本發(fā)明涉及酶工程和基因工程，特別涉及一種細(xì)胞色素p450bm3突變體及其在合成2-羥基-1,8-桉葉油素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、1,8-桉葉油素(1,8-cineole)是一類是雙環(huán)單萜化合物,1,8-桉葉油素具有一種樟腦和草藥的特殊香味，常作為香精香料使用。此外1,8-桉葉油素被證明可以參與調(diào)節(jié)nrf2信號通路等藥理活性，可被用于疥螨、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的治療，廣泛應(yīng)用于藥品、食品和化妝品領(lǐng)域。2-羥基-1,8-桉葉油素作為1,8-桉葉油素的主要代謝產(chǎn)物，可以發(fā)展成為一種具有潛在應(yīng)用價值的增值化學(xué)品，用于解決1,8-桉葉油素生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的環(huán)境污染、自然資源浪費等問題。

2、一種可行策略為將已消耗的生物質(zhì)能或廢物通過微生物發(fā)酵方法轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)工業(yè)相關(guān)的原材料或增值化合物，從而達(dá)到還原再生、再利用的生產(chǎn)目的。例如，以提取精油的桉樹葉為基質(zhì)接種平菇等菌類，可以將1,8-桉葉油素轉(zhuǎn)化為兩種新的芳香化合物，2-羥基-1,8-桉葉油素和2-羰基-1,8-桉葉油素。盡管這種廢物利用的策略展現(xiàn)了一定的應(yīng)用前景，但產(chǎn)物的混雜性以及產(chǎn)率低導(dǎo)致的分離難和生產(chǎn)成本問題限制了微生物發(fā)酵法的應(yīng)用場景，如何高選擇性的定向生產(chǎn)2-羥基-1,8-桉葉油素、提高生產(chǎn)效率具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的第一目的是為了解決細(xì)胞色素p450bm3氧化1,8-桉葉油素過程中反應(yīng)區(qū)域選擇性差，產(chǎn)物不單一、催化效率低的問題，通過對細(xì)胞色素p450bm3底物結(jié)合口袋的氨基酸進(jìn)行定向進(jìn)化，實現(xiàn)細(xì)胞色素p450bm3高選擇性氧化1,8-桉葉油素得到成2-羥基-1,8-桉葉油素的細(xì)胞色素p450bm3突變體；本發(fā)明的第二目的為提供所述細(xì)胞色素p450bm3突變體在高選擇性氧化1,8-桉葉油素合成2-羥基-1,8-桉葉油素中的應(yīng)用中的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明所述的細(xì)胞色素p450bm3突變體，所述突變體是將seq?id?no.1所示氨基酸序列第171位、第87位、第307位、第437位這四個位點中至少有一個氨基酸進(jìn)行置換；第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu，第87位苯丙氨酸phe突變?yōu)楸彼醓la，第307位谷氨酰胺gln突變?yōu)榻M氨酸his，第437位亮氨酸leu突變?yōu)槔i氨酸val。

3、所述野生型細(xì)胞色素p450bm3為pdb?id:1fag對應(yīng)的酶，源自bacillusmegaterium，氨基酸序列為seq?id?no.1,基因序列為：seq?id?no.2。

4、優(yōu)選的，所述突變體包括h171l、h171l/f87a、h171l/f87a/q307h或h171l/f87a/q307h/l437v。

5、所述突變體h171l，即第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu。

6、所述突變體h171l/f87a，即第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu，第87位苯丙氨酸phe突變?yōu)楸彼醓la。

7、所述突變體h171l/f87a/q307h，第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu，第87位苯丙氨酸phe突變?yōu)楸彼醓la和第307位谷氨酰胺gln突變?yōu)榻M氨酸his。

8、所述突變體h171l/f87a/q307h/l437v，第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu，第87位苯丙氨酸phe突變?yōu)楸彼醓la，第307位谷氨酰胺gln突變?yōu)榻M氨酸his和第437位亮氨酸leu突變?yōu)槔i氨酸val。

9、本發(fā)明所述細(xì)胞色素p450bm3突變體的編碼基因通過如下方式獲得：以來源于bacillus?megaterium野生型細(xì)胞色素p450bm3基因的重組質(zhì)粒pet22b-p450bm3為模板，利用定點突變引物進(jìn)行pcr擴增，篩選目的突變基因。

10、本發(fā)明所述的基因為：編碼本發(fā)明所述的細(xì)胞色素p450bm3突變體蛋白的基因。

11、本發(fā)明所述的重組質(zhì)為：含有本發(fā)明所述基因的重組質(zhì)粒。

12、優(yōu)選的，所述重組質(zhì)粒的表達(dá)載體為pet系列表達(dá)載體。

13、本發(fā)明所述的種重組菌，攜帶所述突變體的基因或所述重組質(zhì)粒。

14、優(yōu)選的，所述宿主為大腸桿菌。

15、所述重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

16、(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pet22b-p450bm3：將細(xì)胞色素p450bm3基因p450bm3與酶切過的質(zhì)粒pet22b進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體pet22b-細(xì)胞色素p450bm3；

17、(2)構(gòu)建重組菌e.coli?bl21(de3)/pet22b-p450bm3：將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pet22b-p450bm3熱轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)中，培養(yǎng)篩選得到重組e.coli?bl21(de3)/pet22b-p450bm3。

18、本發(fā)明所述的細(xì)胞色素p450bm3突變體或所述重組質(zhì)?；蛩龅闹亟M菌在高選擇性氧化1,8-桉葉油素生成2-羥基-1,8-桉葉油素中的應(yīng)用。

19、所述應(yīng)用包括如下步驟：以細(xì)胞色素p450bm3突變體為催化劑，1,8-桉葉油素為底物，高選擇性催化氧化2號位生成2-羥基-1,8-桉葉油素。催化過程如下所示：

20、

21、優(yōu)選的，所述的催化氧化的反應(yīng)溫度為25～35℃，ph為6～8。

22、發(fā)明機理：經(jīng)過深入廣泛的研究，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞色素p450bm3及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，通過擴增來自bacillus?megaterium的細(xì)胞色素p450bm3基因，并運用理性設(shè)計對其進(jìn)行定向進(jìn)化改造，最終獲得了一種對1,8-桉葉油素氧化區(qū)域選擇性提高的細(xì)胞色素p450bm3突變體，從而實現(xiàn)2-羥基-1,8-桉葉油素的高效合成。

23、在本發(fā)明中，利用已公開報道的細(xì)胞色素p450bm3的序列和結(jié)構(gòu)信息，通過在ncbi等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行非冗余性檢索，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)相似性、保守位點分析和宿主來源多樣性等原則，篩選出一些潛在的酶基因。這些基因經(jīng)過在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的功能表達(dá)，隨后進(jìn)行純化，得到了純凈的酶。優(yōu)選的細(xì)胞色素p450bm3源自bacillus?megaterium，其具備一定的催化活性，能夠催化1,8-桉葉油素的氧化反應(yīng)。

24、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：(1)通過對細(xì)胞色素p450bm3的活性位點進(jìn)行突變，最終獲得的突變體提高了在氧化1,8-桉葉油素為2-羥基-1,8-桉葉油素的生物催化反應(yīng)中的選擇性和催化效率；(2)突變體h171l/f87a/q307h/l437v的催化效率為96％，2-羥基-1,8-桉葉油素的選擇性比例高達(dá)9.3:1。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞色素p450bm3突變體，其特征在于，所述突變體是將seq?id?no.1所示氨基酸序列第171位、第87位、第307位、第437位這四個位點中至少有一個氨基酸進(jìn)行置換；第171位組氨酸his突變?yōu)榱涟彼醠eu，第87位苯丙氨酸phe突變?yōu)楸彼醓la，第307位谷氨酰胺gln突變?yōu)榻M氨酸his，第437位亮氨酸leu突變?yōu)槔i氨酸val。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述細(xì)胞色素p450bm3突變體，其特征在于，所述突變體包括所述突變體包括h171l、h171l/f87a、h171l/f87a/q307h或h171l/f87a/q307h/l437v。

3.一種編碼權(quán)利要求1～2任一項所述細(xì)胞色素p450bm3突變體蛋白的基因。

4.一種含有權(quán)利要求3所述基因的重組質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的表達(dá)載體為pet系列表達(dá)載體。

6.一種攜帶權(quán)利要求3所述突變體的基因或權(quán)利要求4所述重組質(zhì)粒的重組菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組菌，其特征在于，所述宿主為大腸桿菌。

8.一種權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞色素p450bm3突變體或權(quán)利按要求4所述重組質(zhì)?；驒?quán)利要求6所述的重組菌在高選擇性氧化1,8-桉葉油素生成2-羥基-1,8-桉葉油素中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟：以細(xì)胞色素p450bm3突變體為催化劑，1,8-桉葉油素為底物，高選擇性催化氧化2號位生成2-羥基-1,8-桉葉油素。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化氧化的反應(yīng)溫度為25～35℃，ph為6～8。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞色素P450BM<subgt;3</subgt;突變體及其在高選擇性氧化1,8?桉葉油素生成2?羥基?1,8?桉葉油素中的應(yīng)用，所述突變體是將SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列第171位、第87位、第307位、第437位這四個位點中至少有一個氨基酸進(jìn)行置換；第171位組氨酸His突變?yōu)榱涟彼酟eu，第87位苯丙氨酸Phe突變?yōu)楸彼酇la，第307位谷氨酰胺Gln突變?yōu)榻M氨酸His，第437位亮氨酸Leu突變?yōu)槔i氨酸Val；通過對細(xì)胞色素P450BM<subgt;3</subgt;的活性位點進(jìn)行突變，最終獲得了具有高選擇性氧化1,8?桉葉油素生成2?羥基?1,8?桉葉油素的P450BM<subgt;3</subgt;突變體。

技術(shù)研發(fā)人員：任鑫坤,潘文進(jìn),范鑫龍,王子妍,辛思蕊,蔣宛彤,李志恒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6