本發(fā)明涉及基因工程，特別是涉及一種篩選高堿消值水稻的引物組合和方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻是世界上主要糧食作物之一。2023年我國水稻播種面積為289.91萬公頃,稻谷總產(chǎn)量為20660.3萬噸。近年來隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對(duì)稻米品質(zhì)的要求越來越高，其中食味品質(zhì)包括直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度等。

2、高振宇等最早通過圖位克隆發(fā)克隆了alk基因，該基因包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)不同品種間alk基因序列差異及減消法分析結(jié)果，推測(cè)alk基因編碼區(qū)內(nèi)的堿基替換可能引起了支鏈淀粉晶體層結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致了糊化溫度的改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，alk基因第8外顯子的3個(gè)snp(4198a/t、4329g/t、4330c/t)組合差異對(duì)ssⅱa功能和淀粉的糊化特性至關(guān)重要。李闖等分析了云南哈尼梯田收集到的111份水稻材料，發(fā)現(xiàn)g-tt類型以秈稻為主，占75％；a-gc類型以粳稻為主，約占73％。由這3個(gè)snp組成的3種組合類型(a-gc、g-gc和g-tt)中，a-gc和g-tt兩種組合主要控制低(<66℃)和中低(66-70℃)糊化溫度，而g-gc組合則主要控制中高(70-74℃)和高(>74℃)糊化溫度。

3、目前檢測(cè)alk基因大多數(shù)檢測(cè)的是a-gc、g-tt位點(diǎn)，上述位點(diǎn)僅在秈稻中分布頻率較高，而在粳稻中分布頻率較低，現(xiàn)有標(biāo)記對(duì)偏粳型水稻材料檢測(cè)效率較低，在粳稻或秈粳交育種中應(yīng)用難度較大，效率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種篩選高堿消值水稻的引物組合和方法及其應(yīng)用，采用本發(fā)明提供的引物組合能夠篩選高堿消值的水稻，提高育種材料的選擇效率，降低漏檢率。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種篩選高堿消值水稻的引物組合，包括snp位點(diǎn)特異性引物對(duì)和反向引物；

4、所述snp位點(diǎn)特異性引物對(duì)的上游引物和下游引物的核苷酸序列依次如seq?idno.1～2所示；

5、所述反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

6、所述snp位點(diǎn)位于水稻chr.6的6752756處，存在堿基a/g突變，當(dāng)堿基為a時(shí)，水稻為高堿消值水稻，當(dāng)堿基為g時(shí)，水稻為低堿消值水稻；高堿消值水稻的糊化溫度大于74℃，低堿消值水稻的糊化溫度小于66℃，中低糊化溫度為66-70℃，中高糊化溫度為70-74℃，高糊化溫度大于74℃。

7、本發(fā)明還提供了一種篩選高堿消值水稻的方法，包括以下步驟：

8、1)提取水稻基因組dna，以所述基因組dna為模板經(jīng)上述技術(shù)方案所述引物組合擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

9、2)讀取所述步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，再解析轉(zhuǎn)換，得到基因型分型結(jié)果，當(dāng)基因型為aa時(shí)，所述水稻為高堿消值水稻；

10、當(dāng)基因型為gg時(shí)，所述水稻為低堿消值水稻。

11、優(yōu)選的，所述步驟1)擴(kuò)增的體系為：2×parms?mastermix?5μl、濃度為10μm的上游引物0.15μl、濃度為10μm的下游引物0.15μl、濃度為10μm的反向引物0.15μl、基因組dna?10～100ng，ddh2o補(bǔ)足至10μl。

12、優(yōu)選的，所述擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃20min；94℃20s，65～57℃每循環(huán)降低0.8℃1min，10個(gè)循環(huán)；94℃20s，57℃1min，32個(gè)循環(huán)。

13、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的引物組合粳稻育種中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的引物組合在秈粳交水稻育種中的應(yīng)用。

