專利名稱:一種耐受高濃度丙酮酸及低pH的酵母菌及選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高耐受性的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)，特別涉及一 株耐受高濃度丙酮酸及低PH脅迫的光滑球擬酵母；本發(fā)明還涉及到一種選育高耐受性的 光滑球擬酵母的方法，特別涉及選育高濃度丙酮酸及低PH耐受性光滑球擬酵母的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸從50年代起開始研究，取得不少成果。采用發(fā)酵過程優(yōu)化和代 謝工程改造原理，以丙酮酸高產(chǎn)量，高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度相統(tǒng)一為目標(biāo)，對多重營養(yǎng)缺陷型 菌株T. glabrata生產(chǎn)丙酮酸的發(fā)酵過程進(jìn)行了大量優(yōu)化和改造的研究工作，使丙酮酸產(chǎn) 量大幅度提高。但隨著丙酮酸產(chǎn)量的提高，隨之而來的問題是酵母對于低PH值和高濃度丙 酮酸的敏感性。
通常來說，在有機(jī)酸發(fā)酵過程中，為了維持發(fā)酵體系pH處于最適范圍而流加一定 量NaOH等堿性物質(zhì)，且隨著NaOH等流加，導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓不斷升高；而發(fā)酵液中滲透壓 達(dá)到一定濃度時，細(xì)胞進(jìn)一步積累有機(jī)酸的能力和速度將逐漸下降，難以達(dá)到最大理論產(chǎn) 量。盡管生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離組合技術(shù)能提高生物反應(yīng)過程性能和效率，但該方法的適用 范圍和高額的設(shè)備費(fèi)用限制了其在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。為進(jìn)一步提高丙酮酸產(chǎn)量和 產(chǎn)率，需要降低發(fā)酵過程中丙酮酸的抑制或提高細(xì)胞耐低pH脅迫能力。
適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)(Adaptive evolution)是近幾年來飛速發(fā)展的提高菌株在環(huán)境 脅迫條件下耐受性的一種育種技術(shù)，如高滲透壓，氧脅迫，高底物濃度，高乙醇等。本發(fā)明通 過適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)(Adaptive evolution)提高光滑球擬酵母對高濃度丙酮酸，低pH脅迫 耐受性，取得了出人意料的效果，對丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)有著極其重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高濃度丙酮酸及低pH條件下耐受性的光 滑球擬酵母ijorulopsis glabrata WSH501)，于2010年3月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010061,地址中國武漢，武漢大學(xué)。
光滑球擬酵母CCTCC M 2010061在低pH(pH彡5. 5)條件下，發(fā)酵結(jié)束后菌體量和丙酮酸產(chǎn)量都有明顯提高。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種選育上述光滑球擬酵母 (Torulopsis glabrata)的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為以光滑球擬 酵母(Torulopsisglabrata)CCTCC M 202019為出發(fā)菌株，將其在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù) 生長期，置于含20g/L丙酮酸鈉、pH為4. 5的進(jìn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，通過恒化培養(yǎng)系統(tǒng)， 按照稀釋率0. ItT1流加添加20g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH降到4. 0時， 按照稀釋率0. Ih-1流加含30g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH升高至4. 3時 停止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的PH降到4. 0時，按照稀釋率0. Ir1流加含40g/L丙酮酸鈉的進(jìn) 化培養(yǎng)基至4. 3時停止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH再次降到4. 0時，按照稀釋率0. ItT1流加含50g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基至pH 4. 3時停止流加。
所述恒化培養(yǎng)是通過控制培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)，主要是生長限制因子的濃度，來調(diào) 控微生物生長繁殖與代謝速度的連續(xù)培養(yǎng)方式。以恒定的速率流入營養(yǎng)物質(zhì)，以恒定的速 率流出培養(yǎng)液，從而保證了培養(yǎng)基化學(xué)成分的穩(wěn)定，使培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物始終保持穩(wěn)定 的生長速度。
所述恒化培養(yǎng)的裝置稱為恒化器，購自New Brunswick公司，大小為1. 3L，裝液量 為 0. 7L，型號為 M1273-0054。
所述添加丙酮酸鈉代替添加丙酮酸的原因，丙酮酸為酸性物質(zhì)，會降低培養(yǎng)基pH， 而且根據(jù)丙酮酸的PKa值，當(dāng)pH為4. 0-4. 5之間，培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉會大部分變成丙酮 酸的形式，即可選擇耐受高濃度丙酮酸的菌株。
所述種子培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 1，MgSO4 ·7Η20 0. 5 ；斜面 培養(yǎng)基添加瓊脂20，pH 5.5。
