肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，所述工藝包括以下步驟：首先將腸粘膜粉碎，然后采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶組成的復(fù)合酶制劑在常溫?zé)o鹽條件進(jìn)行酶解，酶解后離心收集清液，使用合適的離子交換樹(shù)脂吸附離心液中的肝素鈉，使用高濃度的鹽對(duì)濾液進(jìn)行洗脫，再用酒精將洗脫液中的肝素鈉沉淀下來(lái)，最后烘干得到肝素鈉粗品。通過(guò)上述方式，本發(fā)明不僅可以在酶解和吸附階段節(jié)約大量熱能，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；而且可以在無(wú)鹽條件下實(shí)現(xiàn)肝素鈉的酶解和吸附過(guò)程，從而使排放的廢水中鹽濃度降低，減少?gòu)U水處理成本，提高環(huán)境效益。
【專利說(shuō)明】肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥制作【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種利用豬小腸在常溫?zé)o鹽條件下提取肝素鈉的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉是一種酸性粘多糖，由動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生分泌。醫(yī)用肝素鈉主要應(yīng)用于抗凝血作用。肝素鈉的粗提品中由于含有的雜質(zhì)較多、樣品不純，不能直接作為臨床藥品應(yīng)用。由于肝素鈉粗品的質(zhì)量在一定程度上決定了肝素鈉精品的質(zhì)量，因此肝素鈉粗品的制備至關(guān)重要。肝素鈉粗品的傳統(tǒng)提取方法有以下幾種:
[0003]1、鹽析法提取:最早從豬小腸中提取肝素鈉主要是利用鹽析提取技術(shù)。肝素鈉是一種糖胺聚糖，在體內(nèi)主要與蛋白質(zhì)和其他多糖物質(zhì)結(jié)合在一起。鹽析法在國(guó)內(nèi)曾是最常用的提取方法，原料多以豬小腸粘膜或豬大腸腌液為主。鹽析法的主要提取路線是:用堿性鹽法將肝素鈉從肝素鈉與其他物質(zhì)形成的復(fù)合物中分離出來(lái)，然后用強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂將解離出來(lái)的肝素鈉負(fù)離子吸附，再用高濃度的鹽水將肝素鈉從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，再經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、丙酮干燥等步驟得到肝素鈉的粗品。
[0004]2、酶解法提取:肝素鈉在動(dòng)物組織中的主要存在形式是肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，肝素主要是以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在蛋白質(zhì)上，所以要從肝素-蛋白質(zhì)復(fù)合物中分離提取肝素鈉主要是要將肝素與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合斷開(kāi)，這樣既可以將肝素分離出來(lái)，又有利于肝素在溶劑中的溶解和下一步的提取和分離。雖然腸粘膜自身就含有一些蛋白水解酶，可以自溶，但是需要的時(shí)間較長(zhǎng)。為了縮短酶解時(shí)間，減少微生物的污染，在提取肝素鈉的時(shí)候往往會(huì)加入蛋白水解酶。目前工業(yè)上`常用的提取肝素鈉的酶為2709堿性蛋白酶，該酶可以將肝素-蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解成小肽，從而使肝素分離出來(lái)，然后再用一定的方法除去蛋白質(zhì)得到肝素鈉。
[0005]3、超聲波法:超聲波法的主要作用機(jī)理是超聲波振蕩破壞細(xì)胞壁，擴(kuò)大可溶性物質(zhì)通過(guò)多孔透析膜，使多糖易于提取。在利用超聲波法提取肝素鈉的時(shí)候主要是運(yùn)用超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化作用。超聲波的機(jī)械作用可促成液體的乳化、凝膠的液化和固體的分散，當(dāng)超聲波流體介質(zhì)中形成駐波時(shí)，懸浮在流體中的微小顆粒因受機(jī)械力的作用而凝聚在波節(jié)處，在空間形成周期性的堆積。超聲波的空化作用是指超聲波作用于液體的時(shí)候可以產(chǎn)生大量小氣泡。一個(gè)原因是由于液體內(nèi)局部出現(xiàn)拉應(yīng)力而形成負(fù)壓，壓強(qiáng)的降低使原來(lái)溶于液體的氣體過(guò)飽和，而從液體逸出，成為小氣泡。另一原因是由于強(qiáng)大的拉應(yīng)力把液體“撕開(kāi)”成一空洞，稱為空化?？斩磧?nèi)為液體蒸氣或溶于液體的另一種氣體，甚至可能是真空。因?yàn)榭栈饔眯纬傻男馀輹?huì)隨周圍介質(zhì)的振動(dòng)而不斷運(yùn)動(dòng)、長(zhǎng)大或突然破滅。破滅時(shí)周圍液體突然沖入氣泡而產(chǎn)生高溫、高壓，同時(shí)產(chǎn)生激波。這種作用力能破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞在瞬間破裂，超聲波的這些作用都有利于肝素鈉的提取。
[0006]目前，工業(yè)上利用豬小腸粘膜提取肝素鈉粗品的主要工藝過(guò)程為:首先用酶消化鹽浸過(guò)的豬小腸粘膜，再用合適的樹(shù)脂吸附解離出的肝素鈉，然后高鹽洗脫，最后再用合適濃度的酒精沉淀，繼而得到的就是肝素鈉的粗品，粗品再經(jīng)過(guò)一些處理才能得到精品。但是，目前工業(yè)上的酶解和吸附過(guò)程都必須在接近55°C的高溫下進(jìn)行才可以實(shí)現(xiàn)，而且在酶解和吸附過(guò)程中還要加入一定量的鹽，這樣會(huì)造成兩方面的缺點(diǎn):首先，高溫的工藝過(guò)程不容易實(shí)現(xiàn)，且耗能高；其次，鹽的加入不僅增加了生產(chǎn)成本，而且排放的高鹽廢水難以進(jìn)行無(wú)害化處理，高鹽廢水可損傷水體的使用價(jià)值，危害人類健康。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，不僅可以在
