本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵，具體涉及一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、依克多因(ectoine)是作為一種兩性離子型氨基酸衍生物，屬于極端酶組分。ectoine強烈親水，水分子絡(luò)合能力強，能夠緊密地捕捉并有序結(jié)構(gòu)化周圍的游離水分子，形成獨特的“ectoine-水復合物”。這一復合體宛如一層細膩的、兼具保護、滋養(yǎng)與穩(wěn)定功能的水合殼，緊緊環(huán)繞在細胞、酶、蛋白質(zhì)和其他關(guān)鍵生物分子的周圍，從而維持細胞的滲透壓平衡。其對高溫炙烤、干燥侵襲、射線輻射或嚴寒冷凍等極端環(huán)境條件下的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物活性物質(zhì)起保護作用，抵御外界惡劣條件侵害。因此，依克多因在對抗環(huán)境壓力對皮膚造成的損傷方面展現(xiàn)出顯著效果，促進皮膚損傷的自然修復過程，為肌膚健康筑起一道堅實的防線。目前，依克多因被公認為一種卓越的生物功能穩(wěn)定，同時具有修復、抗皺、美白、抗炎、防紫外線、抗氧化應(yīng)激、長效保濕等顯著皮膚保護功效已在護膚品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。依克多因在化妝品中推薦用量較大(約2％)，彰顯其市場潛力與需求，但造成了該成分在化妝品使用成本較高，限制擴大應(yīng)用。

2、當前依克多因發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域主要使用兩種發(fā)酵工藝：一是利用野生菌株“高鹽誘導合成-低鹽釋放”的“細胞擠奶法”發(fā)酵生產(chǎn)工藝來生產(chǎn)依克多因；但該方法對設(shè)備要求高且工藝復雜難度大且產(chǎn)量低，如中國發(fā)明專利文獻cn117070397a公開了一種培養(yǎng)基及利用其發(fā)酵生產(chǎn)依克多因的方法，使用高濃度的nacl刺激細胞產(chǎn)生依克多因，發(fā)酵周期長、依克多因產(chǎn)量低，限制依克多因工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中的實際應(yīng)用和可行性。另一種工藝是構(gòu)建依克多因工程菌種，優(yōu)化代謝途徑，進行發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化生產(chǎn)依克多因。碳源、氮源、無機鹽、生長因子等是微生物發(fā)酵培養(yǎng)體系的重要成分，微生物發(fā)酵培養(yǎng)體系種類多，成分和配比直接影響菌株的生長速度和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，如中國發(fā)明專利文獻cn115651943a公開了一種小分子氨基酸衍生物依克多因的發(fā)酵制備方法，該方法僅用谷氨酸鈉作為碳源，未進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，且發(fā)酵時間長，產(chǎn)量低。

3、因此，亟待研發(fā)新的依克多因發(fā)酵生產(chǎn)工藝，以期克服現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵依克多因產(chǎn)量較低，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵依克多因產(chǎn)量較低，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高的不足之處，而提供一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵方法及應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括以下組分：

4、葡萄糖5g/l-35g/l，蛋白胨5g/l-30g/l，酵母浸粉5g/l-30g/l，天冬氨酸鈉20mm-250mm，硫酸銨2g/-12g/l，磷酸二氫鉀5g/l-10g/l，磷酸氫二鉀10g/l-18g/l，硫酸鎂0.5g/l-2g/l，一水檸檬酸0.5g/l-2g/l，復合維生素b0.05g/l-0.5g/l。

5、本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基基于大腸桿菌依克多因的代謝特點設(shè)計，采用本發(fā)明所述產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基做發(fā)酵小試得到依克多因試驗組的依克多因平均產(chǎn)量48.36g/l，較基礎(chǔ)培養(yǎng)體系(22.19g/l)分別提高54.12％，直接且顯著地影響著依克多因的產(chǎn)量。

6、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方式，發(fā)酵培養(yǎng)基還包括微量元素；所述微量元素包括以下組分：

7、硫酸錳0.5g/l-2g/l，硫酸亞鐵5g/l-10g/l，氯化鈷0.5g/l-1.5g/l，氯化鋅2g/l-5g/l，鉬酸鈉0.05g/l-0.5g/l，氯化鈣0.5g/l-1.5g/l，2mol/l-8mol/l的hci溶液。

8、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6-7.8。

9、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選實施方式，包括以下組分：

10、葡萄糖20g/l-25g/l，蛋白胨15g/l-21.5g/l，酵母浸粉10g/l-11g/l，天冬氨酸鈉100mm-200mm，硫酸銨2g/-6g/l，磷酸二氫鉀5g/l-7g/l，磷酸氫二鉀10g/l-14g/l，硫酸鎂0.5g/l-1g/l，一水檸檬酸0.5g/l-1.1g/l，復合維生素b0.05g/l-0.1g/l。