所述進(jìn)化培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖20，(NH4)2S047，MgSO4 · 7H20 0. 8，KH2P045， CH3COONa 5，微量元素液10mL，維生素液10mL，pH 4. 5，丙酮酸鈉濃度根據(jù)要求添加。
所述基本發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖100，(NH4) 2S047，MgSO4 ·7Η20 0. 8，ΚΗ2Ρ045， CH3COONa 5，微量元素液10mL，維生素液10mL，pH 5. 5 ；搖瓶發(fā)酵用40g/L CaCO3作為pH緩 沖劑。
所述微量元素液為=CaCl2·2Η20 2g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 2g, ZnCl2O. 5g，MnCl2 · 4H20 12g， CuSO4 · 5H20 0. 05g,2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至1L。
所述微生素液為煙酸80mg，硫胺素0. 15mg,吡哆醇40mg，生物素％ig，核黃素 10mg,2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至1L。
細(xì)胞干重的測定方法取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌 懸液中的碳酸鈣，用去離子水定容至10mL，搖勻；用UV 7500型可見分光光度計(jì)，于660nm 處比色測OD值，用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線算得細(xì)胞干重。
丙酮酸濃度的測定采用Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、視 差折光檢測器和工作站)，色譜柱采用C18柱，5 μ m，4. 6mmX 250mm ；流動相0· 1 % H3PO4 ； 流速lmL/min、柱溫J8°C、進(jìn)樣量10 μ L、紫外檢測器波長215nm。
樣品處理方法5mL發(fā)酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液移入試管中以備測 丙酮酸用。測丙酮酸時，取ImL上清液移入50mL容量瓶中，去離子水定容至刻線，經(jīng)0. 45 μ m 濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。
本發(fā)明提供的耐受丙酮酸及低pH脅迫的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) 在低pH(4.3-5.5)脅迫條件下，比出發(fā)菌株具有更好生長性能與丙酮酸產(chǎn)量。本發(fā)明提供 的選育方法，簡單易行，對操作人員專業(yè)素質(zhì)要求低。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1光滑球擬酵母(T. glabrata)的選育方法
1、出發(fā)菌株
出發(fā)菌株為光滑球擬酵母(T. glabrata) CCTCC M 202019，煙酸(NA)、生物素 (Bio)、硫胺素餌)、吡哆醇(Pdx)等四種維生素營養(yǎng)缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為本研究室選育菌株，該菌種已申請中國專利，申請?zhí)枮?2113142. 2，公開號為 CN1392246A0
2、選育方法
以光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M 202019為出發(fā)菌株，將其在種 子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，置于含20g/L丙酮酸鈉、pH為4. 5的進(jìn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h 后，通過恒化培養(yǎng)系統(tǒng)，按照稀釋率0. Ih-1流加添加20g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng) 體系中的PH降到4. O時，按照稀釋率0. ItT1流加含30g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng) 體系中的PH升高至4. 3時停止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH降到4. 0時，按照稀釋率0. ItT1 流加含40g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基至4. 3時停止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH再次降到4. 0 時，按照稀釋率0. Ir1流加含50g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基至pH 4. 3時停止流加。
當(dāng)培養(yǎng)體系中丙酮酸鈉濃度達(dá)到50g/L，取樣經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于含有pH為4. 5， 丙酮酸鈉含量為50g/L的葡萄糖平板上。挑選單菌落，經(jīng)pH為4. 5條件下發(fā)酵，根據(jù)菌濃 和丙酮酸產(chǎn)量選擇一株菌濃和丙酮酸產(chǎn)量都最高的進(jìn)化突變菌。
實(shí)施例2 —種耐受高丙酮酸濃度及低pH脅迫的光滑球擬酵母
—種耐受高丙酮酸濃度及低pH脅迫的光滑球擬酵母，分類學(xué)命名為光滑球擬酵 母(Torulopsis glabrata)，保藏編號為CCTCC M 2010061，于2010年3月23日保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心。
實(shí)施例3發(fā)酵產(chǎn)丙酮酸
1、菌種活化
將出發(fā)菌株光滑球擬酵母(T. glabrata) CCTCC M 202019及選育到的菌株CCTCC M2010061，先轉(zhuǎn)斜面在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。
2、種子培養(yǎng)
挑取活化后的單菌落接種到種子培養(yǎng)基，300C，200rpm下培養(yǎng)Mh。
3、搖瓶培養(yǎng)
以10%的接種量將種子分別轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，pH分別設(shè)定為5. 5,4. 7,4. 3，以鹽 酸作為PH調(diào)節(jié)劑，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)48h。發(fā)酵結(jié)束后測定菌體濃度及丙酮酸產(chǎn) 量，結(jié)果如表1所示。
