專利名稱:一株有機溶劑耐受型假單胞菌及其在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域：
的假單胞菌及其應(yīng)用，尤其涉及的是一種一株有機溶劑耐受型假單胞菌及其在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，全球土壤，水分以及大氣的污染程度越來越嚴重。環(huán)境污染已經(jīng)成為當今世界各國普遍關(guān)注的熱點問題。在各類污染物中，多環(huán)芳烴 (polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)類化合物分布廣泛，危害最為嚴重。環(huán)境中的 PAHs主要來源于石油泄漏，以及煤、石油、木材、有機高分子化合物的不完全燃燒。PAHs穩(wěn)定性強，生物富集率高，潛在毒性大，具有致畸、致癌和致突變等作用。在總數(shù)已達1，000多種的環(huán)境致癌物中，PAHs占了三分之一以上，為數(shù)量最多的一類。美國環(huán)保局(EPA)在上世紀80年代就將16種PAHs列入了優(yōu)先控制的環(huán)境污染物黑名單，我國也已經(jīng)把PAHs列入環(huán)境污染的黑名單。消減PAHs污染對于改善人類生存環(huán)境，提高人類生活質(zhì)量具有重大意義。由于PAHs非常頑固，自然條件下很難通過溫和的化學作用降解，PAHs除了很少一部分發(fā)生光化學分解之外，絕大部分都是通過生物降解途徑從環(huán)境中慢慢消失。因此，利用微生物降解作用加速PAHs轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)的過程被認為是修復(fù)PAHs污染環(huán)境的最佳途徑。目前，人們通過富集培養(yǎng)已經(jīng)分離出許多PAHs降解菌株。但是，對于實際石油污染環(huán)境下的 PAHs降解，微生物面臨復(fù)雜的生存壓力，特別是石油成份作為有機溶劑對細胞的毒性作用。 對微生物的生理研究證明有機溶劑的毒性和它們的油水分配系數(shù)(log P。w)_溶劑在辛醇和水相中的分配系數(shù)的對數(shù)值有關(guān)。溶劑的極性越大，log 值就越小，溶劑毒性也越大。一般認為，log P。w值在1 5之間的有機溶劑在水層(細胞存在于水層)的分配比例較高， 進入細胞膜脂雙層的溶劑含量高，所以對細胞產(chǎn)生的毒性極大。石油污染物大部分為脂溶的疏水性有機物，能破壞細胞膜，危害細胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，導(dǎo)致細胞的破裂死亡。因此，迫切需要尋找能夠耐受有機溶劑的PAHs降解菌株用于增強石油污染環(huán)境的修復(fù)。
有機溶劑耐受菌是一類新的能與有害影響因素競爭并能在高濃度有機溶劑中茁壯生長的微生物。一般來說，由于有機溶劑對細菌有毒性，所以一直以來人們都認為細菌不能在有機溶劑環(huán)境中生存。1989年，Inoue等關(guān)于溶劑耐受性微生物的報道改變了人們對微生物生存能力的認識，自此各國研究者陸續(xù)分離出多種有機溶劑耐受微生物，并發(fā)現(xiàn)了微生物對有機溶劑產(chǎn)生抗性的多種機理，如有機溶劑輸出泵、快速修復(fù)膜、降低膜透性、增加膜嚴密度和降低細胞表面疏水性等，能使細菌設(shè)法避開有害因素。
現(xiàn)有技術(shù)文獻已經(jīng)有關(guān)于能夠以毒性有機溶劑苯乙烯為碳源生長菌株的研究，也有報道通過基因工程改造之后，中國專利號200610044410. 1 ；公開號為1861785 ；名稱為一株可耐受有機溶劑的惡臭假單胞菌及其在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用。該技術(shù)公開了一株可耐受有機溶劑的惡臭假單胞菌，該菌株于2006年1月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學，中國武漢)，保藏中心編號為No.M 206011。本發(fā)明還公開了所述的可耐受有機溶劑的惡臭假單胞菌在雙液相反應(yīng)中的應(yīng)用，其方法包括(1)菌株選擇，( 種子細胞培養(yǎng)，( 制備催化劑細胞，(4)收集催化劑細胞，( 休止細胞制備，(6)在雙液相反應(yīng)中處理樣品，(7)樣品檢測；該菌株具有很強的耐受有機溶劑的能力，且具有較高的降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的能力。有機溶劑耐受菌株也能夠轉(zhuǎn)化毒性有機溶劑甲苯以及進行生物脫硫，然而，有機溶劑耐受菌株對于PAHs的降解未見報道。在石油以及一些工業(yè)污染的環(huán)境中，有機溶劑往往伴隨著多環(huán)芳烴共同存在于污染體系中，大部分細菌能夠通過細胞結(jié)構(gòu)的改變抵抗低濃度、毒性相對較低的有機溶劑。但是一些毒性極強log卩 值為1 5的有機溶劑，例如苯及其烷基衍生物即使在極低的濃度下(0. )也極易導(dǎo)致細胞的死亡。因此，獲得具有能在毒性有機溶劑存在條件下生長的PAHs降解菌株用于污染環(huán)境修復(fù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前存在的降解多環(huán)芳烴的難題和現(xiàn)實的迫切需求，本發(fā)明提供了一株有機溶劑耐受型假單胞菌及其在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的有機溶劑耐受型假單胞菌，該菌名為假單胞菌(I^eudomonas sp.) B6-3，已于2010年4月20日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，其保藏登記號為 CGMCCN0. 3758。
所述的假單胞菌O^seudomonas sp. )B6_3，來源于化工廠被PAHs污染的土壤，經(jīng)
富集培養(yǎng)、分離得到。
所述的假單胞菌(Pseudomonas sp. ) B6-3，該菌株菌落呈亮白色、圓形、邊緣整齊、 光滑濕潤，該菌株為革蘭氏陰性，桿狀，端部有鞭毛，具有過氧化物酶、乙醇脫氫酶、氧化酶活性，不能產(chǎn)生硝化反應(yīng)，無尿素酶、明膠水解酶的活性。該菌株的脂肪酸類型與熒光假單胞菌 A 型(Pseudomonas fluorescens biotype A)的相似度最高,為 0. 957。
本發(fā)明所述的有機溶劑耐受型假單胞菌(Pseudomonas sp. )B6_3在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用，所述假單胞菌O^eudomonas sp.)B6-3在無機鹽培養(yǎng)基中利用聯(lián)苯為唯一碳源生長后能夠同時降解含有芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并(l，2，3-cd)芘的多環(huán)芳烴混合物。
其中，上述假單胞菌(Pseudomonas sp. )B6_3富集培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基。所述無機鹽培養(yǎng)基的配方是每1，OOOrnl去離子水中含有K2HPO4 ·3Η20 5. 2g ； ΚΗ2Ρ043· 7g ；Na2SO4L Og ；MgSO4 · 7h20 0. 2g ；NH4Cl 2. Og ；微量金屬鹽溶液 Iml ；其中， 所述微量金屬鹽溶液配方為1000ml去離子水中含有!^eCl2 · 4H20 0. 3g, CoCl2 · 6H20 0. 038g，MnCl2 · 4H20 0. 02g, ZnCl2 0. 014g, H3BO3 0. 0124g, Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 04g, CuCl2 · 2H200. 0034g。
其中，所述無機鹽培養(yǎng)基中加入的唯一碳源是聯(lián)苯，其濃度為2. 4g/L。富集培養(yǎng)、 分離菌株時加入聯(lián)苯固體5g/L。
其中，所述假單胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3的培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30°C，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200rpm。
本發(fā)明提供的假單胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3能夠以聯(lián)苯為唯一碳源生長，能夠耐受有機溶劑，并且能夠降解13種EPA規(guī)定優(yōu)先控制PAHs混合物。
本發(fā)明所提供的菌株假單胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3能夠利用聯(lián)苯為唯一碳源生長，將聯(lián)苯礦化為ω2和H20。在純培養(yǎng)條件下，該菌株能在20h內(nèi)將無機鹽培養(yǎng)基中 2. 4g/L的聯(lián)苯降解90%以上，菌液的濁度由OD620為0. 14增加到最大值2. 06。
本發(fā)明所提供的菌株假單胞菌(I^eudomonas sp. ) B6-3能夠耐受log P。w值為2. 5 體積比為20%的有機溶劑甲苯OO%為甲苯和LB培養(yǎng)基體積比)，在體積比高達100% (有機溶劑和LB培養(yǎng)基的體積比)的對二甲苯(log P。w*3. 1)中能夠生長良好。添加體積比 1 4%的柴油能夠促進假單胞菌B6-3在無機鹽培養(yǎng)基中利用聯(lián)苯生長，更高濃度的柴油只是略微抑制假單胞菌B6-3的生長。
所述的LB培養(yǎng)基的配方為每1，OOOml去離子水中含有酵母膏5g ；蛋白胨5g ； NaCllOg ；用NaOH溶液調(diào)pH值為7. 0。
