本發(fā)明涉及微生物，特別涉及一種海洋源青霉菌及其發(fā)酵方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、金黃色葡萄球菌（ staphylococcus?aureus）是一種需氧或兼性厭氧革蘭陽(yáng)性球型細(xì)菌，無(wú)芽孢、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，對(duì)不良環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，分布廣泛，于土壤、空氣和水中均可發(fā)現(xiàn)。金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染；金黃色葡萄球菌還是細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，主要污染乳制品、蛋及蛋制品、各類(lèi)熟肉制品，其次是含有乳類(lèi)的冷凍食品等。據(jù)美國(guó)疾病控制中心統(tǒng)計(jì)，目前由金黃色葡萄球菌引起的感染位居第一，是研發(fā)抗菌藥物的主要抗菌對(duì)象。

2、目前國(guó)內(nèi)外金黃色葡萄球菌常規(guī)的防控方法：一，抗生素是治療金黃色葡萄球菌感染的傳統(tǒng)療法，其中β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物(如青霉素等)是最重要且最常用的抗生素。但經(jīng)歷長(zhǎng)期的使用，金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生高度耐藥性。二，噬菌體通過(guò)編碼溶解蛋白-內(nèi)溶酶、溶素等，介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖連接鍵斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、細(xì)菌死亡和新噬菌體的釋放。低劑量噬菌體即可抑制生物膜的形成，高劑量噬菌體能夠降解生物膜，從而殺死病菌。三，中藥能抑制細(xì)菌生物膜的形成。中藥單體丁香酚、槲皮素等通過(guò)抑制細(xì)菌群體的感應(yīng)系統(tǒng)，來(lái)抑制生物膜的形成、毒力因子外分泌和外排泵的表達(dá)。

3、雖然以上方法都能較好地抑制金黃色葡萄球菌，但由于人們?yōu)E用抗生素等藥品，導(dǎo)致了耐藥性金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，對(duì)新的活性生物資源和活性代謝產(chǎn)物的需求不停提高，對(duì)于新藥物的開(kāi)發(fā)需求日益迫切，因此急需不斷挖掘獨(dú)特、新穎的生物防治資源。

4、海洋作為地球最大的生態(tài)系統(tǒng)之一，占地球總面積的71%。從地球科學(xué)的角度來(lái)看，海洋中深度超過(guò)1000m以下的區(qū)域稱(chēng)為深海，其具有高壓、低氧、高鹽、極端溫度等特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外的科研工作者已從該生境獲得一些微生物菌種資源及代謝產(chǎn)物，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了潛在的新的微生物分類(lèi)單元。海洋真菌尤其是深海真菌資源的探索與開(kāi)發(fā)，不僅擴(kuò)大了人們對(duì)海洋真菌多樣性的認(rèn)識(shí)，更為獲得新的代謝產(chǎn)物與新的生物功能活性物質(zhì)提供可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提出一種海洋源青霉菌及其發(fā)酵方法與應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)提出的問(wèn)題。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種海洋源青霉菌，命名為penicillium?sp.?dsf059，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（cctcc），保藏單位地址是湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)，保藏日期：2023年11月23日；保藏編號(hào)：cctcc?no：m?20232310。

4、優(yōu)選地，所述的海洋源青霉菌的its基因序列為seq?id?no.1所示的核苷酸序列，bena基因序列為seq?id?no.2所示的核苷酸序列，cam基因序列為seq?id?no.3所示的核苷酸序列，rpb2基因序列為seq?id?no.4所示的核苷酸序列。

5、優(yōu)選地，一種海洋源青霉菌的發(fā)酵方法包括以下步驟：

6、（1）青霉菌培養(yǎng)和種子液制備：將海洋源青霉菌菌株接種到裝有pda固體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25-30℃的溫度下培養(yǎng)3-8d，使菌株活化，加入無(wú)菌的體積分?jǐn)?shù)為0.03-0.08%的吐溫80將活化好的菌株90-120r/min振蕩培養(yǎng)8-15min，制備成孢子懸浮液作為種子液；

7、（2）發(fā)酵產(chǎn)物：取種子液以2-7%體積比例的接種量接種于大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-30℃和自然光照下進(jìn)行靜置發(fā)酵培養(yǎng)25-35d，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

8、（3）乙酸乙酯發(fā)酵液：將步驟（2）所得到的發(fā)酵產(chǎn)物，用乙酸乙酯浸泡8-15h后，100-150r/min振蕩培養(yǎng)8-20min，抽濾得到濾液，對(duì)濾液進(jìn)行減壓旋蒸，將減壓旋蒸得到的濾液浸膏用體積濃度為70-90%的甲醇萃取60-100min，得到乙酸乙酯發(fā)酵液。

9、優(yōu)選地，一種海洋源青霉菌的發(fā)酵方法包括以下步驟：

10、（1）青霉菌培養(yǎng)和種子液制備：將海洋源青霉菌菌株接種到裝有pda固體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃的溫度下培養(yǎng)5d，使菌株活化，加入無(wú)菌的體積分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫80將活化好的菌株110r/min振蕩培養(yǎng)10min，制備成孢子懸浮液作為種子液；

