一株耐重金屬的多環(huán)芳烴降解菌、組合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一株耐重金屬的多環(huán)芳烴降解菌、組合物 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤是污染物的源和匯，隨著工業(yè)化進(jìn)程的加速，土壤污染的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。當(dāng)前 環(huán)境中無(wú)機(jī)污染物及有機(jī)污染物復(fù)合存在的現(xiàn)象較為普遍。復(fù)合污染場(chǎng)地中的無(wú)機(jī)污染主 要是重金屬元素含量超標(biāo)，而這些重金屬主要是汞、鎘、鉻、銅、鋅、鉛、鎳、砷、硒等。復(fù)合污 染場(chǎng)地中有機(jī)污染物主要包括有機(jī)氯農(nóng)藥（OCPs)、多環(huán)芳烴（PAHs)、多氯聯(lián)苯（PCBs)、鄰 苯二甲酸醋（PAEs)等。其中多環(huán)芳徑（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是土 壤中一類典型的持久性有機(jī)污染物，具有致癌、致畸、致突變的"三致"作用。多環(huán)芳烴具有 生物累積性，可以通過(guò)食物鏈和食物網(wǎng)威脅到生態(tài)安全和人體健康。早在上世紀(jì)八十年代， 美國(guó)環(huán)保局（USEPA)將16種PAHs列為環(huán)境中優(yōu)先監(jiān)控的污染物。
[0003] 如上所述，土壤中重金屬污染、有機(jī)物污染及兩者復(fù)合污染的現(xiàn)象越來(lái)越普遍。當(dāng) 前已有較多的重金屬耐受菌或多環(huán)芳烴降解菌從污染場(chǎng)地中被篩選分離出來(lái)，但能耐受重 金屬同時(shí)又具備多環(huán)芳烴降解能力的微生物則少有報(bào)道。因此，針對(duì)重金屬及多環(huán)芳烴復(fù) 合污染場(chǎng)地中多環(huán)芳烴的的去除，同時(shí)具有良好的重金屬耐受性及高效多環(huán)芳烴降解能力 微生物的篩選、分離至關(guān)重要。
[0004] 當(dāng)前已分離到較多的多環(huán)芳烴降解菌，但針對(duì)實(shí)際的多環(huán)芳烴污染和老化嚴(yán)重的 場(chǎng)地，因多環(huán)芳烴生物有效性低而難以被功能微生物利用而去除，使得微生物修復(fù)技術(shù)在 此類場(chǎng)地中的運(yùn)用受限制。表面活性劑是一類能顯著降低界面張力的物質(zhì)，對(duì)難溶有機(jī)化 合物（HOCs)具有增溶的作用，因此可向土壤中添加表面活性劑"活化"老化的多環(huán)芳烴。因 此，具有良好的重金屬耐受性及高效多環(huán)芳烴降解能力微生物在表面活性劑協(xié)同作用下去 除污染場(chǎng)地中的多環(huán)芳烴是針對(duì)解決上述有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合污染土壤中多環(huán)芳烴去除的一種 可行的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能耐受重金屬的多環(huán)芳烴降解菌。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一株耐重金屬的多環(huán)芳烴降解菌，其特征在于，所述 菌株為淺黃分枝桿菌保藏號(hào)為CGMCC No. 10941。
[0007] 進(jìn)一步，所述降解菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 進(jìn)一步，所述重金屬為(^11、0(1、？13、211、48中的一種或一種以上。
[0009] 進(jìn)一步，所述多環(huán)芳烴為萘、芴、菲、蒽、熒蒽、芘中的一種或一種以上。
[0010] 另一方面，本發(fā)明保護(hù)所述耐重金屬的多環(huán)芳烴降解菌用于去除或降解多環(huán)芳烴 的用途。
[0011] 進(jìn)一步，所述用途是指去除或降解土壤、水環(huán)境中的多環(huán)芳烴的用途。
[0012] 進(jìn)一步，所述土壤、水為重金屬污染的土壤、水。
[0013] 另一方面，本發(fā)明保護(hù)所述耐重金屬的多環(huán)芳烴降解菌在多環(huán)芳烴污染的土壤、 水環(huán)境中生物修復(fù)中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步，所述土壤、水有多環(huán)芳烴或重金屬和多環(huán)芳烴復(fù)合污染。
[0015] 另一方面，本發(fā)明還保護(hù)一種菌株組合物，其特征在于，由菌株CGMCC No. 10941和 表面活性劑Brij 30組成； 優(yōu)選的，所述菌株補(bǔ)充保藏信息和表面活性劑Brij 30的用量為，表面活性劑Brij 30 在土壤懸液中含量為10_30g/L，游離菌MI的添加量為以IO9-IO11 CFU/g 土壤的接種量接 種所述菌株。
[0016] 另一方面，本發(fā)明保護(hù)一種去除污染土壤中多環(huán)芳烴去除的方法，其特征在于，采 用表面活性劑Brij 30協(xié)同菌株CGMCC No. 10941去除污染土壤中的多環(huán)芳烴優(yōu)選的，所 述菌株CGMCC No. 10941和表面活性劑Brij 30的用量為，表面活性劑Brij 30在土壤懸液 中含量為10_30g/L，游離菌MI的添加量為以IO9-IO11 CFU/g 土壤的接種量接種所述菌株。