15、有益效果：

16、本發(fā)明通過測(cè)序alk基因序列在chr.6的6752756處(既a-gc和g-gc)設(shè)計(jì)了a-gc、g-gc的分子標(biāo)記alk-2，該標(biāo)記由一對(duì)snp等位特異引物及一條反向引物組成，以區(qū)分該位點(diǎn)的a/g堿基。若該位點(diǎn)堿基為a，則為高堿消值；若為g則為低堿消值。使用原標(biāo)記alk(已發(fā)表的alk分子標(biāo)記，用于檢測(cè)chr.6的6752887(tt/gc)的snp)(alk-ftt(seq?id?no.7)：gaaggtgaccaagttcatgcttacaaggagagctggaggggtt；alk-tgc(seqidno.8)：gaaggtcggagtcaacggatttacaaggagagctggagggggc；alk-r(seq?id?no.9)：ctgaggtcctgcgacatgc)和標(biāo)記alk-2同時(shí)檢測(cè)136份分離世代秈粳交育種材料g-gc、g-tt位點(diǎn)及a-gc、g-gc位點(diǎn)，其中有19份材料g-gc、g-tt位點(diǎn)檢測(cè)為gc，但a-gc、g-gc位點(diǎn)檢測(cè)為aa，其余檢測(cè)結(jié)果一致。說明本發(fā)明提供的分子標(biāo)記alk-2在粳稻或秈粳交水稻育種材料中可作為alk的有效補(bǔ)充，提育種材料的選擇效率，降低了漏檢率。

17、alk基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，具體如下：cagggacacgataaactcttcttcagtctattactacttttagttcagcaatttctccgtttcatattataatttataagtcgttttttttctaatcaaacatctttacgtttgattaactttatcgaaaaatttaacagcatctataacatcaaattagtttaattaaatataatgtttaatgtaatttgattatatgtttgttttgtattggaaatgttattgtatttttctataaactaattaaatttaaaactgtttaacttaaaaaaatatcaaaacaatttacaatatgaaacgggccggggagtactttttttgtgtgctaaatggttcgtgtaatgtttgtagggccgtggcccagtagatgaattcccctacatggaattgccggagcactacctggatcacttcaagctgtacgaccccgtcggcggcgagcacgccaacatcttcggcgcgggcctgaagatggcggaccgggtggtgaccgtgagccccggctacctctgggagctgaagacgacggagggcggctggggcctccacgacatcatacgggagaacgactggaagatgaacggcatcgtgaacggcatcgactaccgggagtggaacccggaggtggacgtgcacctgcagtccgacggctacgccaactacaccgtggcctcgctggactccagcaagccgcggtgcaaggcggcgctgcagcgcgagctggggctggaggtgcgcgacgacgtgccgctgatcgggttcatcgggcggctcgacgggcagaaaggtgtggacatcatcggcgacgcgatgccgtggatcgccgggcaggacgtgcagctggtgctgctgggctccggccgccgcgacctggaggtgatgctgcagcggttcgaggcgcagcacaacagcaaggtgcgcgggtgggtggggttctcggtgaagatggcgcaccggatcacggcgggcgccgacgtgctggtcatgccgtcgcggttcgagccgtgcggcctcaaccagctctacgccatggcgtacggcaccgtccccgtcgtgcacgccgtcggcgggctgagggacaccatgtcggcgttcgacccgttcgaggacaccggcctcgggtggacgttcgaccgcgccgagccgcacaagctcatcgaggcgctcggccactgcctcgagacgtaccgcaagtacaaggagagctggagggggctccaggtgcgcggcatgtcgcaggacctcagctgggaccacgccgccgagctctacgaggaggtccttgtcaaggccaagtaccaatggtgaagagaccatgtccgcccgcggtctccgcctgcgcgttcggcagctatagctatagcctccctgaagaagcttggcgctgctgtggaggtgcgactcggtggcggtgtggcgccggcgccggcgcttgcaggggaggtgtttgtgctgaccgagctgtgcgttgaggtgcgcaaattagcttccggtttgtgtgttcatggcgaggcatggtggagttgagggagtattaagctttgtttcagatgcatcatgcatgcgtaataggatgttgtatttaataatgtgtttgttatgtccattgatgcgatgttacttcttcattagctctcgtgtctgaatggatgtgacttgtgagca。加粗堿基為變異位點(diǎn)。

18、alk基因的擴(kuò)增引物：

19、alk-f(seq?id?no.5)：cagggacacgataaactcttctt；

20、alk-r(seq?id?no.6)：gcatcaatggacataacaaacac。