專利名稱:一種肝素鈉的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝素鈉的提取方法，尤其是一種對(duì)酶鹽結(jié)合法的改進(jìn)方法。
技術(shù)背景
肝素鈉是一種由動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生的酸性粘多糖的硫酸酯類物質(zhì)，因其具有強(qiáng)抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉不僅有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能。雖肝素鈉用于臨床已有60余年的歷史，但迄今還沒有一種能夠完全代替它的產(chǎn)品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物，且目前只能從動(dòng)物的部分組織中提取，不能人工合成。我國(guó)是生豬養(yǎng)殖、屠宰和消費(fèi)大國(guó)，更是腸衣加工大國(guó)。腸粘膜是提取肝素鈉的最佳原料，國(guó)內(nèi)有大量致力于從腸粘膜中提取肝素鈉的廠家， 大部分企業(yè)用鹽析法或酶鹽結(jié)合法提取肝素鈉。酶鹽結(jié)合法的主要程序是先對(duì)腸粘膜物進(jìn)行酶解、過(guò)濾，然后用樹脂吸附、洗脫，再用酒精沉淀，純化后烘干即成。肝素鈉提取率多在一億IU/2300-2500根小腸之間(最好水平在一億IU/2000根小腸，僅個(gè)別企業(yè)可達(dá)到此水平)，所提肝素鈉的純度較低，常在70-90IU/mg，其中含有大量的蛋白質(zhì)，色澤黑褐，給臨床用藥的制備增加難度。
有報(bào)道用超聲波法輔助鹽析法或酶法提取肝素鈉，如宋大巍“肝素鈉的高效提取和分離純化技術(shù)研究，胰蛋白酶水解法提取肝素工藝參數(shù)的優(yōu)化研究，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008. 3”，但其工藝繁瑣，投入高、能耗大，未見工業(yè)應(yīng)用報(bào)道。
采用酸堿法、化學(xué)氧化法或酸法-氧化法結(jié)合可將粗肝素鈉純化，但肝素鈉在溫?zé)岬南∷嶂袝?huì)失活，溫度越高，PH值越低，失活越快。在堿性條件下，N-硫酸基相當(dāng)穩(wěn)定，但艾杜糖醛酸上的硫酸基可被水解，從而使其失去活性；肝素鈉與氧化劑作用可被降解成酸性產(chǎn)物，故用氧化劑進(jìn)行純化時(shí)，會(huì)降低肝素鈉的收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝素鈉的提取方法，其產(chǎn)率高、效價(jià)高、能耗低、成本低。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，其特征在于包括以下步驟
(1)常規(guī)法腸粘膜物的酶水解，水解采用的酶制劑是蛋白酶木瓜酶脂肪酶以1-4 1-3 0. 1-0.3的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是選自2709酶、 ASl. 398酶、胰酶中的至少一種材料，水解完成后，過(guò)濾水解混合物；(2)常規(guī)法樹脂吸附； (3)常規(guī)法樹脂洗脫；(4)常規(guī)法肝素鈉沉析；(5)常規(guī)法肝素鈉純化；(6)常規(guī)法干燥即得純品肝素鈉。這種技術(shù)方案改進(jìn)了傳統(tǒng)酶解工藝，在酶解前先將底物加熱，再采用新的配方酶制劑，利用多種酶的協(xié)同作用使肝素鈉與蛋白復(fù)合物解離，解離效果好，在較緩和的條件下使細(xì)胞壁變性完成酶水解過(guò)程，更加有利于蛋白酶發(fā)揮作用。
一種進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案是，改進(jìn)前述方案的步驟1，即在步驟1過(guò)濾水解混合物之前添加沉淀劑，所述沉淀劑是選自聚合氯化鋁、堿式氯化鋁、硫酸鋁中的至少一種材料。加入沉淀劑可將水解液中的蛋白質(zhì)、腸渣等有效分離、回收，可減少樹脂吸附工序樹脂對(duì)它們的吸附，提高樹脂吸附的有效性，提高肝素鈉產(chǎn)物的純度。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)便，投資少，適合規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
