專利名稱：一種檢測土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤亞硝酸還原酶活性的檢測，具體地說是一種檢測土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法。
背景技術(shù)：
土壤亞硝酸還原酶是土壤N素反硝化過程中的兩種關(guān)鍵酶之一，其活性強(qiáng)弱影響著溫室氣體氮氧化物的排放，同時(shí)也受農(nóng)田管理措施、自然或人為擾動、以及土壤條件如水分、溫度、土壤質(zhì)地的強(qiáng)烈影響。因此，對亞硝酸還原酶活性的檢測意義重大。但到目前為止，有關(guān)亞硝酸還原酶活性的測定基本上都是參照[蘇]Φ.X.哈茲耶夫著，鄭洪元、周禮愷、張德生譯的《土壤酶活性》一書中的方法，而該種方法操作步驟繁瑣，需要專用的試劑瓶和抽濾裝置進(jìn)行抽真空培養(yǎng)，且試驗(yàn)結(jié)果隨不同質(zhì)地土壤在培養(yǎng)時(shí)間和稱樣量上應(yīng)有的差異性以及嫌氣培養(yǎng)程度的不確定性，使其難以適應(yīng)土壤亞硝酸還原酶活性的定性比較和定量研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法；該分析方法是在前人測定方法的原理基礎(chǔ)上，對亞硝酸還原酶活性的測定步驟進(jìn)行了部分改進(jìn)(對其通過在一定壓力下抽真空而實(shí)現(xiàn)嫌氣培養(yǎng)的過程進(jìn)行了改進(jìn))，從而減少了嫌氣培養(yǎng)程度的復(fù)雜性和不確定性，使分析結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法，1)分別稱取1g過篩的土壤風(fēng)干樣品3份于3只試管中，往其中2只試管中加入2-2.5ml 0.20％-0.25％的亞硝酸鈉溶液，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣品對照，調(diào)PH為7-8.5；然后向3只試管中分別加入1-2ml0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作為氫供體，再用蒸餾水補(bǔ)充到5-10ml，封口，搖勻，30℃恒溫嫌氣培養(yǎng)24小時(shí)；同時(shí)作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)；
2)培養(yǎng)結(jié)束后，用蒸餾水將試管內(nèi)的土液混合物完全轉(zhuǎn)移至三角瓶中，再加入1ml鋁鉀礬飽和溶液；將懸液仔細(xì)搖蕩，并用致密濾紙過濾；3)取濾液1ml于50ml容量瓶中加顯色劑，然后用水定容至刻度，在520nm下比色測定，測定吸光值A(chǔ)；4)在520nm下比色測定一系列已知濃度的NaNO2溶液的吸光值A(chǔ)1，以NaNO2溶液的濃度和測定的吸光值A(chǔ)′制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b；5)根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計(jì)算所測定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；6)計(jì)算樣品中NO2-N的含量；計(jì)算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1為試劑空白中的NO2-N的含量mg/L，S2為樣品中的NO2-N的含量mg/L，S3為樣品對照中的NO2-N的含量mg/L，50為定容的溶液體積ml，V1為浸提液總體積ml，V2為吸取濾液的體積(ml)，W為稱土樣重g，1000為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。
對于酸性土壤，調(diào)PH為7-8.5時(shí)，采用加入CaCO3的方式。(對石灰性土壤而言，CaCO3無需加入，因?yàn)橥寥辣旧淼腃aCO3量既可以滿足微生物的最適pH)所述顯色劑既可以采用對氨基苯磺酸和α-萘酚的等體積混合液(Γpиcc試劑)，也可以采用磺胺和N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸的混合液。
嫌氣培養(yǎng)時(shí)用直徑10-15mm，長150-180mm的普通玻璃試管；在土壤樣品中加入5-10ml的液體，即保證土面以上5cm以上的液面高度；所用底物NaNO2溶液的濃度為0.20％-0.25％，其濃度及用量根據(jù)硝酸還原酶活性的不同適當(dāng)調(diào)整；所述液體量為底物溶液、葡萄糖溶液和蒸餾水的加入量之和。
本發(fā)明方法改進(jìn)依據(jù)為土壤亞硝酸還原酶與土壤硝酸還原酶一樣，都是參與土壤反硝化過程中的還原酶。二者測定過程中均需要嫌氣培養(yǎng)條件。硝酸還原酶活性的測定是以KNO3為底物，通過加入2，4-二硝基酚抑制亞硝酸還原酶的活性，來檢測單位時(shí)間內(nèi)NO2--N的生成量。而本方法中亞硝酸還原酶活性的測定則是以NaNO2為底物，經(jīng)過24小時(shí)嫌氣培養(yǎng)后，通過單位時(shí)間內(nèi)NO2--N的減少量來表征。已有研究結(jié)果表明，1-5g土壤樣品中加入5-10ml水(使土壤上層液面的高度保持5cm以上)培養(yǎng)形成的土水混合物中的溶解氧與充入N2三分鐘形成的厭氧條件是相似的，淹水6-10個(gè)小時(shí)足可以使土水混合物中的O2含量降為0。
與過去的分析方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.所需設(shè)備簡單，成本低。將稱量好的土壤樣品置于10-15mm×100-150mm(直徑×高度)的普通玻璃試管中即可，而不需用原來方法中提及的用來實(shí)現(xiàn)抽真空的帶磨口塞的專用真空瓶。
2.無需專用的抽真空裝置，通過使土層以上保持一定液面來實(shí)現(xiàn)測定過程中的嫌氣培養(yǎng)條件。原來方法中抽真空時(shí)需要在一定壓力(10-12毫米水銀柱)下進(jìn)行，亞硝酸還原酶活性隨真空度的變化具有較大的差異性，因此操作過程中容易造成較大的系統(tǒng)誤差。而本發(fā)明通過使土壤樣品以上保持一定高度的液面來實(shí)現(xiàn)嫌氣條件，克服了此方面明顯的不足，既簡化了操作步驟，同時(shí)又減小了系統(tǒng)誤差。
3.操作簡便。原有方法中需設(shè)置滅菌土壤作為對照(180℃，3小時(shí))，而本方法只需用一個(gè)不加底物溶液，其余步驟同土壤樣品一樣的處理作為樣品對照即可。
具體實(shí)施例方式
試劑配制1.0.20％-0.25％的NaNO2溶液稱取0.20-0.25g NaNO2用蒸餾水定容至100ml。
2.0.5％-1.0％的葡萄糖溶液稱取0.5g-1.0g葡萄糖，用蒸餾水定容至100ml。
3.CaCO3，分析純試劑。
4.鋁鉀礬飽和溶液將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中，直至過飽和。
5.顯色劑1(Γpиcc試劑)用比重為1.04的醋酸分別配制0.1％的α-萘胺溶液和0.5％的對氨基苯磺酸溶液(b)，用前將等體積a、b混合即成。
比重1.04的醋酸(相當(dāng)于重量百分?jǐn)?shù)35％的醋酸)配置取175ml100％的醋酸，定容至500ml，即為35％，比重1.04的醋酸。
稱取0.2g α-萘胺用重量百分?jǐn)?shù)35％，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此為(a)液。
稱取1.0g對氨基苯磺酸用重量百分?jǐn)?shù)35％，比重1.04的醋酸溶解并定容至200ml，此為(b)液。
顯色劑2稱取2g磺胺和0.1gN-(1-萘基)-乙二胺鹽酸溶于150ml蒸餾水中，加入20ml濃磷酸，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至200ml。此液應(yīng)為無色溶液，并需當(dāng)日配制。
6.標(biāo)準(zhǔn)貯備液(250mgNO2--N/L)溶解1.2314gNaNO2并用蒸餾水定容至1000ml，放于4℃冰箱中保存，保存時(shí)間不宜過久，以不超過數(shù)周為宜。
7.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液1ml，定容至100ml，此為2.5mgNO2--N/L的溶液。再分別吸取該液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，加少量蒸餾水和4ml顯色劑，并用蒸餾水定容。此標(biāo)準(zhǔn)系列含亞硝態(tài)氮的量分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mgNO2--N/L。在520nm下比色測定一系列已知濃度的NaNO2溶液的吸光值A(chǔ)1，以NaNO2溶液的濃度和測定的吸光值A(chǔ)′制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b；操作步驟
1.稱取1g過1mm篩的土壤風(fēng)干樣品3份于3只試管中，分別加入20mgCaCO3(對石灰性土壤而言，CaCO3無需加入，因?yàn)橥寥辣旧淼腃aCO3量既可以滿足微生物的最適pH)，仔細(xì)混合后往其中2只試管中加入2-2.5ml0.20％-0.25％的亞硝酸鈉溶液，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣品對照。然后3只試管中分別加入1-2ml 0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作為氫供體，再用蒸餾水補(bǔ)充到5-10ml，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。同時(shí)作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)。
2.培養(yǎng)結(jié)束后，用50ml蒸餾水將試管內(nèi)的土液混合物完全轉(zhuǎn)移至100ml三角瓶中，再加入1ml鋁鉀礬飽和溶液。將懸液仔細(xì)搖蕩，并用致密濾紙過濾。
3.取濾液1ml于50ml容量瓶中，加少量蒸餾水和4ml顯色劑，然后用水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下比色，測定吸光值A(chǔ)。
4.根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計(jì)算所測定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；5.計(jì)算樣品中NO2-N的含量；計(jì)算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1為試劑空白中的NO2-N的含量(mg/L)S2為樣品中的NO2-N的含量(mg/L)，S3為樣品對照中的NO2-N的含量(mg/L)，50為定容的溶液體積(ml)，V1為浸提液總體積(ml)，V2為吸取濾液的體積(ml)，W為稱土樣重(g)，1000為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；實(shí)施例1選用經(jīng)過不同處理的四種土壤樣品，其中1為對照，2、3、4號樣品加入某種化合物的量依次加大，在溫度25℃，土壤含水量保持20％(以烘干基計(jì))的條件下培養(yǎng)1周后，檢測該化合物的加入量對土壤亞硝酸還原酶活性的影響。具體分析步驟如下1.稱取1g過1mm篩的土壤風(fēng)干樣品3份于3只試管中，分別加入20mgCaCO3，仔細(xì)混合后往其中2只試管中加入2ml 0.25％的亞硝酸鈉溶液，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣品對照。然后3只試管中分別加入2ml 0.5％的葡萄糖溶液作為氫供體，再加入蒸餾水2ml，塞上不透氣的橡膠塞，搖勻，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。同時(shí)作試劑空白對照(不加土壤，其余同樣品處理)2.培養(yǎng)結(jié)束后，用50ml蒸餾水將試管內(nèi)的土液混合物完全轉(zhuǎn)移至100ml三角瓶中，再加入1ml鋁鉀礬飽和溶液。將懸液仔細(xì)搖蕩，并用致密濾紙過濾。