表1菌體濃度及丙酮酸濃度測定
pH值丙酮酸含量(g·!/1)菌體濃度(g·!/1)CCTCC M 202019CCTCC M 2010061CCTCC M 202019CCTCC M 20100615.548.355.812.115.34.723.735.975.69.064.310.118.52.917.2
在pH分別為5. 5,4. 7,4. 3的條件下，最終選育得到的菌株CCTCC M 2010061，菌 體濃度分別比出發(fā)菌株提高了 26. 4%,61. 8%和137. 5%；丙酮酸產(chǎn)量分別比出發(fā)菌株提高 15. 5%,51. 8%和 83. 2%。
權(quán)利要求
1.一種光滑球擬酵母，其分類學(xué)命名為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)，在低 pH(pH彡5. 5)條件下，發(fā)酵結(jié)束后菌體量和丙酮酸產(chǎn)量都有明顯提高，于2010 3月23日保 藏于中國典型微生物菌種保藏中心，保藏編號為CCTCC M2010061。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的光滑球擬酵母，其特征在于在PH4. 3-5. 5條件下培養(yǎng)，生 物量達(dá)到7. 2g/L-15. 3g/L，丙酮酸產(chǎn)量達(dá)到18. 5g/L_55. 8g/L。
3.權(quán)利要求
1所述光滑球擬酵母的選育方法，其特征在于，以光滑球擬酵母 (Torulopsisglabrata)CCTCC M202019為出發(fā)菌株，將其在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長 期，置于含20g/L丙酮酸鈉、pH為4. 5的進(jìn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，通過恒化培養(yǎng)系統(tǒng)，按 照稀釋率0. ItT1流加含20g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH降到4. O時，按 照稀釋率0. Ih-1流加含30g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH升高至4. 3時停 止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的PH再次降到4.0時，按照稀釋率0. ItT1流加含40g/L丙酮酸鈉的 進(jìn)化培養(yǎng)基至PH4. 3時停止流加；當(dāng)培養(yǎng)體系中的pH再次降到4. 0時，按照稀釋率0. Ih-1 流加含50g/L丙酮酸鈉的進(jìn)化培養(yǎng)基至pH 4. 3時停止流加。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3述光滑球擬酵母的選育方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基(g/L) 為葡萄糖30，蛋白胨10，KH2PO4 LMgSO4 ·7Η20 0. 5 ；斜面培養(yǎng)基添加瓊脂20g/L, pH 5. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述光滑球擬酵母的選育方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 為葡萄糖 100，NH4SO4 7,MgS04 ·7Η20 0.8，KH2PO4 5，CH3COONa 6，微量元素液 10mL，維生素 液10mL，pH 5. 5 ；搖瓶發(fā)酵用40g/LCaC03作為pH緩沖劑；上罐發(fā)酵用8mol/LNa0H或2mol/ LHCl維持適當(dāng)pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求
3所述光滑球擬酵母的選育方法，其特征在于所述進(jìn)化培養(yǎng)基(g/L) 為葡萄糖 20，(NH4)2SO4 7, MgSO4 ‘ 7H20 0.8, KH2PO4 5，CH3COONa 5，微量元素液 10mL，維生 素液10mL，丙酮酸鈉濃度根據(jù)要求添加，調(diào)節(jié)pH至4. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求
5所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成，其特征在于所述微量元素液為 CaCl2 · 2H202g, FeSO4 · 7H202g, ZnCl2 0. 5g, MnCl2 · 4H20 12g, CuSO4 · 5H20 0. 05g，2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至1L。
8.根據(jù)權(quán)利要求
5所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成，其特征在于所述維生素液為煙酸SOmgjt 胺素0. 15mg,吡哆醇40mg，生物素％ig，核黃素10mg，2mol/L HCl溶解后用去離子水定容至 1L。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種耐受高濃度丙酮酸及低pH的酵母菌及選育方法，屬于菌種選育領(lǐng)域。本發(fā)明采用適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)(Adaptive evolution)，將光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019在低pH 4.5條件下通過恒化培養(yǎng)系統(tǒng)漸進(jìn)性的增加高濃度丙酮酸鈉脅迫強(qiáng)度，獲得一株耐高濃度丙酮酸、低pH脅迫的進(jìn)化菌株。在pH分別為5.5，4.7，4.3的條件下，丙酮酸產(chǎn)量分別為55.8g·l-1，35.97g·l-1和18.5g·l-1，比出發(fā)菌株分別提高了15.5％(48.3g·l-1)，51.8％(23.7g·l-1)和83.2％(10.1g·l-1)。本發(fā)明克服了酵母對于低pH值和高濃度丙酮酸的敏感性，在丙酮酸的生產(chǎn)中有重大意義。
文檔編號C12R1/645GKCN102051334SQ201010181344
公開日2011年5月11日 申請日期2010年5月25日
發(fā)明者劉立明, 周景文, 汪軍, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan