本發(fā)明屬于生物，涉及植物轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)育種，具體涉及一種調(diào)控糜子香味的 badh2基因、應(yīng)用及方法。

背景技術(shù)：

1、香味是谷物重要的品質(zhì)性狀之一，是谷物蒸煮與食味品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，也是決定市場(chǎng)價(jià)格的關(guān)鍵因素之一。香稻的米香飄溢，入口回香，深受消費(fèi)者的青睞，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。根據(jù)成熟稻米產(chǎn)生香味的不同，可以分為爆米花型、茉莉花型、紫羅蘭型、烤面包型、山核桃型等。其中大部分香稻中以爆米花香為主。目前研究表明使稻米產(chǎn)生爆米花香的主要物質(zhì)是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-ap）。 badh2基因是控制水稻等作物爆米花香味性狀的主效基因，該基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，其功能的喪失會(huì)導(dǎo)致水稻中2-ap的含量增加，產(chǎn)生香味水稻。目前已有較多利用基因編輯技術(shù)敲除 badh2基因來獲得香味水稻、谷子、玉米和高粱的報(bào)道。

2、糜子（ panicum?miliaceum?l.）屬禾本科黍?qū)伲錉I養(yǎng)豐富，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。糜子曾經(jīng)是我國北方重要栽培作物，但隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，逐漸退出主栽作物地位，成為了區(qū)域特色作物，主要原因是糜子產(chǎn)量沒有大的突破，品質(zhì)沒有根本提升。若能改良創(chuàng)制出香味糜子新種質(zhì)，必能提升糜子的食味品質(zhì)，從而提高其附加價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值，對(duì)糜子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

3、目前，尚未發(fā)現(xiàn)由 badh2基因突變產(chǎn)生的香型糜子材料，篩選自然變異及傳統(tǒng)的誘變方法存在不可預(yù)期性、成本高、效率低及篩選工作量大等不足?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展可為糜子提供快速有效的育種途徑，但目前未見有利用基因編輯技術(shù)敲除糜子 badh2基因創(chuàng)制香味糜子的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供的是一種調(diào)控糜子香味的 badh2（甜菜堿醛脫氫酶2，betaine?aldehyde?dehydrogenase?2）基因、應(yīng)用及方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、一種調(diào)控糜子香味的 badh2基因，所述 badh2基因包括 badh2-1基因和 badh2-2基因；

4、 badh2-1基因的序列如seq?id?no：1所示，基因登錄號(hào)為pm13g12800；

5、 badh2-1基因全長(zhǎng)5530?bp，含15個(gè)外顯子，cds編碼區(qū)長(zhǎng)1518?bp，編碼505個(gè)氨基酸，氨基酸序列如seq?id?no：4所示；

6、 badh2-2基因的序列如seq?id?no：2所示，基因登錄號(hào)為pm14g14600；

7、 badh2-2基因全長(zhǎng)5540?bp，含15個(gè)外顯子，cds編碼區(qū)長(zhǎng)1518?bp，編碼505個(gè)氨基酸，氨基酸序列如seq?id?no：5所示；

8、通過突變糜子中的 badh2-1基因和 badh2-2基因，能夠提高糜子中香味物質(zhì)2-ap含量，從而得到香味糜子。

9、一種調(diào)控糜子香味的 badh2基因的應(yīng)用，所述應(yīng)用是通過基因編輯技術(shù)使上述 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性，以提高糜子中香味物質(zhì)2-ap含量。

10、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用是通過基因編輯的方式同時(shí)敲除 badh2-1基因和 badh2-2基因，以提高糜子中香味物質(zhì)2-ap含量；

11、 badh2-1基因和 badh2-2基因中的基因編輯位點(diǎn)相同，序列如seq?id?no：3所示。

12、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用是糜子 badh2基因編輯重組載體或包含 badh2基因編輯重組載體的重組菌株轉(zhuǎn)化入糜子，使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性。

13、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用是利用crispr/cas9基因編輯方法構(gòu)建使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的糜子 badh2基因編輯重組載體，再利用糜子 badh2基因編輯重組載體轉(zhuǎn)化糜子，以使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性。

14、進(jìn)一步的，糜子 badh2基因編輯重組載體選擇sgrna多元載體系統(tǒng)的3個(gè)中間載體pjg310、pjg338和pjg471，以及一個(gè)骨架載體prlg103，最終構(gòu)建成為含有1個(gè)編輯位點(diǎn)的糜子 badh2基因編輯重組載體。

