本發(fā)明涉及病毒檢測，尤其涉及一種基于raa-crisprcas12a的檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒的方法和應用。

背景技術：

1、crispr-cas系統(tǒng)最初來源于細菌和古菌中的一種天然免疫機制，用于抵御外來遺傳物質(zhì)，如質(zhì)粒和噬菌體的入侵。近年來，crispr-cas系統(tǒng)作為一種革命性的基因編輯技術，在生物科學領域引起了廣泛關注。該技術以其簡便、高效的特點，為基因編輯、基因調(diào)控和核酸檢測等領域提供了強大的工具。該系統(tǒng)通過利用cas核酸酶與crrna的引導，實現(xiàn)對特定dna序列的識別和切割，具有極高的靶點特異性。crispr-cas檢測技術作為一種新興的檢測手段，在病毒檢測、疾病診斷、金屬離子檢測、真菌毒素檢測等領域展現(xiàn)出巨大的應用潛力。

2、傳染性鮭魚貧血病毒(infectious?salmon?anaemia?virus，isav)于1984年在挪威首次出現(xiàn)，是一種海洋病毒，主要感染大西洋鮭魚(salmo?salar)，可引起嚴重貧血、程度不同的出血和多組織壞死，是大西洋鮭魚全身性和致死性的傳染病。傳染性鮭魚貧血病毒是一種正粘病毒，直徑100-130nm，由8個基因組片段組成。傳染性鮭魚貧血癥是世界動物衛(wèi)生組織(oie)水生動物疫病名錄中的重要疫病之一，主要在歐洲、北美廣泛流行，被列入歐共體魚類健康指令防治的重要病害之一，因此建立快速而準確的isav檢測方法，對保護我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。

3、目前crispr-cas檢測技術有針對病毒進行檢測，但是由于crispr-cas檢測技術的原理主要是對dna鏈特異性識別，因此現(xiàn)有技術中在檢測病毒時需要將rna轉換成dna后才能進行，病毒rna轉換成dna后通過擴增從而提升檢測的準確性，結果表明，雖然能通過擴增的方式提升檢測的準確性，但是現(xiàn)有技術中的cas12a變體仍面臨切割活性不足，限制了其在實際應用對傳染性鮭魚貧血病毒的準確檢測，最終會影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此需要發(fā)現(xiàn)或改良現(xiàn)有的cas12a蛋白，找到切割活性更好、更方便使用的新型cas12a蛋白酶，從而有利于crispr-cas檢測技術能更加準確檢測傳染性鮭魚貧血病毒。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種基于raa-crisprcas12a的檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒的方法和應用，本發(fā)明方法中使用了一種具有切割活性更好的新型cas12a蛋白酶，能成功應用于檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒。

2、本發(fā)明提供了一種基于raa-crisprcas12a的檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒的方法，包括如下步驟：

3、將cas12a蛋白的溶液、向?qū)na(crrna)的溶液、ssdna報告探針的溶液、核糖核酸酶抑制劑、無核酸酶水和raa反應物分散在緩沖液中，孵育，進行熒光強度檢測；

4、所述cas12a蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

5、進一步的，所述向?qū)na的序列如seq?id?no.4所示。

6、進一步的，所述ssdna報告探針的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，其中，ssdna報告探針的n端修飾有熒光基團，ssdna報告探針的c端修飾有猝滅基團；

7、所述熒光基團為5’-fam；

8、所述猝滅基團為3’-bhq1。

9、進一步的，所述孵育的溫度為36℃-38℃，孵育時間為25min-35min。

10、進一步的，所述緩沖液包括10mm?tris-hcl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，10mm氯化鎂，10mm氯化鈉，100g/ml牛血清白蛋白溶液(bsa)。

11、進一步的，所述牛血清蛋白溶液的制備方法具體為將牛血清蛋白溶液分散于去離子水中。

12、進一步的，以體積計，cas12a蛋白的溶液、向?qū)na的溶液、ssdna報告探針的溶液、核糖核酸酶抑制劑、無核酸酶水、raa反應物和緩沖液的比為2:2:1:1:22:10:2。

13、進一步的，所述cas12a蛋白的溶液的摩爾濃度為200nm。

14、進一步的，所述cas12a蛋白的溶液的制備方法具體為，將cas12a蛋白溶解分散在無核酸酶水中。

15、進一步的，所述向?qū)na的溶液的摩爾濃度為200nm。

16、進一步的，所述向?qū)na的溶液的制備方法具體為，將向?qū)na溶解分散在無核酸酶水中。

17、進一步的，所述ssdna報告探針的溶液的摩爾濃度為200nm。

18、進一步的，所述ssdna報告探針的溶液的制備方法具體為，將ssdna報告探針溶解分散在無核酸酶水中。

19、進一步的，所述核糖核酸酶抑制劑的濃度為40u/μl。

20、在本發(fā)明中的核糖核酸酶抑制劑購買于生工生物工程(上海)股份有限公司，產(chǎn)品的cas號為b600478。

21、進一步的，所述熒光強度檢測采用酶標儀，激發(fā)波長為480nm-500nm，發(fā)射波長為510nm-540nm。

22、進一步的，所述raa反應物的制備方法具體為：

23、基于傳染性鮭魚貧血病毒總rna序列逆轉錄后獲得的cdna序列，

24、基于傳染性鮭魚貧血病毒獲得的cdna序列設計的raa引物對，所述raa引物對包括上游引物isav-raa-f1和下游引物isav-raa-r1；

25、上游引物，濃度10μm，體積2μl；下游引物，濃度10μm，體積2μl；緩沖液a，體積25μl；無核酸酶水，體積13.5μl；將上述溶液混合于一管反應干粉中后，將上述反應體系均分為5份，每份反應體系中加入cdna序列，體積5μl；緩沖液b，體積2.5μl。

26、進一步的，所述cdna序列如seq?id?no.1所示。

27、進一步的，所述上游引物isav-raa-f1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

28、進一步的，所述下游引物isav-raa-r1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

29、進一步的，所述反應體系中反應溫度39℃，反應時間30min。

30、本發(fā)明還提供了所述基于raa-crisprcas12a的檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒的方法在檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒中的應用。

31、本發(fā)明實施例具有以下技術效果：

32、1.本發(fā)明的方法中raa反應物、crrna和cas12a蛋白形成三元復合體時，cas12a蛋白的切割活性就會被激活，ssdna報告探針上的熒光基團就會被cas12a蛋白切割，本方案發(fā)明獲得的cas12a蛋白具有較高的切割活性，因此對于含量較低的目標物，能提升檢測的準確性，可見本發(fā)明的cas12a蛋白可用于檢測三文魚中傳染性鮭魚貧血病毒。

33、2.本發(fā)明的方法，第一具有高靈敏度：由于結合了raa技術的高效擴增能力和cas12a蛋白的高特異性，該方法具有較高的檢測敏感性和特異性。第二特異性好：本發(fā)明的檢測方法對于傳染性鮭魚貧血病毒具有很好的特異性，與其他常見三文魚病毒如呼吸道和腸道病毒、鮭魚甲病毒、感染性胰臟壞死病毒等均無交叉反應，避免了假陽性結果的出現(xiàn)。第三簡單易行：本發(fā)明的檢測方法不需要使用復雜的儀器設備，僅需要一個恒溫水浴鍋或金屬浴，使得現(xiàn)場檢測更加方便易行。第四成本低廉：本發(fā)明的檢測方法不需要使用實時熒光pcr儀等精密儀器，降低了檢測成本，同時也可以避免由于儀器故障或操作失誤引起的誤差。