本發(fā)明屬于分子檢測(cè)，具體為一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、香蕉穿孔線蟲(chóng)(radopholus?similis)又名香蕉爛根病，屬小桿目(rhabditida)、墊刃亞目(tylenchina)、墊刃總科(tylenchoidea)、短體科(pratylenchidae)、穿孔屬(radopholus)，是世界范圍的檢疫性有害生物，已知寄主多達(dá)300多種，嚴(yán)重危害香蕉(musaspp.)、柑橘(citrus?spp.)和胡椒(piper?nigrum)等經(jīng)濟(jì)作物以及天南星科(araeae)和竹芋科(marantaceae)等觀賞植物，目前已報(bào)道有該線蟲(chóng)分布的國(guó)家和地區(qū)超過(guò)90個(gè)。近些年，進(jìn)出口花卉日益頻繁，香蕉穿孔線蟲(chóng)隨寄主植物遠(yuǎn)距離傳播，逐漸成為影響植物產(chǎn)品貿(mào)易的重要病原。因此建立香蕉穿孔線蟲(chóng)的準(zhǔn)確、快速、靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)，顯得越來(lái)越重要。

2、目前為有效防止香蕉穿孔線蟲(chóng)進(jìn)境，通常采用的檢疫、檢測(cè)和鑒定方法包括形態(tài)學(xué)方法、同工酶方法和聚合酶鏈反應(yīng)方法。形態(tài)學(xué)方法要求相關(guān)人員要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，并且由于香蕉穿孔線蟲(chóng)存在種內(nèi)變異，這種方法的檢疫、檢測(cè)和鑒定結(jié)果往往準(zhǔn)確率不高，所需要的時(shí)間與操作人員的經(jīng)驗(yàn)相關(guān)聯(lián)；同工酶方法只能對(duì)雌蟲(chóng)進(jìn)行檢疫、檢測(cè)和鑒定，對(duì)幼蟲(chóng)和雄蟲(chóng)不能進(jìn)行檢疫、檢測(cè)和鑒定，而且所需要的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)一天左右?；趐cr的聚合酶鏈反應(yīng)分子診斷方法可以基本滿足香蕉穿孔線蟲(chóng)的準(zhǔn)確快速檢疫、檢測(cè)和鑒定要求。但普通pcr需要電泳或者測(cè)序，耗時(shí)較長(zhǎng)；qpcr需要復(fù)雜的溫度變化過(guò)程，因此它對(duì)儀器要求較高，阻礙了它的應(yīng)用范圍；而采用雙重pcr引物擴(kuò)增的檢疫、檢測(cè)和鑒定方法，盡管只需要54分鐘，但是增加了一對(duì)引物，相應(yīng)提高了檢疫、檢測(cè)和鑒定的成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的引物探針組合，該引物探針組合能夠快速、特異準(zhǔn)確地鑒定待測(cè)樣本中是否含有香蕉穿孔線蟲(chóng)。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的試劑盒。

3、本發(fā)明的另一目的在于提供一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的方法。

4、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明提供了一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的引物探針組合，所述引物探針組合包括引物對(duì)和rna熒光探針；所述引物對(duì)包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.11所示；所述rna熒光探針的核苷酸序列如seq?id?no.19所示。

6、優(yōu)選地，所述rna熒光探針的5’端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。

7、本發(fā)明還提供了一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的試劑盒，包含所述的引物探針組合。

8、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括基礎(chǔ)干粉、激活液和無(wú)核酶水。

9、本發(fā)明還提供了一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)方法，包括如下步驟：

10、(1)提取待測(cè)樣本的dna；

11、(2)以提取的dna為模板，利用所述的引物探針組合，或所述試劑盒進(jìn)行酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)；

12、(3)根據(jù)檢測(cè)到的熒光曲線的特征和熒光信號(hào)值進(jìn)行結(jié)果分析，判斷樣本中是否存在香蕉穿孔線蟲(chóng)。

13、優(yōu)選地，所述判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：若待測(cè)樣本檢測(cè)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且ct值≤20時(shí)，則判定樣本中存在香蕉穿孔線蟲(chóng)；若待測(cè)樣本沒(méi)有擴(kuò)增曲線或ct值>20，則判定樣本中不存在香蕉穿孔線蟲(chóng)。

