本發(fā)明涉及化工分離，具體涉及一種從發(fā)酵液中提取α-酮戊二酸的方法。

背景技術(shù)：

1、α-酮戊二酸常溫下是白色細(xì)結(jié)晶性粉末，參與微生物體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝，是重要的二元羧酸，在調(diào)節(jié)碳氮平衡的中間代謝過程中起著至關(guān)重要的作用。在食品健康領(lǐng)域，α-酮戊二酸和l-精氨酸的混合物被稱為精酮合劑，可以作為一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到功能性飲料中；也可以在生物醫(yī)學(xué)中用于組織工程和藥物遞送等。生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法是生產(chǎn)α-酮戊二酸的主要方法，以甘油為原料，該方法制備的產(chǎn)物中還有丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸等雜質(zhì)。α-酮戊二酸與這些雜質(zhì)酸具有相似的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，均具有較好的水溶解性和較大的極性，從發(fā)酵液中分離α-酮戊二酸具有較大難度。

2、現(xiàn)有從發(fā)酵液中分離α-酮戊二酸的方法較少，主要包括鈣鹽沉淀法、膜分離法、結(jié)晶法。

3、鈣鹽沉淀法是基于大部分羧酸的鈣鹽在水中溶解度較小，在一定的溫度和ph值下，將發(fā)酵液中的α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成鈣鹽沉淀從而分離出來。專利cn105198732a公開了一種利用鈣鹽從發(fā)酵液中分離α-酮戊二酸的方法：發(fā)酵液中加入過量氫氧化鈣，離心分離出α-酮戊二酸鈣和氫氧化鈣，加入硫酸酸化得到α-酮戊二酸溶液，經(jīng)過減壓濃縮得到α-酮戊二酸粗品，再經(jīng)甲醇洗滌得到α-酮戊二酸。該工藝未考慮到發(fā)酵液中的雜質(zhì)酸同樣也會(huì)形成鈣鹽沉淀，造成后續(xù)與α-酮戊二酸鈣的分離困難。和prochaska[biochemical?engineering?journal,2021,166:107883]設(shè)計(jì)了一種多級(jí)膜工藝，輔以真空蒸發(fā)和結(jié)晶，從發(fā)酵液中回收α-酮戊二酸。對(duì)預(yù)處理后的發(fā)酵液用商業(yè)陶瓷膜和納濾陶瓷膜電滲析分離α-酮戊二酸鹽并轉(zhuǎn)化為酸形式，發(fā)酵液中其他酸的遷移受到限制，最終產(chǎn)品純度為94.8％，但該膜價(jià)格昂貴且容易被污染。結(jié)晶法一般作為處理的一個(gè)步驟，在萃取或預(yù)處理的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)。

4、綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中提取α-酮戊二酸的方法存在工藝繁瑣、成本高、分離選擇性較差的問題，需要開發(fā)出一種可以高效地從發(fā)酵液中提取α-酮戊二酸的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種從發(fā)酵液中提取α-酮戊二酸的方法。本發(fā)明采用的方法流程簡單，成本低，使用的萃取劑具有良好的穩(wěn)定性和更高的分離選擇性，多級(jí)分餾萃取過程安全、易放大，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

2、本發(fā)明提供一種從發(fā)酵液中提取α-酮戊二酸的方法，包括如下步驟：將預(yù)處理后的發(fā)酵液進(jìn)行多級(jí)分餾萃取；其中，所述多級(jí)分餾萃取的萃取劑包括具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑。

3、α-酮戊二酸是一種含有羰基的二羧酸，其pka1值為2.47，酸性和氫鍵酸性均較強(qiáng)，兩個(gè)羧基氫均可以作為氫鍵供體。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)采用具有一定氫鍵堿性的萃取劑，通過溶質(zhì)分子與萃取劑形成氫鍵作用力，可以選擇性地將發(fā)酵液中的α-酮戊二酸萃取分離出來。進(jìn)一步地，本發(fā)明發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后萃取分離α-酮戊二酸的效率更高。

4、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵液來源為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸和丙酮酸的發(fā)酵液。

5、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵液以解脂亞羅酵母為原料生產(chǎn)α-酮戊二酸和丙酮酸的發(fā)酵液。

6、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵液包括α-酮戊二酸和丙酮酸。

7、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵液中α-酮戊二酸的濃度為0.5g/l-200g/l，例如為1g/l、2g/l、5g/l、8g/l、10g/l、12g/l、14g/l、16g/l、18g/l、20g/l、30g/l、50g/l、80g/l、110g/l、150g/l、190g/l或它們之間的任意值。

8、在一些實(shí)施方式中，所述發(fā)酵液中α-酮戊二酸的濃度為5g/l-20g/l。

9、在一些實(shí)施方式中，所述具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑包括醇類溶劑、酯類溶劑、醚類溶劑、酰胺類溶劑或有機(jī)磷類溶劑中的至少一種。本發(fā)明選擇上述具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑作為萃取劑，具有較高的分離選擇性。

10、在一些實(shí)施方式中，所述醇類溶劑包括c1-c10直鏈或支鏈烷基取代的醇類溶劑；優(yōu)選為正丁醇、正辛醇或2-乙基-1-己醇中的一種或多種。

11、在一些實(shí)施方式中，所述酯類溶劑包括碳數(shù)大于6的酯類化合物，優(yōu)選為乙酸戊酯、丁酸丁酯、戊酸丁酯中的一種或多種。

12、在一些實(shí)施方式中，所述醚類溶劑包括甲基叔丁基醚。

13、在一些實(shí)施方式中，所述酰胺類溶劑包括n,n-二正丁基甲酰胺、n,n-二正丁基乙酰胺、n,n-二正丁基丁酰胺中的一種或多種。

14、在一些實(shí)施方式中，所述有機(jī)磷類溶劑包括烷基磷酸酯和/或烷基氧化膦。

15、在一些實(shí)施方式中，所述烷基磷酸酯和所述烷基氧化膦中的烷基選自取代或未取代的c3-c8直鏈或支鏈烷基。

16、在一些實(shí)施方式中，上述c3-c8直鏈或支鏈烷基中的至少一個(gè)氫原子被羧基、氨基、羰基、烯烴基、羥基、鹵代原子、磺酰基和氰基中的至少一種取代。取代可以為單取代、二取代、三取代或多取代，多取代時(shí)取代基在不同位點(diǎn)上的種類和數(shù)量可以相同也可以不同。

17、在一些實(shí)施方式中，所述有機(jī)磷類溶劑選自磷酸三丁酯、磷酸三辛酯、三正辛基氧化膦、三(2-乙基己基)氧化膦和三環(huán)己基氧化膦中的一種或多種。

18、在一些實(shí)施方式中，所述具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑選自乙酸戊酯、丁酸丁酯、戊酸丁酯、n,n-二丁基甲酰胺、n,n-二丁基乙酰胺、n,n-二正丁基丁酰胺、正己醇、正辛醇、2-乙基-1-己醇、磷酸三丁酯、磷酸三辛酯、三正辛基氧化膦、二(乙基己基)磷酸酯、三(2-乙基己基)氧化膦、三環(huán)己基氧化膦或三辛基氧化膦和二(乙基己基)磷酸酯的混合物中的一種或多種。

19、在一些實(shí)施方式中，所述具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑選自丁酸丁酯、戊酸丁酯、n,n-二丁基甲酰胺、磷酸三丁酯、三正辛基氧化膦、二(乙基己基)磷酸酯、三環(huán)己基氧化膦或三辛基氧化膦和二(乙基己基)磷酸酯的混合物中的一種或多種。

20、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑還包括可選的稀釋劑。上述含氧有機(jī)溶劑可以單獨(dú)使用，也可以在稀釋劑中使用。

21、在一些實(shí)施方式中，所述稀釋劑包括烷烴類有機(jī)溶劑、芳香烴類有機(jī)溶劑、鹵代烴類有機(jī)溶劑、醇類有機(jī)溶劑、酮類有機(jī)溶劑、醚類有機(jī)溶劑和酯類有機(jī)溶劑中的一種或多種。

22、在一些實(shí)施方式中，所述稀釋劑包括石油醚、正己烷、正十二烷、甲苯、鄰二甲苯、二氯甲烷、氯仿、煤油、正丁醇、正己醇、正辛醇、甲基異丁基酮、甲基叔丁基醚、異丙醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯的至少一種，優(yōu)選為正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、二氯甲烷、正己醇、甲基異丁基酮、甲基叔丁基醚和異丙醚中的一種或多種。

23、在一些實(shí)施方式中，所述稀釋劑為正丁醇和/或乙酸乙酯。

24、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑包括具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑和稀釋劑。

25、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑選自三辛基氧化膦和正丁醇、三環(huán)己基氧化膦和乙酸乙酯、n，n-二正丁基甲酰胺和乙酸乙酯。

26、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑中，所述含氧有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％-99.99％，例如0.1％、1％、5％、7％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、23％、26％、29％、33％、36％、39％、40％、45％、50％、70％、80％、99.9％或它們之間的任意值。

27、在一些實(shí)施方式中，所述含氧有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％-50％。

28、在一些實(shí)施方式中，所述含氧有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％-50％。

29、在一些實(shí)施方式中，所述含氧有機(jī)溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％-40％。

30、在一些實(shí)施方式中，所述多級(jí)分餾萃取還包括洗滌劑。

31、在一些實(shí)施方式中，所述洗滌劑為水。

32、在進(jìn)行多級(jí)萃取時(shí)，綜合考慮產(chǎn)品質(zhì)量、生產(chǎn)成本等因素，所述萃取劑、洗滌劑和預(yù)處理后的發(fā)酵液的體積流量之比為1:(0.1-20):(0.1-20)，例如為1:1:(0.2-8)、1:3:(0.2-8)、1:5:(0.2-8)、1:9:(0.2-8)、1:13:(0.2-8)、1:17:(0.2-8)、1:(0.2-8):1、1:(0.2-8):3、1:(0.2-8):5、1:(0.2-8):9、1:(0.2-8):6、1:(0.2-8):7、1:(0.2-8):8或它們之間的任意值。

33、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑、洗滌劑和預(yù)處理后的發(fā)酵液的體積流量之比為1:(0.1-10):(0.1-10)。

34、在一些實(shí)施方式中，所述萃取劑、洗滌劑和預(yù)處理后的發(fā)酵液的體積流量之比為1:(0.2-8):(0.2-8)。

35、在一些實(shí)施方式中，所述多級(jí)分餾萃取的操作溫度為15℃–60℃，例如為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或它們之間的任意值。如果溫度過低，萃取劑的粘度會(huì)較大，傳質(zhì)速率降低，處理量下降，不利于生產(chǎn)操作；如果溫度過高，一方面稀釋劑或溶劑揮發(fā)速率變快，另一方面會(huì)降低α-酮戊二酸分配系數(shù)和選擇性。

36、在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)處理包括：除去發(fā)酵液中不溶性雜質(zhì)和大分子雜質(zhì)、脫色和脫鹽處理。

37、在一些實(shí)施方式中，所述大分子雜質(zhì)的分子量大于1000da。所述大分子雜質(zhì)可以是菌體碎片、脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)等生物大分子。

38、在一些實(shí)施方式中，除去發(fā)酵液中不溶性雜質(zhì)和大分子雜質(zhì)的方法包括離心分離、超濾、微濾和板框過濾中的一種或多種。

39、在一些實(shí)施方式中，除去發(fā)酵液中不溶性雜質(zhì)和大分子雜質(zhì)的方法包括：

40、(1)將發(fā)酵液離心，收集上清液；

41、(2)將所述上清液進(jìn)行第一過濾，得到第一濾液；

42、(3)將所述第一濾液進(jìn)行第二過濾，得到第二濾液；

43、離心和過濾過程安全環(huán)保，能去除大部分大分子雜質(zhì)。

44、在一些實(shí)施方式中，所述第一過濾采用陶瓷膜。

45、在一些實(shí)施方式中，所述陶瓷膜組件為pvdf中空纖維膜的外壓式結(jié)構(gòu)膜組件，能截留分子量大于1000da的雜質(zhì)。

46、在一些實(shí)施方式中，所述第一過濾的操作壓力為0.1mpa–0.5mpa；例如為0.15mpa、0.2mpa、0.25mpa、0.3mpa、0.35mpa、0.4mpa、0.45mpa、0.5mpa或它們之間的任意值。

47、在一些實(shí)施方式中，所述陶瓷膜的孔徑為0.1-1μm，例如為0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或它們之間的任意值。

48、在一些實(shí)施方式中，所述第二過濾采用超濾膜。

49、在一些實(shí)施方式中，所述超濾膜為以聚偏氟乙烯為原料制成的中空纖維膜。

50、在一些實(shí)施方式中，所述第二過濾的操作壓力為0.1mpa–0.7mpa；例如為0.15mpa、0.2mpa、0.25mpa、0.3mpa、0.35mpa、0.4mpa、0.45mpa、0.5mpa、0.55mpa、0.6mpa、0.65mpa或它們之間的任意值。

51、在一些實(shí)施方式中，所述超濾膜的孔徑為0.01-0.1μm，例如為0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm或它們之間的任意值。

52、在一些實(shí)施方式中，所述脫色的方法包括吸附層析柱法。

53、在一些實(shí)施方式中，所述脫色采用大孔吸附樹脂和/或脫色活性炭。

54、在一些實(shí)施方式中，所述大孔吸附樹脂選自hpd-750、hpd-722、ab-8、ads-7、sd200、sd300、sd331、sd333、lsa-210、lsa-220、lsa-230、amberlite?xad-4、amberlitexad-16和amberlite?xad-18中的一種或多種。

55、在一些實(shí)施方式中，所述大孔吸附樹脂選自hpd-750、ab-8、ads-7、sd300、amberlite?xad-4、amberlite?xad-16和amberlite?xad-18中的一種或多種。