11、第二方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵方法，包括以下步驟：

12、(1)將所述產(chǎn)依克多因工程菌株活化、培養(yǎng)，得活化菌液；

13、(2)轉(zhuǎn)接所述活化菌液至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得種子液；

14、(3)取所述種子液接種于上述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。

15、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式，在步驟(3)中：所述轉(zhuǎn)接時的接種量為1％-10％；優(yōu)選的，接種量為6％-10％。

16、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式，在步驟(3)中：所述發(fā)酵的條件為：溫度35℃-40℃，起始轉(zhuǎn)速150rpm-250rpm，起始風量為50l/min-150l/min；ph值控制為6.5-7.5；關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速200rpm-800rpm。

17、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式，在步驟(3)中：所述發(fā)酵的時間為36h-72h。優(yōu)選的，發(fā)酵的時間為52h-68h。

18、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式，在步驟(3)中：所述發(fā)酵時溶氧量≥20％。

19、作為本發(fā)明所述的發(fā)酵方法的進一步優(yōu)選實施方式，所述溶氧量低于70％時開始流加30％-40％濃度的葡萄糖控制發(fā)酵液中殘?zhí)菫?g/l-5g/l，流加15％-25％濃度的蛋白胨0-160ml/h。

20、本發(fā)明的發(fā)酵方法采用同時流加碳源與氮源的雙流加方式補料，發(fā)酵罐水平的依克多因產(chǎn)量顯著提高，尤其是當溶氧低于70％時開始流加40％濃度的葡萄糖全程控制殘?zhí)?g/l并開始恒速流加20％蛋白胨160ml/h，發(fā)酵52h，依克多因產(chǎn)量為176.32g/l。

21、第三方面，本發(fā)明將所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述的發(fā)酵方法在依克多因工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

23、本發(fā)明通過碳源、氮源以及生長因子篩選優(yōu)化依克多因最適發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化發(fā)酵條件，在單因素實驗基礎(chǔ)上，結(jié)合plackett-burman實驗和最陡爬坡實驗，利用響應(yīng)面法進行優(yōu)化發(fā)酵體系。發(fā)酵罐水平上采用雙流加發(fā)酵補料工藝放大發(fā)酵過程提高依克多因產(chǎn)量。本發(fā)明的依克多因工程菌株發(fā)酵過程中不需要添加價格高昂iptg等誘導劑來誘導菌株生產(chǎn)依克多因也避免引入有毒物質(zhì)，通過模型分析避免不必要的營養(yǎng)成分添加，優(yōu)化了發(fā)酵體系，大大降低了生產(chǎn)成本以及采用雙流加發(fā)酵補料工藝為依克多因工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。本發(fā)明為依克多因工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基還包括微量元素；所述微量元素包括以下組分：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值為6-7.8。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：

5.一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于，在步驟(3)中：所述發(fā)酵的條件為：溫度35℃-40℃，起始轉(zhuǎn)速150rpm-250rpm，起始風量為50l/min-150l/min；ph值控制為6.5-7.5；關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)速200rpm-800rpm。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于，在步驟(3)中：所述發(fā)酵的時間為36h-72h。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于，在步驟(3)中：所述發(fā)酵時溶氧量≥20％。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述溶氧量低于70％時開始流加30％-40％濃度的葡萄糖控制發(fā)酵液中殘?zhí)菫?g/l-5g/l，流加15％-25％濃度的蛋白胨0-160ml/h。

10.權(quán)利要求1-4任一項所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，權(quán)利要求5-9任一項所述的發(fā)酵方法在依克多因工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵方法及應(yīng)用。本發(fā)明的產(chǎn)依克多因工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：葡萄糖5g/L?35g/L，蛋白胨5g/L?30g/L，酵母浸粉5g/L?30g/L，天冬氨酸鈉20mM?250mM，硫酸銨2g/?12g/L，磷酸二氫鉀5g/L?10g/L，磷酸氫二鉀10g/L?18g/L，硫酸鎂0.5g/L?2g/L，一水檸檬酸0.5g/L?2g/L，復合維生素B0.05g/L?0.5g/L。本發(fā)明的發(fā)酵方法采用同時流加碳源與氮源的雙流加方式補料，發(fā)酵罐水平的依克多因產(chǎn)量顯著提高，為依克多因工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：李燕,李安章,吳學明,侯森
受保護的技術(shù)使用者：廣州青囊生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6