本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)檢測(cè)，具體為咪唑乙煙酸的半抗原、完全抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、咪唑乙煙酸，英文名稱為imazethapyr，化學(xué)名為2-[4，5-二氫-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧代-1h-咪唑-2-基]-5-乙基-3-吡啶羧酸，商品名為：咪草煙，cas號(hào)登記號(hào)：81335-77-5，分子式為：c15h19n3o3，相對(duì)分子量為：289.33。

2、隨著人們生活水平和健康意識(shí)的逐步提高，從農(nóng)田到餐桌的食品安全問(wèn)題已成為日常生活關(guān)注的主要焦點(diǎn)之一，食品安全檢測(cè)技術(shù)也因此得到了高度重視。農(nóng)獸藥復(fù)雜多樣、農(nóng)產(chǎn)品種類繁多，研究開(kāi)發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速便捷、準(zhǔn)確穩(wěn)定的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)成為當(dāng)前對(duì)農(nóng)獸殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)方向。而飼草作為畜產(chǎn)品源頭，飼草農(nóng)殘具有相當(dāng)高的隱蔽性。人們?cè)陉P(guān)注食品安全問(wèn)題時(shí)僅關(guān)注肉、蛋、奶等食草家畜和家禽等農(nóng)產(chǎn)品，而通常會(huì)忽略飼草產(chǎn)品的安全問(wèn)題。

3、咪唑乙煙酸是一種高效、低毒的吡唑啉酮類除草劑，該類除草劑活性高、用量低、殺草譜廣、選擇性強(qiáng)且使用方便，在世界除草劑市場(chǎng)中占有重要的地位。主要用于去除農(nóng)作物的惡性雜草。在國(guó)內(nèi)規(guī)?；N植的苜蓿中，咪草煙是應(yīng)用較廣泛的除草劑，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在土壤中不易揮發(fā)和光解，殘效期長(zhǎng)，其在土壤中的殘留對(duì)某些后茬作物及非標(biāo)靶植物等存在藥害問(wèn)題。

4、目前，咪草煙的檢測(cè)以大型儀器方法為主，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，但其提取純化和檢測(cè)流程繁瑣，對(duì)操作人員專業(yè)水平要求高，且費(fèi)用昂貴，不宜在基層監(jiān)管部門普及應(yīng)用。與儀器分析方法相比，免疫分析法具有快速、簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、易于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、適合于高通量分析等優(yōu)點(diǎn)，而且能大幅度降低檢測(cè)成本。

5、但是目前，缺乏針對(duì)咪唑乙煙酸的半抗原和完全抗原以及免疫檢測(cè)數(shù)據(jù)。

6、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供咪唑乙煙酸半抗原、完全抗原制備方法及應(yīng)用，可用于建立咪草煙單克隆抗體建立酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，研發(fā)環(huán)境-苜蓿-畜產(chǎn)品中咪草煙殘留快速檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)環(huán)境-飼草-畜產(chǎn)品全過(guò)程中咪草煙的監(jiān)測(cè)，從農(nóng)畜產(chǎn)品源頭上保障其質(zhì)量安全，保障消費(fèi)者的健康安全；本發(fā)明提供的半抗原能夠方便、快捷地獲得，合成成本低，效果好；且由本發(fā)明完全抗原免疫得到的抗血清效價(jià)好，特異性高，免疫得到的宿主動(dòng)物脾細(xì)胞能夠有效用于雜交瘤細(xì)胞的融合和抗咪唑乙煙酸抗體的制備，具有廣闊的應(yīng)用前景具體如下：

2、一種咪唑乙煙酸的半抗原，所述咪唑乙煙酸的半抗原為：咪唑乙煙酸半抗原a或咪唑乙煙酸半抗原b1或咪唑乙煙酸半抗原b2；

3、所述咪唑乙煙酸半抗原a為：4-((5-乙基-2-(5-異丙基-5-甲基-4-氧代-4，5-二氫-1h-咪唑-2-基)煙酰胺基)甲基)苯甲酸；

4、所述咪唑乙煙酸半抗原a的分子結(jié)構(gòu)為：

5、；

6、所述咪唑乙煙酸半抗原b1為：2，5-二氧代吡咯烷-1-基?2-(5-異丙基-5-甲基-4-氧代-4，5-二氫-1h-咪唑-2-基)-5-甲基煙酸酯；

7、所述咪唑乙煙酸半抗原b1的分子結(jié)構(gòu)為：

8、；

9、所述咪唑乙煙酸半抗原b2為：2，5-二氧代吡咯烷-1-基?4-((5-乙基-2-(5-異丙基-5-甲基-4-氧代-4，5-二氫-1h-咪唑-2-基)煙酰胺基)甲基)苯甲酸酯；