14、優(yōu)選地，所述酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?0～45℃條件下，每隔0.5～2min檢測(cè)一次熒光信號(hào)，循環(huán)次數(shù)為20～35個(gè)。

15、優(yōu)選地，所述酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的反應(yīng)體系包括如下組分：基礎(chǔ)干粉、8μm～12μm的上游引物1μl、8μm～12μm下游引物1μl、8μm～12μm的rna熒光探針1μl、模板dna3μl、無(wú)核酶水4μl，8μm～12μm激活液10μl。

16、本發(fā)明還提供了一種所述的引物探針組或所述的試劑盒在檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明還提供了一種所述的引物探針組或所述的試劑盒在制備用于檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

19、emdea(enzymes-mediated?duplex?exponentialamplification)等溫?zé)晒饪鞕z方法是一種酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增快速核酸檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)多酶協(xié)作對(duì)靶標(biāo)核酸及熒光探針進(jìn)行雙重放大，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到極高檢測(cè)靈敏度與特異性。本發(fā)明以香蕉穿孔線蟲(chóng)(radopholussimilis)its序列為靶標(biāo)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用酶介導(dǎo)雙重放大(emdea)核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，定性檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)，相較于傳統(tǒng)的qpcr檢測(cè)，該方案兼具快速、簡(jiǎn)單、便攜等優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)時(shí)間控制在30min之內(nèi)，靈敏度高，抗污染性強(qiáng)，能夠極大降低擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠形成并溢出導(dǎo)致污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明為快速精確地實(shí)現(xiàn)香蕉穿孔線蟲(chóng)的檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括引物對(duì)和rna熒光探針；所述引物對(duì)包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.11所示；所述rna熒光探針的核苷酸序列如seq?id?no.19所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述rna熒光探針的5’端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。

3.一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1或2所述的引物探針組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括基礎(chǔ)干粉、激活液和無(wú)核酶水。

5.一種香蕉穿孔線蟲(chóng)emdea等溫?zé)晒鈾z測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：若待測(cè)樣本檢測(cè)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且ct值≤20時(shí)，則判定樣本中存在香蕉穿孔線蟲(chóng)；若待測(cè)樣本沒(méi)有擴(kuò)增曲線或ct值>20，則判定樣本中不存在香蕉穿孔線蟲(chóng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?0～45℃條件下，每隔0.5～2min檢測(cè)一次熒光信號(hào)，循環(huán)次數(shù)為20～35個(gè)。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶介導(dǎo)雙重指數(shù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的反應(yīng)體系包括如下組分：基礎(chǔ)干粉、8μm～12μm的上游引物1μl、8μm～12μm下游引物1μl、8μm～12μm的rna熒光探針1μl、模板dna3μl、無(wú)核酶水4μl，8μm～12μm激活液10μl。

9.權(quán)利要求1～2任意一項(xiàng)所述的引物探針組或權(quán)利要求3～4任意一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1～2任意一項(xiàng)所述的引物探針組或權(quán)利要求3～4任意一項(xiàng)所述的試劑盒在制備用于檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種香蕉穿孔線蟲(chóng)EmDEA等溫?zé)晒鈾z測(cè)的引物探針組合、試劑盒及其應(yīng)用，涉及分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述EmDEA等溫?zé)晒鈾z測(cè)引物探針組合包括引物對(duì)和RNA熒光探針；所述引物對(duì)包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；所述RNA熒光探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示。本發(fā)明基于所述引物探針組合并采用酶介導(dǎo)雙重放大核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)香蕉穿孔線蟲(chóng)，相較于傳統(tǒng)的qPCR檢測(cè)，具有檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，抗污染性強(qiáng)等特點(diǎn)，為快速精確地實(shí)現(xiàn)香蕉穿孔線蟲(chóng)的檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：趙立榮,徐春玲,武目濤,顧建鋒,楊思華,潘澤堃,于焦,馮黎霞,趙菊鵬,李獻(xiàn)鋒,于璇,邵晨曦,吳堯,李秋實(shí)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州海關(guān)技術(shù)中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6