本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一種穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體及其構建方法。

背景技術：

1、重組乳酸菌作為一種新型活載體，在疫苗和藥物遞送等領域具有廣泛應用前景。其中，植物乳桿菌( lactobacillus?plantarum)因具有安全性高、定殖能力強等特點，成為構建重組乳酸菌的重要宿主菌株。目前，構建重組乳酸菌主要依賴于穿梭表達載體系統(tǒng)?，F有的乳酸菌表達載體主要存在的問題：(1)缺乏高效的分泌表達系統(tǒng)，導致外源蛋白表達量較低；(2)遺傳穩(wěn)定性不足，連續(xù)傳代培養(yǎng)后容易丟失目的基因；(3)不具備多功能性，難以滿足不同實驗需求。此外，現有載體在構建過程中往往需要多次酶切和連接，操作繁瑣，效率低下。因此，開發(fā)一種穩(wěn)定性好、表達效率高、操作簡便的乳酸菌表達載體系統(tǒng)具有重要意義。這不僅有助于提高重組乳酸菌的構建效率，也為開發(fā)新型的微生態(tài)制劑和疫苗載體提供重要工具。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種新型的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體及其制備方法和應用。該系統(tǒng)具有以下技術特點：構建了包含完整功能模塊的基礎載體，集成了雙宿主復制系統(tǒng)、抗性篩選系統(tǒng)和目的基因表達系統(tǒng)，可實現在大腸桿菌和乳酸菌中的穩(wěn)定復制；基于基礎載體開發(fā)了自連型載體，簡化了克隆步驟，提高了重組效率；通過整合p32啟動子序列構建了組成型載體，實現了外源基因的高效表達；在此基礎上，還可以引入標記系統(tǒng)和驗證系統(tǒng)，便于進行蛋白表達和功能驗證。本發(fā)明采用無縫克隆技術構建載體系統(tǒng)，避免了傳統(tǒng)方法中多次酶切和連接的繁瑣步驟，操作簡便，效率顯著提高。該載體系統(tǒng)可廣泛應用于重組乳酸菌的構建和外源基因的表達，為開發(fā)新型的微生態(tài)制劑和疫苗載體提供了重要工具。具體地，本發(fā)明提供了下述技術方案。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體，其包括復制系統(tǒng)，抗性篩選系統(tǒng)和目的基因表達系統(tǒng)；其中，所述復制系統(tǒng)為乳酸菌-大腸桿菌雙宿主復制系統(tǒng)，包括乳酸菌復制子序列和大腸桿菌復制子序列；所述抗性篩選系統(tǒng)包括篩選標記基因及其調控元件；所述目的基因表達系統(tǒng)包括分泌信號肽序列、克隆位點和終止子序列；其中，所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體選自以下任一種：(1)?包含所述復制系統(tǒng)，抗性篩選系統(tǒng)和目的基因表達系統(tǒng)的基礎載體；(2)?由所述基礎載體自連獲得的自連型載體；和(3)在所述自連型載體基礎上額外整合p32啟動子序列的組成型載體。

3、在本發(fā)明的一些實施方式中本發(fā)明的復制系統(tǒng)為乳酸菌-大腸桿菌雙宿主復制系統(tǒng)，包括：(1)?乳酸菌復制子序列：采用256ori序列，使載體能在乳酸菌中穩(wěn)定復制；和(2)大腸桿菌復制子序列：采用puc-ori序列，保證載體在大腸桿菌中的復制功能。本發(fā)明的抗性篩選系統(tǒng)包括：(1)?篩選標記基因：采用ermb基因，賦予宿主紅霉素抗性；和(2)?調控元件：包含ermb啟動子序列、ermb前導肽序列和ermb終止子序列，調控ermb基因的表達。本發(fā)明的目的基因表達系統(tǒng)包括：(1)?分泌信號肽序列：指導目的蛋白的分泌表達；(2)?克隆位點：設置 ncoi和 bamhi酶切位點，便于目的基因的插入；和(3)?終止子序列：采用cbh終止子序列，確保目的基因轉錄終止。