3.取濾液1ml于50ml容量瓶中，加少量蒸餾水和4ml顯色劑1(Γpиcc試劑)，然后用水定容至刻度。15分鐘后，在520nm下比色，測定吸光值A(chǔ)。
4.根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計(jì)算所測定液中NO2-N的含量S，S＝A*b。
5.計(jì)算樣品中NO2-N的含量。
試驗(yàn)結(jié)果如下

由表中數(shù)據(jù)可以看出，各處理之間結(jié)果差異顯著，較低的標(biāo)準(zhǔn)差值表明該分析方法結(jié)果之間的偏差小，試驗(yàn)精密度高，重現(xiàn)性好。
實(shí)施例2對四種不同處理的土壤樣品進(jìn)行亞硝酸還原酶活性的測定，具體分析步驟如下底物NaNO2的濃度為0.20％，加入2ml；葡萄糖的濃度為1％加入1ml，然后加入5ml蒸餾水，顯色時(shí)加入顯色劑2，其余操作步驟同實(shí)施例1。試驗(yàn)結(jié)果如下

表中數(shù)據(jù)同樣顯示了分析結(jié)果的穩(wěn)定性，且各處理之間的差異達(dá)極顯著水平。
權(quán)利要求
1.一種土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法，其特征在于1)分別稱取1g過篩的土壤風(fēng)干樣品3份于3只試管中，往其中2只試管中加入2-2.5ml 0.20％-0.25％的亞硝酸鈉溶液，另1只試管中加入等量的蒸餾水作為樣品對照，調(diào)PH為7-8.5；然后向3只試管中分別加入1-2ml0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作為氫供體，再用蒸餾水補(bǔ)充到5-10ml，封口，搖勻，30℃恒溫嫌氣培養(yǎng)24小時(shí)；同時(shí)作試劑空白對照；2) 培養(yǎng)結(jié)束后，用蒸餾水將試管內(nèi)的土液混合物完全轉(zhuǎn)移至三角瓶中，再加入1ml鋁鉀礬飽和溶液；搖蕩，過濾；3)取濾液1ml于50ml容量瓶中加顯色劑，然后用水定容至刻度，在520nm下比色測定，測定吸光值A(chǔ)；4)在520nm下比色測定一系列已知濃度的NaNO2溶液的吸光值A(chǔ)1，以NaNO2溶液的濃度和測定的吸光值A(chǔ)′制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率b；5)根據(jù)吸光值A(chǔ)和斜率b，計(jì)算所測定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；6)計(jì)算樣品中NO2-N的含量；計(jì)算公式[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h式中S1為試劑空白中的NO2-N的含量mg/L，S2為樣品中的NO2-N的含量mg/L，S3為樣品對照中的NO2-N的含量mg/L，50為定容的溶液體積ml，V1為浸提液總體積ml，V2為吸取濾液的體積(ml)，W為稱土樣重g，1000為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于對于酸性土壤，調(diào)PH為7-8.5時(shí)，采用加入CaCO3的方式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于所述顯色劑既可以采用對氨基苯磺酸和α-萘酚的等體積混合液，也可以采用磺胺和N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸的混合液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于嫌氣培養(yǎng)時(shí)用直徑10-15mm，長150-180mm的普通玻璃試管；在土壤樣品中加入5-10ml的液體，即保證土面以上5cm以上的液面高度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測土壤亞硝酸還原酶活性的分析方法，1)稱取土壤風(fēng)干樣品3份于3只試管中，其中2只試管中加入2－2.5ml 0.20％－0.25％的亞硝酸鈉溶液，另1只試管中加入等量的蒸餾水，調(diào)pH為7－8.5；然后向3只試管中分別加入1－2ml 0.5％－1.0％的葡萄糖溶液，再用蒸餾水補(bǔ)充到5－10ml，封口，搖勻，30℃恒溫嫌氣培養(yǎng)24小時(shí)；2)加入鋁鉀礬飽和溶液；搖蕩，過濾；3)取濾液加顯色劑，在520nm下比色測定，測定吸光值A(chǔ)；4)計(jì)算樣品中NO
文檔編號C12Q1/00GK1979134SQ200510047888
公開日2007年6月13日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者武志杰, 孫志梅, 張麗莉 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所