15、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用包括以下步驟：

16、構(gòu)建糜子 badh2基因編輯重組載體；

17、利用糜子 badh2基因編輯重組載體構(gòu)建包含 badh2基因編輯重組載體的重組菌株；所述重組菌株采用農(nóng)桿菌，優(yōu)選農(nóng)桿菌agl1；

18、利用包含 badh2基因編輯重組載體的重組菌株轉(zhuǎn)化糜子，以使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性。

19、進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化糜子是以糜子冀黍5號(hào)的成熟種子作為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷，再利用包含 badh2基因編輯重組載體的重組菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得使 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的轉(zhuǎn)基因糜子株系；

20、進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化的具體步驟如下：

21、1）糜子的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

22、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有ms干粉4.4?g/l、蔗糖30.0?g/l、znso4·7h2o?0.035?g/l、cuso4·5h2o?0.0006?g/l、激動(dòng)素?0.0005?g/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.002?g/l和植物凝膠9.0?g/l，ph值為5.8；

23、選取經(jīng)休眠處理的糜子的干燥成熟種子，去除種皮，用次氯酸鈉溶液和吐溫20溶液，消毒滅菌處理，然后用無菌水清洗后，將種子接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種時(shí)注意種子芽點(diǎn)朝上，芽點(diǎn)不直接接觸培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中先進(jìn)行光照發(fā)芽，發(fā)芽后轉(zhuǎn)為暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)完成后從芽點(diǎn)處挑取誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接于新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)暗培養(yǎng)，得預(yù)培養(yǎng)的糜子胚性愈傷組織；

24、2）農(nóng)桿菌菌液的制備

25、lb培養(yǎng)基中含有蛋白胨10.0?g/l、酵母粉5.0?g/l和nacl?10.0?g/l；

26、糜子侵染液中含有ms干粉2.2?g/l、蔗糖30.0?g/l、嗎啉乙磺酸1.0?g/l、乙酰丁香酮0.04?g/l和質(zhì)量體積比為0.1%的表面活性劑泊洛沙姆，ph值為5.4；

27、取包含糜子 badh2基因編輯重組載體的重組菌株，置于含羧芐青霉素和卡那霉素的lb平板上劃板，暗培養(yǎng)，分離出單菌落；

28、挑取單菌落，同時(shí)置于含羧芐青霉素和卡那霉素的lb培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，所得包含糜子 badh2基因編輯重組載體的重組菌菌液經(jīng)離心，倒去培養(yǎng)液，收集菌體，然后加入糜子侵染液，搖勻，調(diào)整od600值，然后輕搖低速振蕩培養(yǎng)進(jìn)行活化，得活化農(nóng)桿菌菌液；

29、3）侵染和共培養(yǎng)

30、共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含有ms干粉2.2?g/l、蔗糖30.0?g/l、嗎啉乙磺酸1.0?g/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.002?g/l、激動(dòng)素?0.0005?g/l、乙酰丁香酮0.04?g/l和植物凝膠4.0?g/l，ph值為5.4；

31、將糜子的胚性愈傷組織加至活化農(nóng)桿菌菌液中，輕搖振蕩侵染，侵染完成后，倒掉菌液，將經(jīng)侵染的糜子胚性愈傷組織倒在無菌濾紙上，吸干多余的菌液，并在超凈臺(tái)上適當(dāng)吹干，約半小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接到放有無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)，得共培養(yǎng)后的糜子胚性愈傷組織；

32、4）抗性愈傷的篩選

33、愈傷篩選培養(yǎng)基中含有ms干粉4.4?g/l、蔗糖30.0?g/l、znso4·7h2o?0.035?g/l、cuso4·5h2o?0.0006?g/l、激動(dòng)素?0.0005?g/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.002?g/l、植物凝膠9.0g/l、抑制農(nóng)桿菌的抗生素特美汀0.5?g/l和篩選劑潮霉素0.025?g/l，ph值為5.8；

34、將共培養(yǎng)后的糜子胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至愈傷篩選培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)完成一次繼代，轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)完成第二次繼代，得抗性愈傷組織。

35、5）分化和生根

36、第一階段分化培養(yǎng)基中含有ms干粉4.4?g/l、蔗糖30.0?g/l、ms微量元素母液（1000x）1.0?ml/l、ms維生素（1000x）1.0?ml/l、6-芐氨基嘌呤0.003?g/l、激動(dòng)素?0.003?g/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.001?g/l、椰子水5%（v/v）、特美汀0.5?g/l、潮霉素0.015?g/l、稀釋5000倍的軟骨素1.0?ml/l和植物凝膠9.0?g/l，ph值為5.8；

