本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測，具體涉及一種生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體聯(lián)合檢測的引物探針組和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、常見的性傳播疾病病原體有病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體等，泌尿生殖道感染中非淋菌性尿道感染主要由生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體感染導(dǎo)致。

2、生殖支原體（mycoplasma?genitalium，mg）于1980年首次從非淋菌性尿道炎患者的尿道標(biāo)本中分離，屬于柔膜體綱，是一種傳播性病原體。通過細(xì)胞膜上的黏附蛋白黏附并侵入上皮細(xì)胞，通過產(chǎn)生核酸酶和膜脂蛋白誘發(fā)炎癥反應(yīng)、損傷宿主細(xì)胞，可導(dǎo)致尿道炎、宮頸炎、直腸炎，并繼發(fā)盆腔炎性疾病、前列腺炎、附睪炎，甚至可能會造成男性不育，并與早產(chǎn)密切相關(guān)，無癥狀感染亦常見。此外，mg可促進(jìn)hiv的感染和傳播。

3、解脲脲原體屬于柔膜體綱、支原體目、支原體科的尿支原體屬，是泌尿生殖道感染常見的支原體。在育齡婦女陰道炎、尿道炎以及男性的非淋菌性尿道炎中發(fā)揮著持久的病因?qū)W作用?？梢鸩辉胁挥?、自然流產(chǎn)以及嬰兒先天性肺炎、慢性肺疾病，新生兒腦膜炎等。目前已知解脲脲原體包括兩個生物群，14個血清型：其中血清型1、3、6、14屬于生物一群即微小解脲脲原體（ureaplasma?parvum?up），血清型2、4、5、7~13屬于解脲脲原體（ureaplasma?urealyticum?uu）。

4、生殖道沙眼衣原體（chlamydia?trachomatis，ct）感染的病例數(shù)已經(jīng)超過淋球菌感染，占性病之首。ct除泌尿生殖道炎外，還可以引起一系列其他臨床疾病，如前列腺炎、附睪炎、陰道炎、子宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎等，對女性甚至導(dǎo)致異位妊娠或輸卵管性不孕等，此外ct感染還是人乳頭瘤病毒致宮頸癌的協(xié)同因子，也是hiv感染的重要危險因素。ct發(fā)病率高、流行范圍廣、危害嚴(yán)重，引起全球公共衛(wèi)生高度關(guān)注。為降低生殖道感染的疾病負(fù)擔(dān)，本發(fā)明針對生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體分別設(shè)計非特異性的引物和探針，實現(xiàn)非淋球菌生殖道病原體感染的多重檢測，不孕不育和優(yōu)生優(yōu)育篩查，為早發(fā)現(xiàn)、早治療提供更好的臨床輔助診斷，對疾病的早期治療和預(yù)防及流行等具有重要意義。

5、現(xiàn)有技術(shù)中，公開號為cn102888464a的發(fā)明專利公開了能同時對沙眼衣原體、淋病奈瑟菌、解脲支原體、人型支原體和生殖支原體等五種致病病原體進(jìn)行檢測的多重實時pcr方法，并公開了其使用的引物對和探針，該引物對和探針無交叉污染及干擾，保證了該五種致病病原體檢測的準(zhǔn)確性、可靠性、特異性、靈敏度和重復(fù)性。除此之外，公開號為cn115896306a的發(fā)明專利還公開了一種能同時檢測沙眼衣原體、淋病奈瑟菌及解脲脲原體的檢測試劑盒，采用多重實時熒光pcr法，在同一個反應(yīng)體系內(nèi)使用多種熒光標(biāo)記就可以實現(xiàn)對多重病原體的同時檢測，而且特異性強(qiáng)，靈敏度高，能滿足同時對沙眼衣原體、淋病奈瑟菌及解脲脲原體進(jìn)行特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便快捷的檢測方法的需求。由此可見，現(xiàn)有技術(shù)并未公開專屬于生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體三種病原體聯(lián)用的檢測引物、探針及試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體聯(lián)合檢測的引物探針組，該引物探針組專門針對生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體的不同基因的特定保守區(qū)域而設(shè)計，可高效地、特異地的檢測出生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體。

2、本發(fā)明的另一目的是提供一種生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體聯(lián)合檢測的試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行檢測時，無需對樣本進(jìn)行核酸提取即可實現(xiàn)pcr檢測，在降低檢測成本、簡化試驗操作、縮短檢測時間的同時保證高度特異性、準(zhǔn)確度，并提高了靈敏度。進(jìn)一步的，本發(fā)明還可用于女性宮頸拭子/陰道拭子和男性尿道拭子中生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體基因檢測。

3、本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體聯(lián)合檢測的引物探針組，包括用于直接檢測生殖支原體mgpb基因的引物探針組a、用于直接檢測解脲脲原體ureb基因的引物探針組b、用于直接檢測沙眼衣原體ompa基因的引物探針組c，