[0017] 本發(fā)明所述菌株的菌落橘黃色，圓形，表面凸起，干燥，不透明，邊緣整齊。菌體呈 短桿狀，0.4 μL? X 0.8 - 1.5 μL?，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽(yáng)性(見(jiàn)圖1和圖2)。能夠 利用葡萄糖酸鉀和甘露醇為碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露醇產(chǎn)酸，過(guò)氧化氫酶、脲 酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，β -半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)陰性，吐溫80水解陽(yáng)性，七葉苷水解、明 膠水解陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，45°C不能生長(zhǎng)。菌株16srDNA測(cè)序序列如SEQ ID NO: 1所示， 測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。經(jīng)過(guò)NCBI BLAST比對(duì)，同源性為99%。
[0018] 在初始含量均為50mg/L的萘、苊、二氫苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并芘9中多環(huán)芳 烴中，本發(fā)明所述菌株不能降解其中的苊、二氫苊、苯并芘，但菌株對(duì)萘、芴、菲、蒽、熒蒽、芘 在第四天和第八天均能對(duì)進(jìn)行有效降解。本發(fā)明所述菌株具有廣泛的底物廣譜性。
[0019] 本發(fā)明所述菌株對(duì)初始濃度50mg/L的芘在第4天降解率可達(dá)57. 85%，第9天時(shí)可 達(dá) 96. 76%。
[0020] 本發(fā)明所述菌株對(duì)多環(huán)芳烴具有較高的耐受濃度。對(duì)于初始濃度分別為50、75、 100、200mg/L的芘，接種等量的本發(fā)明所述菌株，在相同時(shí)間內(nèi)，隨著培養(yǎng)體系中芘含量的 增加，菌株對(duì)芘的去除量增加，由此表明在所實(shí)驗(yàn)的濃度中，菌株能適應(yīng)環(huán)境中含量高達(dá) 200mg/L 的芘。
[0021] 本發(fā)明所述菌株在Cu2+濃度為5-100 mg/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好； 本發(fā)明所述菌株在Cd2+濃度為0. 5-50 mg/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好； 本發(fā)明所述菌株在Pb2+濃度為1-500 mg/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好； 本發(fā)明所述菌株在Zn2+濃度為0. 5-100 mg/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好； 本發(fā)明所述菌株在As3+濃度為0. 5-ImM/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好； 本發(fā)明所述菌株在As5+濃度為2. 5-10 mM/L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好。
[0022] 綜上，本發(fā)明的菌株在 5-100 mg/L Cu2+;0. 5-50 mg/L CM 2+，1-500 mg/L Pb2+， 0. 5-100 mg/L Zn2+，0. 5-lmM/L As3+; 2. 5-10 mM/L As5+濃度中生長(zhǎng)良好，即菌株對(duì)上述重 金屬具有良好的耐受性。
[0023] 所述菌株保藏信息： 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC ; 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所； 保藏日期：2015年6月1日； 保藏編號(hào)：CGMCC No. 10941。
[0024] 保藏菌株分類命名為：淺黃分枝桿菌價(jià)7_?。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是IcoAacteria? gi/ra?生長(zhǎng)于LB平板形態(tài)圖。
[0026] 圖2是IcoAacteria?F礙掃描電鏡圖(放大5000倍)。
[0027] 圖3是菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
[0028] 圖4是gi/ra?菌株降解多環(huán)芳徑的底物廣譜性試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0029] 圖5是gi/ra?菌株對(duì)花的降解試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0030] 圖6是gi/ra?菌株對(duì)培養(yǎng)液中不同初始含量的花去除量試驗(yàn)結(jié) 果圖。