4、在本發(fā)明的一些實施方式中，前述元件中涉及的序列可以為如下所示的核苷酸序列或為其功能等同物或經過優(yōu)化的變型。其中，所述分泌信號肽的核苷酸序列如seq?idno:?1所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述乳酸菌復制子的核苷酸序列如seq?id?no:?2所示（256ori序列）。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述大腸桿菌復制子的核苷酸序列如seqid?no:?3所示（puc-ori序列）。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ermb基因的核苷酸序列如seq?id?no:?4所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ermb啟動子的核苷酸序列如seq?idno:?5所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ermb前導肽的核苷酸序列如seq?id?no:?6所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述ermb終止子的核苷酸序列如seq?id?no:?7所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cbh終止子的核苷酸序列如seq?id?no:?8所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，當所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體為所述組成型載體時，所述p32啟動子的核苷酸序列如seq?id?no:?9所示。

5、此外，本發(fā)明所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體還可以包含以下至少一種功能模塊：標記系統(tǒng)：比如采用3xflag標簽，便于檢測目的蛋白的表達和定位；和驗證系統(tǒng)：比如包含sp6啟動子和egfp基因，用于驗證載體的功能和表達效率。

6、在本發(fā)明的一些實施方式中，前述功能模塊中涉及的序列可以為如下所示的核苷酸序列或為其功能等同物或經過優(yōu)化的變型。所述3xflag標簽的核苷酸序列如seq?id?no:10所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述sp6啟動子的核苷酸序列如seq?id?no:?11所示。在本發(fā)明的一些實施方式中，egfp基因的核苷酸序列如seq?id?no:?12所示。

7、在本發(fā)明的一些實施方式中，基于上述功能系統(tǒng)，本發(fā)明構建了三種載體：第一種，基礎載體pwcf100-egfp：其包含完整的雙宿主復制系統(tǒng)（puc-ori和256ori）、抗性篩選系統(tǒng)（ermb及其調控元件）和目的基因表達系統(tǒng)（含克隆位點和cbh終止子），同時引入egfp報告基因和3xflag標簽用于表達驗證。第二種，自連型載體pwcf100s-egfp：其在基礎載體的基礎上，通過自連優(yōu)化設計獲得。除保留基礎載體的全部功能元件外，該載體通過結構優(yōu)化提高了在乳酸菌中的復制效率，簡化了克隆操作流程。第三種，組成型載體pwcf101s-egfp：其以自連型載體為基礎，整合了p32啟動子序列，完善了表達調控系統(tǒng)。該載體包含了完整的雙宿主復制系統(tǒng)、抗性篩選系統(tǒng)、目的基因表達系統(tǒng)、標記系統(tǒng)（3xflag標簽）和驗證系統(tǒng)（egfp基因），實現了外源基因的組成型高效表達。經實驗驗證，本發(fā)明構建的載體系統(tǒng)具有結構穩(wěn)定、表達效率高、操作簡便和功能多樣等優(yōu)點，可在宿主菌中穩(wěn)定遺傳并實現外源蛋白的高效分泌表達，克隆步驟經過優(yōu)化，構建效率顯著提高，能夠滿足不同實驗需求。

8、在本發(fā)明的第二方面，提供一種構建上述第一方面中所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體的方法，所述方法包括基礎載體的構建過程，在此基礎上自連構建自連型載體的過程，以及進一步基于自連型載體構建組成型載體的過程。

9、在本發(fā)明的實施方式中，所述構建基礎載體的方法，包括：獲取復制系統(tǒng)的dna片段，其中所述復制系統(tǒng)包括乳酸菌復制子序列和大腸桿菌復制子序列；獲取抗性篩選系統(tǒng)的dna片段，其中包括篩選標記基因及其調控元件；獲取目的基因表達系統(tǒng)的dna片段，其中包括分泌信號肽序列、克隆位點和終止子序列；通過無縫克隆方法將上述dna片段組裝至單一載體中，形成所述基礎載體?？蛇x地，在構建基礎載體時，還包括獲取標記系統(tǒng)的dna片段和/或驗證系統(tǒng)的dna片段，并通過無縫克隆方法引入至所述基礎載體中。

10、在本發(fā)明的實施方式中，所述構建自連型載體的方法，包括：以所述基礎載體為模板進行pcr擴增，獲得含有基礎載體全長序列的dna片段；通過無縫克隆方法將所述含有基礎載體全長序列的dna片段進行自連，獲得所述自連型載體。

11、在本發(fā)明的實施方式中，所述構建組成型載體的方法，包括：以所述自連型載體為模板進行pcr擴增，獲得第一dna片段；獲取含有p32啟動子的第二dna片段；通過無縫克隆方法將所述第一dna片段和第二dna片段組裝至單一載體中，形成所述組成型載體。

12、在本發(fā)明的實施方式中，所述復制系統(tǒng)、抗性篩選系統(tǒng)和目的基因表達系統(tǒng)中各元件的選擇及其序列可如上述第一方面中所述。

13、在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體的構建方法。該方法首先構建基礎載體，需獲取復制系統(tǒng)、抗性篩選系統(tǒng)和目的基因表達系統(tǒng)的dna片段。其中，復制系統(tǒng)包括乳酸菌復制子和大腸桿菌復制子，比如可通過以ppg612和psip403質粒為模板進行pcr擴增獲得；抗性篩選系統(tǒng)包括ermb基因及其啟動子、前導肽和終止子在內的調控元件；目的基因表達系統(tǒng)包括分泌信號肽序列、 ncoi和 bamhi酶切位點以及cbh終止子序列。將上述dna片段通過無縫克隆方法組裝至單一載體中，即可獲得基礎載體pwcf100-egfp。此外，在構建基礎載體時，還可選擇性地引入標記系統(tǒng)的3xflag標簽和/或包含sp6啟動子與egfp基因的驗證系統(tǒng)。

14、在本發(fā)明的一種實施方式中，在獲得基礎載體pwcf100-egfp的基礎上，本發(fā)明進一步構建了自連型載體。具體方法是以基礎載體為模板進行pcr擴增，獲得含有基礎載體全長序列的dna片段，然后通過無縫克隆方法將該dna片段進行自連，獲得自連型載體pwcf100s-egfp。該步驟簡化了克隆過程，提高了構建效率。

15、在本發(fā)明的一種實施方式中，為實現外源基因的組成型表達，本發(fā)明還構建了組成型載體。具體方法是以自連型載體為模板進行pcr擴增獲得第一dna片段，同時獲取含有p32啟動子序列的第二dna片段，將這兩個dna片段通過無縫克隆方法組裝至單一載體中，形成組成型載體pwcf101s-egfp。

16、本發(fā)明采用的無縫克隆技術避免了傳統(tǒng)酶切連接方法的局限性，提高了克隆效率。在實際操作中，pcr反應采用高保真酶進行擴增，反應條件優(yōu)化后可獲得特異性擴增產物。克隆獲得的載體均經過雙酶切和pcr驗證，并通過測序確認序列的正確性。實驗結果表明，通過該方法構建的三種載體均具有良好的穩(wěn)定性和功能性，可滿足不同的實驗需求。

17、在本發(fā)明的第三方面，提供了上述第一方面中所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體在構建重組乳酸菌中的應用。本發(fā)明的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體可有效應用于構建重組乳酸菌。比如，在本發(fā)明的一種實施方式中，將本發(fā)明構建的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體轉化至植物乳桿菌nc8中，經抗生素篩選可獲得穩(wěn)定表達的重組菌株。具體而言，轉化過程包括制備乳酸菌感受態(tài)、電轉化和菌株篩選等步驟。

18、本發(fā)明通過western?blot實驗驗證了重組乳酸菌中的表達情況。結果表明，重組菌株能夠穩(wěn)定表達目的蛋白，比如在一個實施方式中，可穩(wěn)定表達約31.8kda的融合flag標簽的egfp報告蛋白，且蛋白表達量隨培養(yǎng)時間的延長呈現規(guī)律性變化。在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中，重組菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，連續(xù)傳代7代后仍能穩(wěn)定保持egfp基因并維持表達水平。

19、此外，本發(fā)明的載體系統(tǒng)在不同類型的乳酸菌中均具有良好的適用性，可根據實際需要選擇合適的宿主菌株，為構建各類重組乳酸菌提供了重要工具。通過本發(fā)明的載體構建的重組乳酸菌具有遺傳穩(wěn)定性好、表達效率高等特點，可應用于疫苗載體開發(fā)、蛋白質表達和功能研究等領域。