本發(fā)明所提供的菌株假單胞菌(I^eudomonas sp. )B6_3在無機鹽培養(yǎng)基中利用聯(lián)苯為唯一碳源生長后能夠同時降解13種美國國家環(huán)保局(EPA)公布的優(yōu)先消減的多環(huán)芳烴混合物，包括芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(a) 芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并(l，2，3-cd)芘。利用OD62tl為5.0的細胞懸液，5 天內(nèi)，芴和蒽的降解率達到100%，同時，上述其它多環(huán)芳烴的降解率介于48. 8%到76. 8% 之間。在石油以及一些工業(yè)有機物污染的環(huán)境中，有機溶劑往往伴隨著PAHs共同存在于污染體系中，以往報道的PAHs降解菌株在這種有機溶劑毒性的環(huán)境下很難存活，往往達不到修復(fù)PAHs污染的效果。本發(fā)明與現(xiàn)有的PAHs降解菌株相比，具有耐受有機溶劑的特點，這對于PAHs降解菌株在環(huán)境修復(fù)中的實際應(yīng)用更具優(yōu)勢。


圖1為假單胞菌(I^eudomonas sp. )B6_2脂肪酸分析的氣相色譜圖；
其中圖中各個峰對應(yīng)的脂肪酸標注在表1中。
表1 圖1中各個峰對應(yīng)脂肪酸的鑒定、分析結(jié)果
保留時間(min)脂肪酸名稱相對含量(％)1. 621Solvent peak3. 13110:10. 124. 22610:030H3. 264. 76112:02. 675. 324unknown0. 076. 16212:020H4. 106. 54412:030H3. 86
5
權(quán)利要求
1.一株有機溶劑耐受型假單胞菌，其特征在于，該菌名為假單胞菌I3Seudomonas sp. B6-3, 已于2010年4月20日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏登記號為CGMCC NO. 3758。
2.一種如權(quán)利要求
1所述假單胞菌在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的應(yīng)用，其特征是，所述假單胞菌(Pseudomonassp.)B6_3在無機鹽培養(yǎng)基中利用聯(lián)苯為唯一碳源生長后能夠同時降解含有芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并(a) 蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(k)熒蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)茈、茚并 (1,2,3-cd)芘的多環(huán)芳烴混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征是，所述假單胞菌(Pseudomonassp.)B6_3的培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為200rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征是，所述無機鹽培養(yǎng)基的配方是每1，OOOml去離子水中含有 I^2HPO4 · 3H20 5. 2g ；ΚΗ2Ρ043· 7g ；Na2SO4L Og ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；NH4C12. Og ； 微量金屬鹽溶液Iml ；其中，所述微量金屬鹽溶液配方為1000ml去離子水中含有 FeCl2 · 4H20 0. 3g, CoCl2 · 6Η200· 038g, MnCl2 · 4H20 0. 02g, ZnCl2O. 014g, H3BO3O. 0124g, Na2MoO4 · 2H200. 04g, CuCl2 · 2H20 0. 0034g。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的應(yīng)用，其特征是，所述唯一碳源聯(lián)苯的濃度為2.4g/L。
專利摘要
本發(fā)明公開了一株有機溶劑耐受型假單胞菌，該菌名為假單胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，已于2010年4月20日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，其保藏登記號為CGMCC NO.3758。本發(fā)明還公開了所述假單胞菌在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。本發(fā)明的假單胞菌B6-3具有很強的有機溶劑耐受能力，可耐受log Pow在2.5-5.6之間的高毒性有機溶劑，可在有機溶劑的脅迫下利用聯(lián)苯為唯一碳源生長；能夠降解13種美國國家環(huán)保局(EPA)規(guī)定優(yōu)先消減的多環(huán)芳烴(PAHs)。本發(fā)明的假單胞菌B6-3在有機溶劑和多環(huán)芳烴共存的極端污染環(huán)境的修復(fù)處理方面具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GKCN101955896 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010203344
公開日2012年2月1日 申請日期2010年6月18日
發(fā)明者唐鴻志, 李慶剛, 殷光波, 王曉玉, 許平, 陶飛, 馬翠卿 申請人:上海交通大學導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),