2.肝素鈉純度高，產(chǎn)率高，質(zhì)量穩(wěn)定。生產(chǎn)的肝素鈉純度可達(dá)100-120IU/mg，提取肝素鈉的效率可達(dá)1億IU/1700-1800根豬小腸，較現(xiàn)有技術(shù)提高20-30%。
3.水耗、能耗低，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明方法比常規(guī)酶解工藝節(jié)省用鹽量約 30-50%，耗水量和廢水排放量較常規(guī)減少50-70%，酶解結(jié)束后無(wú)需再次升溫至80-90°C 后又降溫，可降低能耗30-40%。
4.原料綜合利用率高，廢水污染負(fù)荷低、易處理。粗蛋白回收率達(dá)60%，廢液COD 減少75-85%，污染負(fù)荷顯著降低。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種肝素鈉的提取方法，包括以下步驟
(1)腸粘膜物的酶水解在帶有攪拌裝置、加料裝置、溫度顯示和觀察孔的反應(yīng)釜中加入100份腸粘膜物，升溫至70°C，保溫15min，加水180份，加NaCl 7份，控制溫度45°C， 用堿液調(diào)PH為7. 5，加酶制劑(酶制劑配方為蛋白酶木瓜酶脂肪酶以1 1 0.2的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是2709酶)0. 04份，攪拌1. 5h,加沉淀劑聚合氯化鋁0. 27份，攪拌lOmin，靜置4h，將上層清液用120目濾布過(guò)濾，收集濾液；
(2)樹脂吸附在帶有攪拌裝置的容器內(nèi)加入100份由步驟(1)獲得的濾液，加入 ZGA 398樹脂3份，攪拌4h，將樹脂濾出，再加ZGA 398樹脂3份，攪拌證，將樹脂濾出，將濾出的樹脂合并用水清洗1-2次；
(3)樹脂洗脫將步驟⑵回收的樹脂加入質(zhì)量為0. 9倍樹脂質(zhì)量的3-4mol/ L NaCl溶液中，攪拌2. 5h，過(guò)濾、收集洗脫液；再添加質(zhì)量為0. 8倍樹脂質(zhì)量的2. 5-3mol/ LNaCl溶液，攪拌池，過(guò)濾，收集洗脫液；然后用與樹脂質(zhì)量相等質(zhì)量的2. 5-3mol/L NaCl溶液攪拌洗滌一次，收集洗液，用于下批樹脂的洗脫；
(4)肝素鈉的沉析將步驟(3)中第1次和第2次的洗脫液合并，加入濃度為 85-95%乙醇攪拌，使洗脫液乙醇濃度達(dá)到45-50度，靜置他，將沉析肝素鈉的上清液回收， 收集肝素鈉沉淀；
(5)肝素鈉的純化將步驟(4)回收的肝素鈉沉淀用1 % NaCl溶液溶解，過(guò)濾或離心分離除去不溶物，加入濃度為85-95%乙醇攪拌，使肝素鈉溶液乙醇濃度達(dá)到45-50度， 靜置7h，過(guò)濾、收集肝素鈉沉淀，用濃度為85-95%乙醇洗滌肝素鈉沉淀1-2次，過(guò)濾，收集肝素鈉沉淀；
(6)干燥將肝素鈉沉淀在低溫下風(fēng)干至基本全干，或在真空條件下干燥，得純品肝素鈉。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的步驟同實(shí)施例1，只是酶制劑配方與沉淀劑有變化，酶制劑配方比例改為蛋白酶木瓜酶脂肪酶以4 3 0.3的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是ASl. 398酶與胰酶按1 1質(zhì)量比的混合物；沉淀劑改為堿式氯化鋁。
實(shí)施例3
本實(shí)施例的步驟同實(shí)施例1，只是酶制劑與沉淀劑的配方有變化，酶制劑配方改為蛋白酶木瓜酶脂肪酶以2 2 0.2的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是胰酶；沉淀劑改為硫酸鋁。
實(shí)施例4
本實(shí)施例的步驟同實(shí)施例1，只是酶制劑與沉淀劑的配方有變化，酶制劑配方改為蛋白酶木瓜酶脂肪酶以1 1 0. 1的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是ASl. 398酶；沉淀劑改為堿式氯化鋁與硫酸鋁按2 1質(zhì)量比的混合物。