20、在本發(fā)明的第四方面，提供了上述第一方面中所述的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體在表達外源基因中的應用。本發(fā)明的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體可有效應用于外源基因的表達。比如，以egfp報告基因為例，通過western?blot實驗證實，該載體系統(tǒng)可在大腸桿菌top10和植物乳桿菌nc8中實現外源基因的穩(wěn)定表達。比如，在大腸桿菌中，目的蛋白既可在菌體內表達，也可分泌至培養(yǎng)基上清中；在植物乳桿菌nc8中，目的蛋白從培養(yǎng)4h開始即可檢測到表達，并在6h、8h等后續(xù)時間點持續(xù)保持穩(wěn)定表達，表明該系統(tǒng)具有啟動快速、持續(xù)穩(wěn)定的表達特征，充分體現了p32啟動子驅動的表達系統(tǒng)在時效性和穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢。

21、本發(fā)明的載體系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢：首先，通過優(yōu)化的分泌信號肽序列，可實現外源蛋白的高效分泌表達；其次，載體含有3xflag標簽系統(tǒng)，便于檢測和純化目的蛋白；再次，通過p32啟動子的調控，可實現外源基因的組成型表達。這些特點使得該載體系統(tǒng)能夠滿足不同類型外源基因表達的需求。

22、在本發(fā)明的第五方面，提供了含有上述第一方面中所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體的工程菌株。所述工程菌株優(yōu)選為乳酸菌，更優(yōu)選為植物乳桿菌。比如，在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明構建的工程菌株包括轉化有所述穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體的大腸桿菌top10和植物乳桿菌nc8。其中，含有pwcf100-egfp、pwcf100s-egfp或pwcf101s-egfp的大腸桿菌工程菌株可用于載體構建和擴增；含有pwcf101s-egfp的植物乳桿菌工程菌株可用于外源蛋白的表達和功能研究。

23、通過穩(wěn)定性實驗驗證，所構建的工程菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。連續(xù)傳代培養(yǎng)7代后，pcr檢測顯示目的基因片段大小保持不變，western?blot結果證實蛋白表達水平穩(wěn)定。此外，工程菌株的生長特性未受到顯著影響，表明該載體系統(tǒng)對宿主菌株無明顯負面影響。

24、上述
技術實現要素：
充分展示了本發(fā)明提供的穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體的結構特征、構建方法及其應用優(yōu)勢，為開發(fā)新型的微生態(tài)制劑和疫苗載體提供了重要的技術支撐。

25、相較于現有技術，本發(fā)明的有益效果或優(yōu)勢包括：本發(fā)明提供一種穩(wěn)定型乳酸菌分泌表達載體及其構建方法。該載體系統(tǒng)通過兩步優(yōu)化實現：首先將基礎載體（pwcf100-egfp）通過自連優(yōu)化改造為自連型載體（pwcf100s-egfp），增強乳酸菌復制能力；隨后整合p32啟動子和分泌信號肽，優(yōu)化為組成型載體（pwcf101s-egfp），實現雙宿主復制、強啟動子驅動表達和高效分泌等特征。

26、本發(fā)明采用無縫克隆技術和自連策略構建載體，簡化克隆過程，提高構建效率。實驗表明，重組乳酸菌連續(xù)傳代7代后仍能穩(wěn)定保持目的基因表達，western?blot檢測顯示融合flag標簽的egfp報告蛋白表達量穩(wěn)定。在植物乳桿菌nc8中，目的蛋白4h即可檢測到表達，并在后續(xù)時間點保持穩(wěn)定，體現了p32啟動子驅動表達系統(tǒng)的時效性和穩(wěn)定性優(yōu)勢。

27、本發(fā)明載體系統(tǒng)具有雙重復制能力（可在大腸桿菌和乳酸菌中復制），結合完善的篩選標記和多重檢測手段（如3×flag標簽和egfp報告基因），可廣泛應用于疫苗載體開發(fā)、蛋白質表達和功能研究等領域。綜上所述，本發(fā)明在重組乳酸菌構建和外源基因表達領域具有顯著應用價值。