的功率為200w ;所述超聲的次數(shù)為90次；所述超聲的方式為間歇10s，超聲5s0
專利摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法。本發(fā)明提供的生產(chǎn)亞硝酸還原酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵巨大芽孢桿菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCCNo.1627，得到亞硝酸還原酶。所述發(fā)酵中包括添加連二亞硫酸鈉的步驟。所述添加連二亞硫酸鈉的時(shí)機(jī)為從將所述巨大芽孢桿菌(Bacillus.megaterium)MPF-906 CGMCCNo.1627接種在所述發(fā)酵中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)計(jì)起，培養(yǎng)8h-18h后，添加所述連二亞硫酸鈉。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明的方法發(fā)酵巨大芽孢桿菌(B.megateriumMPF-906)獲得高酶活總體得率的亞硝酸還原酶。
文檔編號(hào)C12R1/11GKCN101914505 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010218066
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2010年6月24日
發(fā)明者劉萍, 張瑩, 孫君社, 胡錦榮, 張京聲, 羅巖 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (3),