本發(fā)明可用其它不違背本發(fā)明精神或主要特征的具體形式來(lái)概述，在不脫離本發(fā)明上述主題范圍的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的各種變更和替換， 均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種肝素鈉的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)常規(guī)法腸粘膜物的酶水解，水解采用的酶制劑是蛋白酶木瓜酶脂肪酶以 1-4 1-3 0.1-0.3的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是選自2709酶、 ASl. 398酶中的至少一種材料，水解完成后，過(guò)濾水解混合物；(2)常規(guī)法樹脂吸附；(3)常規(guī)法樹脂洗脫；(4)常規(guī)法肝素鈉沉析；( 常規(guī)法肝素鈉純化；(6)常規(guī)法干燥即得純品肝素鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種肝素鈉的提取方法，其特征在于所述步驟1中在過(guò)濾水解混合物之前添加沉淀劑，所述沉淀劑是選自聚合氯化鋁、堿式氯化鋁、硫酸鋁中的至少一種材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的一種肝素鈉的提取方法，其特征在于包括如下步驟各步驟所用材料除特別說(shuō)明外，均按質(zhì)量份計(jì)(1)腸粘膜物的酶水解在帶有攪拌裝置、加料裝置、溫度顯示和觀察孔的反應(yīng)釜中加入100份腸粘膜物，升溫至60-75°C，保溫10-30min，加水100-200份，加NaC16_8份，控制溫度40-55 °C，用堿液調(diào)pH為7. 0-9. 0，加酶制劑0. 02-0. 05份，攪拌1. 5-2. 5h，加沉淀劑 0. 2-0. 3份，攪拌10-15min，靜置3- ，將上層清液用100-150目濾布過(guò)濾，收集濾液；(2)樹脂吸附在帶有攪拌裝置的容器內(nèi)加入100份由步驟⑴獲得的濾液，加入ZGA 398樹脂3-5份，攪拌3-他，將樹脂濾出，再加ZGA 398樹脂1_4份，攪拌3_幾，將樹脂濾出， 將濾出的樹脂合并用水清洗1-2次；(3)樹脂洗脫將步驟(2)回收的樹脂加入質(zhì)量為0.8-1. 2倍樹脂質(zhì)量的3-4mol/ LNaCl溶液中，攪拌2-池，過(guò)濾、收集洗脫液；再添加質(zhì)量為0. 7-0. 9倍樹脂質(zhì)量的 2. 5-3mol/L NaCl溶液，攪拌2_3h，過(guò)濾，收集洗脫液；然后用與樹脂質(zhì)量相等質(zhì)量的 2. 5-3mol/L NaCl溶液攪拌洗滌一次，收集洗液，用于下批樹脂的洗脫；(4)肝素鈉的沉析將步驟(3)中第1次和第2次的洗脫液合并，加入濃度為85-95% 乙醇攪拌，使洗脫液乙醇濃度達(dá)到45-50度，靜置6-8h，將沉析肝素鈉的上清液回收，收集肝素鈉沉淀；(5)肝素鈉的純化將步驟(4)回收的肝素鈉沉淀用NaCl溶液溶解，過(guò)濾或離心分離除去不溶物，加入濃度為85-95 %乙醇攪拌，使肝素鈉溶液乙醇濃度達(dá)到45-50度，靜置 5_7h，過(guò)濾、收集肝素鈉沉淀，用濃度為85-95 %乙醇洗滌肝素鈉沉淀1-2次，過(guò)濾，收集肝素鈉沉淀；(6)干燥將肝素鈉沉淀在低溫下風(fēng)干至基本全干，或在真空條件下干燥，得純品肝素鈉。
專利摘要
一種肝素鈉的提取方法，包括如下步驟(1)常規(guī)法腸粘膜物的酶水解，水解采用的酶制劑是蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的質(zhì)量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是選自2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一種材料，水解后過(guò)濾；(2)常規(guī)法樹脂吸附；(3)常規(guī)法樹脂洗脫；(4)常規(guī)法肝素鈉沉析；(5)常規(guī)法肝素鈉純化；(6)常規(guī)法干燥即得成品。一種改進(jìn)是前述方案步驟1中在過(guò)濾之前添加沉淀劑。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)便，投資少，適合規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，肝素純度可達(dá)100-120IU/mg，提取效率可達(dá)1億IU/1700-1800根豬小腸，提高20-30％，節(jié)省用鹽30-50％，節(jié)省用水50-70％，節(jié)能30-40％，粗蛋白回收率可達(dá)60％。
文檔編號(hào)C12S3/02GKCN101864002 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010206083
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年6月21日
發(fā)明者李海生 申請(qǐng)人:廣元市海天實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan