本發(fā)明涉及亞胺還原酶或其突變體以及在合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物中的應(yīng)用，合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、多并環(huán)手性氮雜環(huán)是指由兩個及以上環(huán)狀結(jié)構(gòu)（包括碳環(huán)和氮雜環(huán)）并合而成，且至少含有一個手性中心的有機(jī)化合物。該類結(jié)構(gòu)易于修飾，廣泛存在于多種生物活性分子中，是多種生物堿及手性藥物合成的關(guān)鍵中間體。目前合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物主要包括手性拆分和不對稱合成兩種化學(xué)方法，其立體選擇性控制是合成過程中的技術(shù)關(guān)鍵。

2、通過對外消旋體進(jìn)行手性拆分是手性化合物合成中應(yīng)用最廣泛的方法之一。該策略通常以適當(dāng)?shù)闹咀寤蚍枷阕寤衔餅樵希?jīng)過一系列化學(xué)反應(yīng)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最后通過特殊的手性拆分試劑獲得手性產(chǎn)物。yan等人（ synth.?commun.2017, 47,?238-244）利用該方法合成氮雜雙環(huán)化合物，以2,3-吡啶二甲酸及其衍生物作為起始原料，通過分子內(nèi)環(huán)化以及催化加氫還原兩步反應(yīng)，在加入酒石酸的條件下進(jìn)行多次化學(xué)拆分，最終得到手性氮雜雙環(huán)。然而通過手性拆分，最多只能獲得一半的目標(biāo)構(gòu)型產(chǎn)物，而另一半異構(gòu)體因為無法轉(zhuǎn)化被浪費，導(dǎo)致原料利用率不佳。并且特殊的手性拆分試劑和設(shè)備成本高昂，分離過程耗時較長，產(chǎn)率和純度難以達(dá)到理想水平。

3、不對稱合成則是通過利用手性催化劑，在合成過程中引入手性中心，主要包括金屬催化以及有機(jī)催化兩種。例如，wang等人利用手性鈀催化劑可以催化烯烴與胺類化合物發(fā)生不對稱加成反應(yīng)，生成手性含氮雜環(huán)化合物（ org.?process?res.?dev.2022, 26,2510-2518）。但是該合成策略需要使用昂貴的金屬催化劑和較為苛刻的反應(yīng)條件，成本較高，應(yīng)用性不強(qiáng)。有機(jī)催化使用手性有機(jī)小分子（如手性膦等）作為催化劑，通過氫鍵等相互作用實現(xiàn)手性誘導(dǎo)和選擇性控制。這種方法避免了金屬催化劑的使用，減少了環(huán)境污染。但目前用于氮雜中環(huán)化合物合成的手性催化劑種類較少,?且價格昂貴，底物普適性不高（ pure?appl.?chem.?2014, 86,?1217-1226）。

4、目前，生物催化合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的方法十分有限。申請?zhí)枺?01410418987.9，發(fā)明名稱：一種3-氨基吡咯烷化合物及其合成方法和用途lin等人報道利用轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑，在氨基供體的作用下，得到氨基取代產(chǎn)物，再發(fā)生不對稱還原胺化反應(yīng)，得到手性氮雜環(huán)化合物。但是由于轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)可逆，通常需要使用過量的氨基供體。且該合成策略的底物范圍較窄，只能催化合成部分五并六元環(huán)氮雜環(huán)化合物。專利zl202311528667.4?和202311439586.7，也公開了以下技術(shù)方案：利用亞胺還原酶合成莫西沙星手性側(cè)鏈( s, s)-2,8-二氮雜雙環(huán)[4,3,0]壬烷，但其催化合成的底物結(jié)構(gòu)有限，普適性不高，限制了其在更廣泛底物范圍內(nèi)的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種亞胺還原酶及其突變體，以解決在合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的工業(yè)化應(yīng)用難題。本發(fā)明還提供了該亞胺還原酶及其突變體的用途。

2、本發(fā)明提供了一種亞胺還原酶突變體，它是以氨基酸序列如seq?id?no.1所示的野生型亞胺還原酶ir-f7為親本，發(fā)生突變得到的突變體，所述突變體為如下之一或具有任一序列中至少90%同一性且具有亞胺還原酶活性的氨基酸序列：

3、將親本第73位蘇氨酸突變?yōu)樘於彼?，得到突變體f7-t73d；

4、將親本第73位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，得到突變體f7-t73a；

5、將親本第125位蛋氨酸突變?yōu)榫彼?，得到突變體f7-m125r；

6、將親本第19位蛋氨酸突變?yōu)榱涟彼幔玫酵蛔凅wf7-m19l；

7、將親本第99位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，得到突變體f7-t99a；

8、將親本第97位亮氨酸突變?yōu)榫彼?，得到突變體f7-l97r；

9、將親本第123位丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，得到突變體f7-a123l；

10、將親本第124位異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，得到突變體f7-i124v；

11、將親本第124位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，得到突變體f7-i124l；

12、將親本第128位脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸，得到突變體f7-p128t；

13、將親本第239位丙氨酸突變?yōu)榫彼?，得到突變體f7-a239r。

14、進(jìn)一步地，它是以f7-i124v為親本，發(fā)生突變得到的突變體，所述突變體為如下序列或具有如下序列至少90%同一性且具有亞胺還原酶活性的氨基酸序列：

15、將親本第128位脯氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔玫酵蛔凅wf7-i124v-p128c。

16、更進(jìn)一步地，它是以f7-i124v-p128c為親本，發(fā)生突變得到的突變體，所述突變體為如下之一或具有任一序列中至少90%同一性且具有亞胺還原酶活性的氨基酸序列：

17、將親本第183位蛋氨酸突變?yōu)楸奖彼?，得到突變體f7-i124v-p128c-m183f；

18、將親本第221位酪氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔玫酵蛔凅wf7-i124v-p128c-y221i；

19、將親本第187位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，得到突變體f7-i124v-p128c-l187f；

20、將親本第240位蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，得到突變體f7-i124v-p128c-t240i；

21、將親本第240位蘇氨酸突變?yōu)榱涟彼?，得到突變體f7-i124v-p128c-t240l；

22、其中，突變體f7-i124v-p128c-t240l的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

23、本發(fā)明提供了一種dna分子，所述dna分子編碼所述的亞胺還原酶突變體。

24、本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有所述的dna分子。

25、本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有所述的表達(dá)載體。

26、本發(fā)明提供了亞胺還原酶ir-f7、所述的亞胺還原酶突變體、亞胺還原酶ir-b8或其突變體、所述dna分子、所述表達(dá)載體、或所述宿主細(xì)胞在合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物中的應(yīng)用；所述的亞胺還原酶ir-b8的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，所述的多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的結(jié)構(gòu)式如式i或式ⅱ所示：

27、

28、其中，n1=0，1，2，3；n2=0，1，2，3；x=ch2，nbn，nbz，nboc；

29、

30、其中，n1=0，1，2，3；n2=0，1，2，3；r1=f，cl，br，i，ch3，ch3o。

31、本發(fā)明提供了一種合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的方法，它是以式?；蚴舰榈孜?，經(jīng)亞胺還原酶ir-f7或所述的亞胺還原酶突變體、亞胺還原酶ir-b8或其突變體為生物催化劑，合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物，其合成路線如通式i或通式ⅱ所示：

32、

33、其中，n1=0，1，2，3；n2=0，1，2，3；x=ch2，nbn，nbz，nboc；

34、

35、其中，n1=0，1，2，3；n2=0，1，2，3；r1=f，cl，br，i，ch3，ch3o。

36、其中，反應(yīng)體系中含有輔酶、葡萄糖和葡萄糖脫氫酶。

37、優(yōu)選地，所述的輔酶為nadp+鹽。

38、現(xiàn)有的合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物中的方法包括化學(xué)法以及生物催化法兩種，化學(xué)法存在合成過程復(fù)雜、原料利用率較差、成本較高、污染環(huán)境等缺點，而生物催化選擇性好，反應(yīng)更加溫和，降低了環(huán)保壓力，但目前的技術(shù)方案，其底物譜不具有廣泛的適用性。

39、亞胺還原酶（ired）是一類nad(p)h依賴的氧化還原酶，它具有催化效率高、區(qū)域及立體選擇性強(qiáng)等特性。利用亞胺還原酶優(yōu)異的選擇性，結(jié)合反應(yīng)中間體的動態(tài)動力學(xué)拆分（dkr），能夠使消旋的底物盡可能多的轉(zhuǎn)化為目標(biāo)構(gòu)型的產(chǎn)物?；诖耍ㄟ^整合亞胺還原酶催化分子內(nèi)的還原胺化與dkr過程，進(jìn)而建立一種合成多并環(huán)手性氮雜化合物的通用且高效的方法。

40、本發(fā)明的有益效果是：

41、本發(fā)明提供的一種亞胺還原酶及其突變體，可催化分子內(nèi)的還原胺化，一步合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)，避免了使用昂貴的手性試劑；通過結(jié)合dkr過程，能夠充分利用原料，不需要額外的氨基供體，獲得較好的收率和選擇性；同時該方法具有更廣的底物適用范圍，在合成多并環(huán)手性氮雜環(huán)化合物的工業(yè)化應(yīng)用上更具潛力。