酶解和吸附階段節(jié)約大量熱能，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；而且可以在無(wú)鹽條件下實(shí)現(xiàn)肝 素鈉的酶解和吸附過(guò)程，從而使排放的廢水中鹽濃度降低，減少?gòu)U水處理成本，提高環(huán)境效. Mo
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，所述工藝包括以下步驟:
[0009]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液。
[0010]2)酶解:將所述勻漿液的pH調(diào)至8~9后加入復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解2~4小時(shí)；
[0011]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0012]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入樹(shù)脂，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；
[0013]5)清洗及洗脫:將所述樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0014]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0015]其中，所述步驟2)中的每升勻漿液中加入0.5~2克復(fù)合酶制劑。
[0016]其中，所述復(fù)合酶制劑是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5~2.5: 0.4~
0.8的質(zhì)量份比例混合而成的混合物。
[0017]其中，所述步驟4)中每升離心液中加入6克樹(shù)脂。
[0018]其中，所述樹(shù)脂為FPA98型樹(shù)脂。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:區(qū)別于現(xiàn)有肝素鈉粗品提取方法中的酶解和吸附步驟需高溫加鹽條件，導(dǎo)致耗能高、生產(chǎn)成本高及高鹽廢水的污染情況，本發(fā)明采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶組成的復(fù)合酶制劑對(duì)腸粘膜進(jìn)行酶解，不僅可以在酶解和吸附階段節(jié)約大量熱能，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；而且可以在無(wú)鹽條件下實(shí)現(xiàn)肝素鈉的酶解和吸附過(guò)程，從而使排放的廢水中鹽濃度降低，減少?gòu)U水處理成本，提高環(huán)境效益。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。[0021]實(shí)施例1
[0022]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液；
[0023]2)酶解:取200升勻漿液，將勻漿液的pH調(diào)至8~9，然后加入100克復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解4小時(shí)；復(fù)合酶制劑是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5: 0.4的質(zhì)量份比例混合而成的混合物；
[0024]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0025]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入FPA98型樹(shù)脂6g/L (基于離心液的體積，w/v)，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；
[0026]5)清洗及洗脫:將樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0027]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0028]實(shí)施例2
[0029]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液；
[0030]2)酶解:取400升勻漿液，將勻漿液的pH調(diào)至8~9，然后加入280克復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解3小時(shí)；復(fù)合酶制劑是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.7: 0.5的質(zhì)量份比例混合而成的混合物；
[0031]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0032]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入FPA98型樹(shù)脂6g/L (基于離心液的體積，w/v)，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；
[0033]5)清洗及洗脫:將樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0034]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0035]實(shí)施例3
[0036]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液；
[0037]2)酶解:取600升勻漿液，將勻漿液的pH調(diào)至8~9，然后加入600克復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解2小時(shí)；復(fù)合酶制劑是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2: 0.6的質(zhì)量份比例混合而成的混合物；
[0038]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0039]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入FPA98型樹(shù)脂6g/L (基于離心液的體積，w/v)，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；[0040]5)清洗及洗脫:將樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0041]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0042]實(shí)施例4