10、所述咪唑乙煙酸半抗原b2的分子結(jié)構(gòu)為：

11、。

12、優(yōu)選地，所述咪唑乙煙酸半抗原a的制備方法如下：

13、s1、稱取2.89?g（10?mmol）a0(咪唑乙煙酸)，1.58?g芐胺鹽酸鹽（11?mmol）、2.88?gedc鹽酸鹽（15?mmol），2.3?g?1-羥基苯并三唑（15?mmol）和2.63?g三乙胺（26?mmol），加入100?ml二氯甲烷，室溫下反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，加水復(fù)溶后提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，采用柱層析進(jìn)行分離純化，獲得2.5?g中間產(chǎn)物a1;

14、s2、取1.0?g中間產(chǎn)物a1，加入10?ml四氫呋喃，攪拌溶解；另取0.2?g氫氧化鈉和10ml水，攪拌溶解；將兩種溶液混合，室溫下反應(yīng)約3小時(shí)；待原料完全轉(zhuǎn)化后，加入稀鹽酸調(diào)節(jié)ph到3-4；分離純化，獲得終產(chǎn)物咪唑乙煙酸半抗原a?0.46?g。

15、優(yōu)選地，所述a0為咪唑乙煙酸；

16、所述a0的分子結(jié)構(gòu)式為：

17、；

18、優(yōu)選地，所述中間產(chǎn)物a1為：甲基4-((5-乙基-2-(5-異丙基-5-甲基-4-氧代-4，5-二氫-1h-咪唑-2-基)煙酰胺基)甲基)苯甲酸酯；

19、所述中間產(chǎn)物a1的分子結(jié)構(gòu)式為：

20、。

21、優(yōu)選地，所述咪唑乙煙酸半抗原b1的制備方法如下：

22、稱取0.0225?mmol?a0、0.045?mmol?n-羥基琥珀酰亞胺（nhs，）和0.045?mmol二環(huán)己基碳二亞胺（dcc），用1?ml無(wú)水n，n-二甲基甲酰胺（dmf）溶解，在室溫25℃攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，將反應(yīng)液在6000?r/min下離心5分鐘，取上清液，得到含咪唑乙煙酸半抗原b1的上清液；

23、所述a0為咪唑乙煙酸；

24、所述a0的分子結(jié)構(gòu)式為：

25、。

26、優(yōu)選地，所述咪唑乙煙酸半抗原b2的制備方法如下：

27、稱取0.0225?mmol?咪唑乙煙酸半抗原a、0.045?mmol?n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）和0.045?mmol?二環(huán)己基碳二亞胺（dcc），用1?ml無(wú)水n，n-二甲基甲酰胺（dmf）溶解，在室溫25℃攪拌反應(yīng)4小時(shí)后，將反應(yīng)液在6000?r/min下離心5分鐘，取上清液備用，得到咪唑乙煙酸半抗原b2。

28、另一方面，本發(fā)明提供一種咪唑乙煙酸的半抗原制備的咪唑乙煙酸完全抗原，所述咪唑乙煙酸完全抗原為咪唑乙煙酸完全抗原c1或咪唑乙煙酸完全抗原c2；

29、所述咪唑乙煙酸完全抗原c1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

30、；

31、所述咪唑乙煙酸完全抗原c2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

32、。

33、優(yōu)選地，所述所述咪唑乙煙酸完全抗原c1的制備方法如下：

34、將乙煙酸半抗原b1加入載體蛋白o(hù)va溶液中，乙煙酸半抗原b1與載體蛋白o(hù)va的投料摩爾比為40:1，在25?℃攪拌，8h后得到反應(yīng)液；

35、將所得反應(yīng)液用ph值為7.4、濃度為0.01?mol/l的pbs溶液透析三天，將透析完全的反應(yīng)產(chǎn)物溶液稀釋為1?mg/ml的溶液，得到咪唑乙煙酸完全抗原c1；即咪唑乙煙酸半抗原（b1）與ova的偶聯(lián)物；

36、所述載體蛋白o(hù)va為卵清白蛋白；

37、所述載體蛋白o(hù)va溶液由20?mg的ova溶于4?ml?ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液（pbs）混勻而得。

38、優(yōu)選地，所述所述咪唑乙煙酸完全抗原c2的制備方法如下：

39、將咪唑乙煙酸半抗原a緩慢滴加入載體蛋白bsa溶液中，咪唑乙煙酸半抗原a與載體蛋白bsa的投料摩爾比為40:1，在25℃攪拌，8h后得到反應(yīng)液；

40、將所得反應(yīng)液用ph值為7.4、濃度為0.01?mol/l的磷酸鹽緩沖液溶液透析三天，將透析完全的反應(yīng)產(chǎn)物溶液稀釋為1?mg/ml的溶液，液氮速凍后，置于-20℃凍存待用，得到咪唑乙煙酸完全抗原c2，即咪唑乙煙酸半抗原a與bsa的偶聯(lián)物;

41、所述載體蛋白bsa為牛血清蛋白；

42、所述載體蛋白bsa溶液由20?mg?載體蛋白bsa溶于5?ml?ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液（pbs）混勻而得。