11、（2）發(fā)酵產(chǎn)物：取種子液以5%體積比例的接種量接種于大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃和自然光照下進(jìn)行靜置發(fā)酵培養(yǎng)30d，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

12、（3）乙酸乙酯發(fā)酵液：將步驟（2）所得到的發(fā)酵產(chǎn)物，用乙酸乙酯浸泡12h后，110r/mi振蕩培養(yǎng)10min，抽濾得到濾液，對(duì)濾液進(jìn)行減壓旋蒸，將減壓旋蒸得到的濾液浸膏用體積濃度為80%的甲醇萃取80min，得到乙酸乙酯發(fā)酵液。

13、優(yōu)選地，步驟（1）所述pda固體培養(yǎng)基每升由以下成分組成：馬鈴薯150-250g，葡萄糖15-40g，瓊脂10-30g，陳海水300-500ml，去離子水余量。pda固體培養(yǎng)基制備好后自然ph5.5-6.5，121℃滅菌15-30min。

14、優(yōu)選地，步驟（1）所述pda固體培養(yǎng)基每升由以下成分組成：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，陳海水400ml，去離子水余量。pda固體培養(yǎng)基制備好后在自然ph下121℃滅菌20min。

15、優(yōu)選地，步驟（1）孢子懸浮液中孢子懸浮的濃度為1.0×106-1.0×1010cfu/ml。

16、優(yōu)選地，步驟（1）孢子懸浮液中孢子懸浮的濃度為1.0×107cfu/ml。

17、優(yōu)選地，步驟（2）所述的大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成：大米8-15g，陳海水5-20ml，蒸餾水8-30ml。各成分混合均勻后，置于120-130℃滅菌25-40min。

18、優(yōu)選地，步驟（2）所述的大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成：大米10g，陳海水8ml，蒸餾水12ml。各成分混合均勻后，置于120-130℃滅菌25-40min。

19、優(yōu)選地，步驟（3）所述減壓旋蒸的參數(shù)為真空度0.02-0.08mpa，溫度30-35℃。

20、優(yōu)選地，所述海洋源青霉菌或所述發(fā)酵方法制備出的乙酸乙酯發(fā)酵液在制備抗金黃色葡萄球菌藥物上的應(yīng)用。

21、優(yōu)選地，步驟（1）所述pda固體培養(yǎng)基也可用以下培養(yǎng)基替代用于青霉菌的培養(yǎng)，涉及的試劑組分和培養(yǎng)基信息如下：

22、查氏母液：硝酸150g，氯化鉀25g，七水硫酸鎂25g，七水硫酸亞鐵0.5g，去離子水定容至500ml；

23、微量元素母液：無(wú)水硫酸銅0.25g，七水硫酸鋅：0.5g，去離子水定容至500ml；

24、cya培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀1g，酵母提取物5g，蔗糖30g，查氏母液10ml，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

25、g25n培養(yǎng)基：查氏母液10ml，磷酸氫二鉀1g，酵母提取物5g，蔗糖30g，甘油250g，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

26、mea培養(yǎng)基：麥芽提取物20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，微量元素母液10ml，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

27、yes培養(yǎng)基：酵母提取物20g，蔗糖150g，七水硫酸鎂0.5g，微量元素母液10ml，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

28、dg18培養(yǎng)基：dichloran-glycerol-agar-base?31.5g，甘油220g，微量元素母液10ml，氯霉素0.05g，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

29、crea培養(yǎng)基：蔗糖30g，肌酸3g，七水磷酸鉀1.6g，七水硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，微量元素母液10ml，溴甲酚紫0.05g，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

30、oa培養(yǎng)基：燕麥30g，微量元素母液10ml，瓊脂20g，陳海水400ml去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph；

31、lba培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15-18g，去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph7.2-7.4；

32、lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，去離子水定容至1l，121℃滅菌20min，自然ph7.2-7.4；

33、優(yōu)選地，步驟（2）所述大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基也可用以下培養(yǎng)基替代用于制備青霉菌的乙酸乙酯發(fā)酵液，涉及的培養(yǎng)基信息如下：

34、燕麥固體發(fā)酵培養(yǎng)基：燕麥10g，蒸餾水12ml，陳海水8ml，置于250ml三角瓶，121℃滅菌30min；

35、土豆固體發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮土豆塊10g，蒸餾水12ml，?陳海水8ml，置于250ml三角瓶，121℃滅菌30min；

36、cheriois固體發(fā)酵培養(yǎng)基：general?mills品牌的multi?grain?cheriois?10g，蒸餾水12ml，陳海水8ml，置于250ml三角瓶，121℃滅菌30min。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明優(yōu)化了海洋源青霉菌penicilliumsp.?dsf059的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，選擇抗菌活性化合物產(chǎn)量較高的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵，可獲得更多的目標(biāo)產(chǎn)物，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，同時(shí)海洋源青霉菌penicilliumsp.?dsf059可為抗金黃色葡萄球菌新藥的開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的菌株，在金黃色葡萄球菌的防治上有較好的應(yīng)用前景。