56、上述大孔吸附樹脂脫色容量大、易再生。

57、在一些實(shí)施方式中，所述脫鹽的方法包括離子交換層析柱法。

58、在一些實(shí)施方式中，所述脫鹽采用陽離子交換樹脂。

59、脫色和脫鹽所用柱層析法簡單易行，循環(huán)性能好。

60、在一些實(shí)施方式中，所述陽離子交換樹脂選自所述陽離子交換樹脂選自zgcer50、zg?er?8420、zg?er?8410、d851、amberlite?hpr1200?h、amberlite?hpr?2900h、amberlite?irc?120h、001×7、001×8、d001、lx-160、lsi-010中的一種或多種。

61、在一些實(shí)施方式中，所述陽離子交換樹脂選自所述陽離子交換樹脂選zg?cer50、amberlite?ir?120h、fpc?22h、hpr?2900h、001×7和001×8。

62、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括后處理。

63、在一些實(shí)施方式中，所述后處理的方法包括：減壓蒸餾后結(jié)晶，或者反萃酸化后結(jié)晶。

64、在一些實(shí)施方式中，根據(jù)所用萃取劑不同，α-酮戊二酸在萃取相或萃余相富集。若α-酮戊二酸在萃取相富集，萃取劑為低沸點(diǎn)含氧有機(jī)溶劑時(shí)，低沸點(diǎn)含氧有機(jī)溶劑通過減壓蒸餾回收溶劑和溶質(zhì)，萃取劑為有機(jī)磷類溶劑或沸點(diǎn)高于100℃的含氧有機(jī)溶劑時(shí)，則利用堿液反萃、酸化、結(jié)晶和真空干燥得到高純?chǔ)?酮戊二酸產(chǎn)品；若α-酮戊二酸在萃余相富集，則通過減壓濃縮萃余液后結(jié)晶得到α-酮戊二酸產(chǎn)品。

65、在一些實(shí)施方式中，所述低沸點(diǎn)含氧有機(jī)溶劑為沸點(diǎn)低于100℃的溶劑。

66、在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)晶為冷卻結(jié)晶。

67、在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)晶溫度為4℃-20℃，例如為5℃、8℃、11℃、14℃、17℃、20℃或它們之間的任意值。

68、在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)晶時(shí)間為8-24h，例如為9h、12h、15h、18h、21h、24h或它們之間的任意值。

69、在一些實(shí)施方式中，所述減壓蒸餾溫度為30℃–60℃，例如為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或它們之間的任意值。

70、在一些實(shí)施方式中，減壓蒸餾壓力為-100–100kpa(絕對(duì)壓力)；例如為-100kpa、-50kpa、0kpa、50kpa、100kpa或它們之間的任意值。

71、所述分餾萃取包括萃取段和洗滌段。萃取劑從萃取段第一級(jí)進(jìn)入系統(tǒng)，確定萃取段和洗滌段級(jí)數(shù)后，原料液從進(jìn)料級(jí)進(jìn)入體系，洗滌劑和原料液在進(jìn)料級(jí)混合，萃取相和洗滌相進(jìn)行多級(jí)逆流接觸，從洗滌段的第一級(jí)流出萃取液，從萃取段的第一級(jí)流出萃余液。

72、在一些實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：

73、(1)預(yù)處理：以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的發(fā)酵液為原料液，經(jīng)離心和過濾處理后，再進(jìn)行樹脂脫色、脫鹽處理；

74、(2)分餾萃取：以含氧有機(jī)溶劑與可選的稀釋劑為萃取劑，水為洗滌劑進(jìn)行多級(jí)逆流接觸的分餾萃?。?/p>

75、(3)α-酮戊二酸產(chǎn)品的獲取：分餾萃取后通過反萃或直接蒸干溶劑收集α-酮戊二酸。

76、在一些實(shí)施方式中，從發(fā)酵液中提取的α-酮戊二酸含量(hplc)≥98wt％，收率≥90％。

77、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

78、1.本發(fā)明采用的預(yù)處理方法安全環(huán)保，工藝簡單，能耗低，在脫色和脫鹽過程中所用樹脂成本低，易再生，可循環(huán)使用；

79、2.本發(fā)明的多級(jí)分餾萃取過程安全、易放大、有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；

80、3.本發(fā)明使用的具有氫鍵堿性的含氧有機(jī)溶劑對(duì)α-酮戊二酸具有較高分離選擇性、較低的水溶性和毒性，經(jīng)減壓蒸餾或強(qiáng)堿反萃后萃取劑可回收并循環(huán)使用；

81、4.本發(fā)明所采用的多級(jí)分餾萃取工藝能兼顧產(chǎn)品純度和收率，采用優(yōu)化的條件，α-酮戊二酸產(chǎn)品的純度達(dá)到98wt％以上，回收率大于90％。