[0043]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液； [0044]2)酶解:取800升勻漿液，將勻漿液的pH調(diào)至8~9，然后加入1200克復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解2小時(shí)；復(fù)合酶制劑是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2.2: 0.7的質(zhì)量份比例混合而成的混合物；
[0045]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0046]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入FPA98型樹(shù)脂6g/L (基于離心液的體積，w/v)，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；
[0047]5)清洗及洗脫:將樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0048]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0049]實(shí)施例5
[0050]I)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液；
[0051]2)酶解:取1000升勻漿液，將勻漿液的pH調(diào)至8~9，然后加入2000克復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解2小時(shí)；復(fù)合酶制劑是蛋白酶:核酸酶:脂肪酶以10: 2.5: 0.8的質(zhì)量份比例混合而成的混合物；
[0052]3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液；
[0053]4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入FPA98型樹(shù)脂6g/L (基于離心液的體積，w/v)，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂；
[0054]5)清洗及洗脫:將樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用；
[0055]6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
[0056]由以上各實(shí)施例可知，本發(fā)明采用由蛋白酶、脂肪酶和核酸酶組成的復(fù)合酶制劑對(duì)腸粘膜進(jìn)行酶解，不僅可以在酶解和吸附階段節(jié)約大量熱能，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；而且可以在無(wú)鹽條件下實(shí)現(xiàn)肝素鈉的酶解和吸附過(guò)程，從而使排放的廢水中鹽濃度降低，減少?gòu)U水處理成本，提高環(huán)境效益。
[0057]本領(lǐng)域技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和精神，可以有多種變形方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，以上所述僅為本發(fā)明較佳可行的實(shí)施例而已，并非因此局限本發(fā)明的權(quán)利范圍。此外，應(yīng)當(dāng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附`權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，其特征在于，所述工藝包括以下步驟: 1)勻漿:將新鮮的小腸粘膜液按每付小腸加水5~6kg稀釋后勻漿或攪碎得到小腸粘膜的勻漿液。 2)酶解:將所述勻漿液的pH調(diào)至8~9后加入復(fù)合酶制劑，在室溫下，攪拌酶解2~4小時(shí)； 3)除雜:采用連續(xù)離心或壓濾的方法棄去固態(tài)雜質(zhì)，得到離心液； 4)吸附:將所述離心液的pH調(diào)至8.5左右，加入樹(shù)脂，在28°C~30°C下，攪拌吸附6小時(shí)后收集樹(shù)脂； 5)清洗及洗脫:將所述樹(shù)脂用清水洗凈，再用5%的鹽水清洗掉部分雜質(zhì)，清洗完后用23%~25%的鹽水第一次洗脫樹(shù)脂4小時(shí)，收集洗脫液；再用23%~25%的鹽水第二次洗脫3小時(shí)，收集洗脫液并與第一次的洗脫液合并；最后再用21%的鹽水對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行第三次洗脫2小時(shí)，收集洗脫液留待下次使用； 6)醇沉及干燥:在第一次與第二次合并的洗脫液中加入40%~50%的乙醇，沉淀24小時(shí)后除去上清液，將得到的沉淀物烘干即得到肝素鈉粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，其特征在于，所述步驟2)中的每升勻漿液中加入0.5~2克復(fù)合酶制劑。
3.根據(jù) 權(quán)利要求1或2所述的肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，其特征在于，所述復(fù)合酶制劑是蛋白酶:脂肪酶:核酸酶以10: 1.5~2.5: 0.4~0.8的質(zhì)量份比例混合而成的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，其特征在于，所述步驟4)中每升離心液中加入6克樹(shù)脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肝素鈉的常溫?zé)o鹽提取工藝，其特征在于，所述樹(shù)脂為FPA98型樹(shù)脂。
【文檔編號(hào)】C08B37/10GK103724456SQ201210385711
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月12日
【發(fā)明者】王云山, 胡歡歡, 王劍英, 張萬(wàn)忠 申請(qǐng)人:深圳市綠微康生物工程有限公司