37、第二階段分化培養(yǎng)基中含有ms干粉4.4?g/l、蔗糖20.0?g/l、ms微量元素母液（1000x）1.0?ml/l、ms維生素（1000x）1.0?ml/l、6-芐氨基嘌呤0.001?g/l、激動(dòng)素?0.001?g/l、2,4-二氯苯氧乙酸0.0005?g/l、椰子水5%（v/v）、特美汀0.5?g/l、潮霉素0.015?g/l、稀釋5000倍的軟骨素1.0?ml/l和植物凝膠9.0?g/l，ph值為5.8；

38、生根培養(yǎng)基中含有ms干粉2.2?g/l、蔗糖15.0?g/l、ms微量元素母液（1000x）1.0ml/l、ms維生素（1000x）1.0?ml/l、3-吲哚丁酸0.0005?g/l、特美汀0.5?g/l、潮霉素0.015g/l和植物凝膠9.0?g/l，ph值為5.8；

39、先將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至第一階段分化培養(yǎng)基中，采用光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行光培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接至第二階段分化培養(yǎng)基中，采用光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行光培養(yǎng)，得分化幼苗；

40、將分化幼苗接入生根培養(yǎng)基中，采用光/暗培養(yǎng)方式進(jìn)行生根培養(yǎng)，待生根完成后，得糜子的抗性再生植株；

41、6）抗性再生植株的pcr鑒定

42、將糜子的抗性再生植株用水洗掉培養(yǎng)基，移栽到植物培養(yǎng)箱中利用營養(yǎng)土進(jìn)行栽培，待轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)到約20.0?cm高后，剪取葉片提取dna進(jìn)行pcr檢測(cè)，得轉(zhuǎn)基因糜子株系。

43、一種調(diào)控糜子香味的方法，所述方法是種植 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的轉(zhuǎn)基因糜子株系，以提高糜子中香味物質(zhì)2-ap含量；

44、 badh2-1基因的序列如seq?id?no：1所示；

45、 badh2-2基因的序列如seq?id?no：2所示。

46、進(jìn)一步的，所述 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的轉(zhuǎn)基因糜子是利用基因編輯方法使 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的轉(zhuǎn)基因糜子株系；

47、 badh2-1基因和 badh2-2基因中的基因編輯位點(diǎn)相同，序列如seq?id?no：3所示；

48、具體是，首先構(gòu)建使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因同時(shí)失去活性或降低活性的糜子 badh2基因編輯重組載體，再通過遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入糜子中，使糜子的 badh2-1基因和 badh2-2基因由于堿基突變而同時(shí)失去活性或降低活性，得到轉(zhuǎn)基因糜子株系。

49、本發(fā)明的一種調(diào)控糜子香味的 badh2基因、應(yīng)用及方法的有益效果為：

50、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過突變糜子 badh2基因，使糜子的兩個(gè) badh2基因同時(shí)失活，可以提高糜子葉片中香味物質(zhì)2-ap的含量，為糜子中2-ap的合成與代謝通路研究提供了研究基礎(chǔ)，為開發(fā)香味糜子提供了新的基因資源；

51、本發(fā)明構(gòu)建了糜子 badh2基因編輯載體，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后獲得了糜子 badh2基因突變的轉(zhuǎn)基因糜子株系，其葉片香味物質(zhì)2-ap的含量顯著升高，表明該基因的定向突變能影響糜子葉片中2-ap的含量，在改良糜子香味方面有重要的應(yīng)用價(jià)值；

52、本發(fā)明公開的利用基因編輯技術(shù)使糜子 badh2基因失活的方法為創(chuàng)制富含濃郁香味的糜子新品種提供了新的方法。

53、與野生型糜子相比，本發(fā)明獲得的 badh2基因突變的糜子轉(zhuǎn)基因株系的葉片中2-ap的含量顯著增加，表明糜子的 badh2基因的失去活性或降低活性，可以顯著提高糜子葉片中2-ap的含量；

54、本發(fā)明公開的糜子 bahd2基因在改良糜子香味方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明還為創(chuàng)制香味糜子新品種提供了新的方法，為糜子香味育種進(jìn)程提供一定的理論指導(dǎo)，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。