4、本發(fā)明的引物探針組a選在mgpb基因的保守區(qū)域，即上游引物選在mgpb基因序列第131～151個堿基區(qū)域，探針選在mgpb基因序列上的第155～172個堿基區(qū)域，下游引物選在mgpb基因序列第175～199個堿基區(qū)域，因此，所述引物探針組a包括：

5、引物mg-f：agaartaccttgatgrtcagc，

6、引物mg-r：catataaagctctaccgttgttatc，

7、探針mg-p：actttgcaatcagaaggt；

8、本發(fā)明的引物探針組b選在ureb基因的保守區(qū)域，即上游引物選在ureb基因序列第50～70個堿基區(qū)域，探針選在ureb基因序列上的第104～131個堿基區(qū)域，下游引物是針對ureb基因序列第149～169個堿基區(qū)域設(shè)計的兩條互補(bǔ)的下游引物，因此，所述引物探針組b包括：

9、引物uu-f：cgtgttccgrctaaatcaata，

10、引物uu-r.1：cgaagacaaagaacgtaaagt，

11、引物uu-r.2：tgaagataaagaacgcaaagt，

12、探針uu-p：cgaatagcagtacctgatggaatatcga；

13、本發(fā)明的引物探針組c選在ompa基因的保守區(qū)域，即上游引物選在ompa基因序列第135～153個堿基區(qū)域，探針選在ompa基因序列上的第155～175個堿基區(qū)域，下游引物選在ompa基因序列第199～218個堿基區(qū)域，因此，所述引物探針組c包括：

14、引物ct-f：agatccttgcgatccttgc，

15、引物ct-r：acacggtcgaaaacaaagtc，

16、探針ct-p：ccacttggtgtgacgctatcagcatg。

17、還包括用于監(jiān)測整個檢測流程的內(nèi)標(biāo)引物探針組rp。

18、所述內(nèi)標(biāo)引物探針組rp包括：

19、引物rp-f：agatttggacctgcgagc；

20、引物rp-r：gagcggctgtctccacaagt；

21、探針rp-p：ttctgacctgaaggctctgcgcg。

22、一種生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體聯(lián)合檢測的試劑盒，該試劑盒包括pcr反應(yīng)液以及上述的引物探針組。

23、所述pcr反應(yīng)液包括taq?dna聚合酶、ung酶、da/g/c/utps、鎂離子、氯化鈉和tris緩沖液。

24、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果：

25、（1）本發(fā)明中用于直接檢測生殖支原體mgpb基因的引物探針組a，選在基因保守區(qū)域（131～151aa，155～172aa，175～199aa），盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成且能夠避免與其他病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。

26、（2）本發(fā)明中用于直接檢測解脲脲原體ureb基因的引物探針組b，選在基因保守區(qū)域（50～70aa，104～131aa，149～169aa）并且能夠覆蓋14個血清型，盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成且能夠避免其他病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。

27、（3）本發(fā)明中用于檢測沙眼衣原體ompa基因的引物探針組c，選在基因保守區(qū)域（135～153aa，155～175aa，199～218aa）并且能夠覆蓋生殖沙眼衣原體的所有型別（d、da、e、f、g、h、i、ia、j、ja、k、l1、l2、l2a、l3），盡量避免發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部二聚體、引物間二聚體以及錯配的形成且能夠避免其他病毒或人類基因發(fā)生非特異結(jié)合。

28、（4）本發(fā)明的引物探針組可以直接對樣本中的靶標(biāo)基因進(jìn)行檢測，因此，基于該引物探針組的設(shè)計，可用于女性宮頸拭子/陰道拭子或男性尿道拭子不經(jīng)過核酸提取直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增檢測的方法中。

29、（5）本發(fā)明提供的引物探針組在檢測時，不僅對現(xiàn)有檢測方法進(jìn)行了改進(jìn)，降低檢測成本、縮短試驗時間、簡化操作步驟，還能保證特異性和準(zhǔn)確度的同時提高靈敏度。

30、綜上所述，本發(fā)明針對生殖支原體、解脲脲原體、沙眼衣原體及內(nèi)標(biāo)基因rp分別設(shè)計了特異性的引物和探針，通過實時熒光定量pcr技術(shù)，用于體外定性檢測生殖支原體、解脲脲原體和沙眼衣原體核酸dna。本發(fā)明所述檢測試劑盒樣本無需進(jìn)行核酸提取，大大降低檢測成本、縮短實驗時間的同時仍保證特異性和準(zhǔn)確度的同時提高了靈敏度，在非淋菌性生殖道感染主要病原體檢測、不孕不育和優(yōu)生優(yōu)育的篩查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，對臨床的診斷、疾病的早期治療和預(yù)防及流行等具有重要意義。