[0031] 圖7是IcoAacieria? gi/ra?菌株在不同濃度Cu 2+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0032] 圖8是i(rcoAacieritt? gi/ra?菌株在不同濃度CM2+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0033] 圖9是i(rcoAac ieria? gi/ra?菌株在不同濃度Pb2+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0034] 圖10是i(rcoAac ieria? gi/ra?菌株在不同濃度Zn2+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0035] 圖11是gi/ra?菌株在不同濃度As 3+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0036] 圖12是gi/ra?菌株在不同濃度As 5+中的生長(zhǎng)曲線圖。
[0037] 圖13是添加表面活性劑后gi/ra?菌株對(duì)16 EPA-PAHs的去除效 率圖。
[0038] 圖14是添加表面活性劑后i(rco6ac ?eriw?價(jià)7 菌株對(duì)花的去除效率圖。
[0039] 圖15是添加表面活性劑后gi/ra?菌株對(duì)焚蒽的去除效率圖。
[0040] 圖16是添加表面活性劑后i(rco6ac ieriw?價(jià)7 菌株對(duì)菲的去除效率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明 書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0042] 以下實(shí)施例所用培養(yǎng)基配方為： 所述gi/ra?的LB培養(yǎng)基成份為：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L， 氯化鈉 l〇g/L。
[0043] 所述LB培養(yǎng)基固體平板成份為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉 IOg/ L，15g/L純化瓊脂粉。
[0044] 所述 MSM 培養(yǎng)液的成分為！K2HPO4 6. 0g/L，KH2PO4 5. 5g/L，Na2SO4 2. Og/ L，KCL 2g/L，MgSO4. 7H20 0. 2g/L，Iml微量金屬鹽溶液/L。所述微量金屬鹽溶液 配方為：N(CH2COOH) 31.5g/L, MnSO4. H2O 0.5g/L, NaCl l.Og/L, FeSO4. 7H20 0.1g/L， CoSO4. 7H20 0. 18g/L, CaCl2. 2 H2O 0. lg/L, ZnSO4. 7H20 0. 18g/L, CuSO4. 5H20 0.0 lg/L, KAl(SO4)2. 12H20 0. 02g/L, H3BO3 0.0 lg/L, Na2MoO4. 2 H2O 0.0 lg/L, NiCl2. 6H20 0. 025g/ 1^似256〇3.5!120 0.38/1。？!1值為7.8。
[0045] 所述MSM培養(yǎng)基固體平板的成份為：上述MSM培養(yǎng)液成份，15g/L純化瓊脂粉。
[0046] 以下實(shí)施例所用本發(fā)明菌株(淺黃分枝桿菌giJVw?)簡(jiǎn)稱Ml菌。
[0047] 實(shí)施例1:菌株的篩選與分離 富集培養(yǎng)：以北京焦化廠多環(huán)芳烴污染土壤為菌源，稱取IOg 土壤，加入90ml無(wú)菌水和 0. 5 g玻璃珠，在180r/min，30°C搖床中震蕩3h，靜置30min后，取上清液5ml接種到含芘 50mg/L己滅菌的45ml MSM培養(yǎng)液中，30°C，180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔10天轉(zhuǎn)接5ml培 養(yǎng)液于45ml芘濃度梯度成100、200、300、500mg/L遞增的新鮮滅菌MSM培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)5次 轉(zhuǎn)接完成多環(huán)芳烴降解菌的富集。
[0048] 菌株篩選：取一定量最后一次富集培養(yǎng)液涂布于MSM固體平板后，平板倒扣于裝 有芘的燒杯中，采用升華法在MSM固體平板鋪上一層芘膜。涂有芘膜的平板置于30°C恒濕 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)期間多次觀察，出現(xiàn)透明圈的菌落即為芘降解菌。
[0049] 菌株分離純化：挑選出現(xiàn)透明圈的菌落，經(jīng)過(guò)多次平板劃線分離得到降解菌的純 菌株，菌株名記為MI。MI用LB培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)7天，菌落橘黃色，圓形，表面凸起，干燥，不 透明，邊緣整齊。菌體呈短桿狀，0.4 μπι X 0.8 - 1.5 μπι，單個(gè)或成對(duì)排列，革蘭氏陽(yáng) 性(見(jiàn)圖1和圖2)。能夠利用葡萄糖酸鉀和甘露醇為碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露 醇產(chǎn)酸，過(guò)氧化氫酶、脲酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，β -半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn)陰性，吐溫80水 解陽(yáng)性，七葉苷水解、