43、而且，本發(fā)明提供一種咪唑乙煙酸完全抗原的應(yīng)用，用于制備抗體。

44、另一方面，本發(fā)明提供一種制備針對(duì)咪唑乙煙酸的抗體的方法，其包括：將如上任一項(xiàng)所述的完全抗原免疫宿主動(dòng)物，從所述宿主動(dòng)物中分離脾細(xì)胞，與sp2/0瘤細(xì)胞融合，篩選能夠分泌抗咪唑乙煙酸抗體的單克隆細(xì)胞株，用以制備抗咪唑乙煙酸抗體；或提取所述宿主動(dòng)物血液中b淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的mrna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，通過(guò)生物工程技術(shù)構(gòu)建的噬菌體或酵母抗體表達(dá)庫(kù)篩選的抗體。

45、單克隆雜交瘤細(xì)胞株對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容易制備的，例如取經(jīng)上述完全抗原免疫宿主動(dòng)物后獲得脾細(xì)胞，在體外將其與sp2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基篩選能夠分泌抗咪唑乙煙酸抗體的單個(gè)雜交瘤，即可得到雜交瘤細(xì)胞株；也可以通過(guò)基因工程技術(shù)等手段獲得抗咪唑乙煙酸抗體，這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是容易實(shí)現(xiàn)的；基于此，無(wú)論采用何種方法制備抗咪唑乙煙酸抗體，只要其使用了本發(fā)明提供的半抗原或完全抗原即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

46、采用本發(fā)明提供的完全抗原免疫宿主動(dòng)物所制備的抗體或抗血清，能夠與咪唑乙煙酸特異性結(jié)合，具有較好的免疫效果。

47、優(yōu)選地，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述抗體為抗咪唑乙煙酸的血清。

48、在本發(fā)明中公開(kāi)的半抗原或完全抗原基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到采用合適的抗體制備方法制備出抗咪唑乙煙酸的抗體，無(wú)論其采用何種動(dòng)物進(jìn)行免疫，無(wú)論其免疫條件或參數(shù)如何設(shè)置或改變，只要其使用了本發(fā)明所提供的半抗原或完全抗原，即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

49、另一方面，本發(fā)明提供一種針對(duì)咪唑乙煙酸的抗體，其由如上所述的方法制備得到。

50、另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)咪唑乙煙酸的試劑或試劑盒，其含有如上所述的抗體。

51、另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)咪唑乙煙酸的方法，使用如上所述的抗體，或者如上所述的試劑或試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

53、1、本發(fā)明提供咪唑乙煙酸半抗原、完全抗原制備方法及應(yīng)用，可用于建立咪草煙單克隆抗體建立酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，研發(fā)環(huán)境-苜蓿-畜產(chǎn)品中咪草煙殘留快速檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)環(huán)境-飼草-畜產(chǎn)品全過(guò)程中咪草煙的監(jiān)測(cè)，從農(nóng)畜產(chǎn)品源頭上保障其質(zhì)量安全，保障消費(fèi)者的健康安全；本發(fā)明設(shè)計(jì)的半抗原能夠方便、快捷地獲得，合成成本低，效果好；利用該半抗原制備的完全抗原，在免疫過(guò)程中展現(xiàn)出卓越的抗血清效價(jià)與高度的特異性，不僅極大地促進(jìn)了雜交瘤細(xì)胞的融合進(jìn)程，還為抗咪唑乙煙酸抗體的制備開(kāi)辟了新途徑，預(yù)示著其擁有極為廣闊的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)前景。

54、；且由本發(fā)明完全抗原免疫得到的抗血清效價(jià)好，特異性高，免疫得到的宿主動(dòng)物脾細(xì)胞能夠有效用于雜交瘤細(xì)胞的融合和抗咪唑乙煙酸抗體的制備。

55、2、本發(fā)明設(shè)計(jì)合成的半抗原結(jié)構(gòu)及其與載體蛋白的偶聯(lián)技術(shù)制備的完全抗原具有較高的免疫原性和特異性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)咪唑乙煙酸殘留的高靈敏度檢測(cè)。

56、3、本發(fā)明不僅適用于農(nóng)田環(huán)境中的咪唑乙煙酸殘留檢測(cè)，還可應(yīng)用于飼草和畜產(chǎn)品中的殘留監(jiān)測(cè)，從源頭上保障了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全，為消費(fèi)者的健康提供了有力保障。

57、4、與傳統(tǒng)的大型儀器檢測(cè)方法相比，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法更加環(huán)保，減少了有毒有害化學(xué)試劑的使用和廢棄物的排放，符合當(dāng)前綠色、可持續(xù)的發(fā)展理念。

58、5、本發(fā)明提供的咪唑乙煙酸半抗原及完全抗原制備方法，避免了傳統(tǒng)大型儀器檢測(cè)方法的繁瑣步驟和高昂成本，為基層監(jiān)管部門提供了一種高通量、快速篩查的檢測(cè)手段，有助于降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。